抑制凋亡抑制剂c-FLIP选择性地消除乳腺癌干细胞对抗癌药物TRAIL的反应

细胞培养

四株人乳腺癌细胞系BT474^ER+HER2+，SKBR3^ER-HER2型+，MCF-7^ER+HER2-，MDA-MB-231^ER-HER2型-; 小鼠乳腺肿瘤细胞系N202.1A（来自意大利博洛尼亚Sezione di Cancerologia的P-L Lollini）；非肿瘤细胞系人类MCF10A（来自英国格拉斯哥大学T.Stein）和小鼠EPH4（来自英国剑桥大学C.Watson）保存在DMEM（MDA-MB-231，EPH4）或RPMI 1640培养基（SKBR3，MCF-7和BT-474）中，补充10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和0.5%L-谷氨酰胺，37°C，5%CO₂单层MCF10A细胞在DMEM/F12、5%马血清、20 ng/ml EGF、0.5 mg/ml氢化可的松、100 ng/ml霍乱毒素、10μg/ml胰岛素中培养。

小干扰RNA

针对人类c-FLIP中两个独特序列的小干扰RNA（siRNA）（FLIPi-Sense:GGAUAAUCUGAUGUCUCCAUUA，反义：UAAUGAGGACAUCAUUAUCC）和非特异性加扰控制（SCi-Sense:GGACAUAAGUUGUCCAAUUA，抗义：UAAAUGGAGCACAAUAUAGUCUCAUCC）RNA用于反向转染（英国佩斯利Invitrogen Life Technologies Ltd）。对细胞进行胰蛋白酶处理并以1×10的密度重新悬浮⁵细胞/ml，接种到含有20μl 100 nM siRNA的无血清Optimem（Invitrogen Life Technologies Ltd，Paisley，UK）的微孔中，每孔体积为100μl，以及0.3μl Lipofectamine（Invit罗gen LifeTechnologies有限公司）。在随后的分析之前，细胞在siRNA存在下培养48小时（MCF-7、MCF10A、EPH4、N202.1A和MDA-MB-231）或72小时（SKBR3和BT474）。

靶细胞的TRAIL治疗

用浓度为20 ng/ml的可溶性人重组TRAIL（SuperKillerTRAIL，Enzo Life Sciences，Exeter，UK）在37°C、5%CO中处理细胞18小时₂对于小鼠靶细胞，以100 ng/ml的浓度添加可溶性小鼠重组TRAIL（Enzo Life Sciences）18小时。

蛋白质印迹分析

使用以下抗体进行细胞裂解物的蛋白质印迹：cFLIP（Enzo Life Sciences，NP6，ALX-8040428）、ERα（Santa Cruz Biotechnology，Santa Crux，CA，USA，sc-7207）、ErbB2（Abcam，Cambridge，UK，ab2428）、Tubulin（Abcam，ab6160）。

体外caspase抑制

通过与siRNA和caspase抑制剂IETD（1μM）、LEHD（10μM）和AEVD（10µM）（英国牛津阿宾顿研发系统公司）共同培养细胞，分别抑制caspase 8、9和10，来评估caspase的功能阻断。共同培养48至72小时后，使用Annexin-V APC凋亡分析（英国哈特菲尔德eBioscience有限公司）对细胞进行分析。

细胞活力和细胞死亡分析

在异型细胞培养分析中：用0.25%胰蛋白酶处理siRNA处理的细胞10分钟，用PKH67或PKH26清洗并染色（英国多塞特郡吉林厄姆Sigma-Aldrich）。PKH67+ve FLIPi细胞和PKH26+ve SCi细胞以1:1的比例混合，并与TRAIL或不与TRAIL一起培养过夜，随后再悬浮在4μl 1:10的固定近红外活/死染色剂（Invitrogen）中，并在4°C下培养15分钟。然后使用FACS Canto（Becton Dickinson，Oxford，UK）对细胞进行PKH染色与活/死染色的门控。有关详细协议，请参阅补充数据。在同型细胞培养分析中：根据制造商的说明进行CellTiter蓝细胞活力测定（Promega UK Ltd，Southampton，UK）和Caspase-Glo测定（Promega），并使用FluoStar Optima平板读取器评估荧光/吸光度/发光，同时通过FACS Canto分析膜联蛋白-V APC标记的细胞（eBioscience）。

小鼠乳腺组织学及原代培养

所有程序均按照1986年《动物（科学程序）法案》执行，并经英国内政部批准。c-FLIP公司^{飞行/飞行}老鼠[42]与blg-Cre动物杂交[43]有条件地从乳腺上皮中删除c-FLIP。12周龄和14天妊娠期blg-Cre/c-FLIP的乳腺组织^{飞行/飞行}雌性和blg-Cre/c-FLIP^+/+将同窝鼠的对照物收集起来，放置在4%多聚甲醛/PBS（pH 7.4）中过夜，并包埋在石蜡中。将石蜡切片（5μm）置于载玻片上，脱蜡并用H&E染色。对于原代细胞培养，处死中期妊娠动物，切除腹部乳腺并用70%乙醇清洗。切除淋巴结，然后按说明处理切碎的组织[44]. 原代细胞保持在5%的CO中₂，5%O₂37°C时。

哺乳动物文化

将细胞系分离成单细胞悬浮液，并在无血清上皮生长培养基（MEBM，Lonza Walkersville，MD，USA）中以20000个细胞/ml的密度将其置于超低附着板（荷兰阿姆斯特丹科宁生命科学公司）中，辅以B27（Invitrogen）、20 ng/ml EGF（Sigma-Aldrich）、胰岛素（Sigma Aldric）、，β-巯基乙醇和氢化可的松。七天后，通过温和离心（1100 rpm）收集乳房球，在0.05%胰蛋白酶、0.25%EDTA中分离，然后以10000个细胞/ml的速度再次传代。

氟化铝（ALDH1）测定

用0.25%胰蛋白酶收集存活细胞群，并通过温和离心（1100 rpm）收集。如前所述，在进行醛氟分析之前，将细胞颗粒在PBS中清洗两次（干细胞技术，法国格勒诺布尔）[45].

小鼠致瘤性分析

体内通过原位乳腺脂肪垫移植和尾静脉注射BT474和MDA-MB-231细胞系评估siRNA处理细胞的肿瘤启动能力。使用1 mM EDTA收集BT474 siRNA处理的细胞，以5×10的密度洗涤并重新悬浮⁶无血清L15培养基中的细胞/ml。将1.5 mg、60天缓释17-β雌二醇颗粒（美国创新研究公司，佛罗里达州萨拉索塔）插入麻醉裸鼠右肩胛骨上方皮下。总计1×10⁶将细胞直接原位注射到腹部乳腺脂肪垫中，加入或不加入100 ng/ml TRAIL。然后对小鼠进行监测，当可触及时，每周测量两次肿瘤体积。以与BT474细胞相同的方式采集经siRNA处理的MDA-MB-231细胞并制备用于注射。然后将细胞注射到小鼠尾静脉中，加入或不加入200μl体积的TRAIL，并在注射后6周处死小鼠。

不论激素受体状态如何，c-FLIP（FLIPi）致敏乳腺癌细胞系的抑制作用

虽然大多数乳腺癌对TRAIL诱导的凋亡有抵抗力，但最近有报道称缺乏激素受体（HER2和ERα）的间充质乳腺癌细胞系对TRAIL治疗有反应[18]. 这是一个临床上重要的乳腺癌亚组，但它仅占乳腺癌患者人数的20%至25%。为了确定c-FLIP可能在多大程度上扩大TRAIL诱导细胞毒性的特异性，我们想直接比较不同乳腺癌亚型对c-FLIP抑制和TRAIL治疗联合作用的相对敏感性。

我们选择了四种代表ERα和HER2表达所有组合的乳腺癌细胞系：管腔样细胞BT474^ER+HER2+，SKBR3^ER-HER2型+和MCF-7^ER+HER2-代表大多数乳腺癌和基底样细胞系MDA-MB-231^ER-HER2型-[46]. 确认其受体状态（附加文件1图S1）和2D粘附细胞培养中TRAIL敏感性（图​（图2A），2安培)，使用一种新的荧光异型细胞培养试验（附加文件1图S2）。两个c-FLIP_S公司和cFLIP_L（左）siRNA抑制了转录物，导致所有细胞株中c-FLIP的表达减少70%以上（附加文件1图S3）。c-FLIP的抑制对DR4或DR5的表达没有影响（附加文件1图S3C），在所有测试的乳腺肿瘤细胞系中，细胞活力显著降低了10%至15%（图​（图2B，第2页,黑色条). 通过annexin-V染色和使用caspase抑制剂以细胞依赖的方式恢复细胞活力，证实这是凋亡（附加文件1图S4）。

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图2

c-FLIP对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）致敏乳腺癌细胞株的抑制作用.A类，细胞系与20 ng/ml可溶性TRAIL孵育18小时，并通过cellTiter Blue活性测定评估细胞活性。存活率以每个细胞系未经处理的对照组的百分比表示（*：P（P）< 0.01,n个=3）。B将用c-FLIP siRNA预处理的PKH67染色细胞和用对照siRNA预治疗的PKH26染色细胞混合并在完全培养基+/-20 ng/ml TRAIL中共同培养18小时，并通过流式细胞术评估活/死细胞（参见补充图S2）。在每个细胞系中，绘制了cFLIP siRNA细胞的细胞死亡百分比相对于其干扰siRNA对照的增加。分别绘制TRAIL处理的共培养物（白色条）和TRAIL未处理的共培育物（黑色条）。每种共培养在三个独立的实验中重复进行=P（P）<0.01，表示c-FLIP siRNA和干扰siRNA控制之间的细胞死亡百分比增加。*=P（P）TRAIL治疗组与未治疗组共培养组之间c-FLIP siRNA介导的死亡差异<0.01。C类，细胞按B处理，并设置门控，以给出处理后剩余活细胞的百分比。FT=c-FLIP siRNA。

当c-FLIP抑制（FLIPi）与TRAIL联合应用时，所有测试的乳腺癌细胞株都观察到显著的TRAIL依赖性杀伤（图​（图2B，第2页,白条；其他文件1图S5），表明在耐药细胞系中对TRAIL有显著的致敏性，但在TRAIL敏感的MDA-MB-231细胞系中FLIPi的加性效应不超过FLIPi。因此，无论激素受体状态如何，TRAIL/FLIPi对乳腺癌细胞存活率都有显著影响。尽管对TRAIL有显著的敏感性，但在联合（TRAIL/FLIPi）治疗（图​（图2C），2摄氏度)这表明这些异质细胞群对这种凋亡损伤有不同的反应。

FLIPi致敏乳腺癌干细胞（bCSCs）对TRAIL

乳腺肿瘤和乳腺癌细胞系含有一小部分（高达2%）肿瘤起始细胞（癌症干细胞）[8]. 这些细胞已被证明对现有的化疗药物具有耐药性[47]. 我们希望确定在每个细胞系中，是否存在通过TRAIL/FLIPi处理存活的细胞（图​（图2C）2摄氏度)包括乳腺癌干细胞（bCSCs）耐药亚群。

如前所述，使用功能性乳房球形成分析测定了bCSCs在每个细胞系存活细胞群中的比例[6,8,9]. 在将活细胞转移到非粘附状态之前，对每个细胞系进行c-FLIP RNAi，然后用TRAIL处理细胞。每个未经处理的细胞系与ER+ve系、BT474和MCF7形成大小和形态不同的乳房球，形成最大、最均匀的菌落（图​（图3A）3A级)如前所述，ER-ve株系SKBR3和MDA-MB-231形成松散、不规则的菌落[9]. 单独抑制c-FLIP对乳腺完整性没有明显影响，而单独TRAIL治疗会部分损害MCF-7和MDA-MB-231乳腺形态。然而，联合治疗严重破坏了所有四种细胞系中乳腺球的形成。通过短期培养和连续传代中的乳腺形成单位（MFU）量化证实了这一点（图​（图3B）3B公司)从而从细胞群中删除所有自我更新的MFU。

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图3

FLIPi/TRAIL治疗抑制乳腺增生形成并阻止乳腺增生形成单位的自我更新.A类在c-FLIP siRNAi（FLIPi）或对照siRNA（SCi）转染后，将细胞系置于低血清非粘附培养条件下，在有或无20 ng/ml TRAIL的情况下，以4000个细胞/孔（20000个细胞/ml）的密度进行培养。图片代表了所观察到的乳房球形成单位（MFU）。B在培养7天后，对每个条件下的三个重复孔中的哺乳动物进行计数（第1段）。使用胰蛋白酶分离哺乳动物，在没有TRAIL的情况下以2000个细胞/孔（10000个细胞/ml）的密度传代，并在培养7天后进行计数（第2代）。结果是根据所播种的细胞总数中乳房球形成单位的百分比进行计算的，并且是三个独立实验的代表。C类将siRNA-转染的SKBR3和BT474细胞经+/-20 ng/ml TRAIL处理18小时，然后通过流式细胞术评估存活的粘附单层的脱氟活性。图表表示在三个独立实验中，氟醛活性阳性细胞的百分比(*P（P）与SCi对照组相比<0.01）。

在未经处理的细胞系中，乳腺形成细胞的频率为总细胞数的0.4%至1.4%。SKBR3和MCF-7 MFU对TRAIL诱导的失巢凋亡部分敏感，因为在第一代中，只有不到四分之一的哺乳动物球体是在TRAIL单独存在的情况下形成的（图​（图3B，3B公司，油道1）。同样，单用FLIPi治疗后，SKBR3（而非MCF-7）的MFU显著减少，而MDA-MB-231和BT474细胞对FLIPi或TRAIL治疗完全耐药。然而，在所有病例中，联合治疗显著提高了对失巢凋亡的敏感性。从最初的12000个细胞开始，在MDA-MB-231和BT474培养物中没有哺乳动物存活，而在SKBR3和MCF-7细胞中分别有两个和一个松散形成的菌落。在没有TRAIL和/或FLIPi的情况下对乳房进行连续传代，结果显示除TRAIL和FLIPi预处理的细胞外，所有细胞培养物中的MFU都富集（图​（图3B）。3B公司). MFU富集表明干细胞由于对称细胞分裂而自我更新[8]. 在随后的传代中，TRAIL/FLIPi处理的培养物中的乳腺球完全消失，这表明18小时联合治疗后存活的少数致癌细胞严重受损，无法进行额外的对称细胞分裂。使用替代的c-FLIP siRNA靶序列也观察到了相同的结果（附加文件1图S6）。

与其他肿瘤细胞群相比，功能性MFU的消融表现出bCSC对TRAIL的优先敏感性。这一点通过使用标记物ALDH1的流式细胞术得到了证实，该标记物先前已被证明可富集HER2阳性乳腺癌细胞群中的肿瘤起始细胞（附加文件1图S7）[48]. HER2阳性细胞系BT474和SKBR3经TRAIL/FLIPi或对照siRNA（SCi）处理18小时，仅对存活的贴壁细胞进行ALDH1活性染色。两种细胞系在联合治疗后存活人群中ALDH1阳性细胞的相对比例均显著降低（图​（图3C3C公司)。

为了确定哪种c-FLIP亚型对肿瘤干细胞群体的自我更新活性的消融起作用，在乳腺检测之前使用了cFLIP短转录物和c-FLIP长转录物的特异性siRNA序列。c-FLIP-long而非c-FLIP-short的沉默模拟了肿瘤干细胞中整体c-FLIP抑制的细胞毒性作用，这证实了早期观察到的c-FLIP-long介导的MCF-7细胞存活率（图​（图4）。4). c-FLIP亚型的抑制也使癌干细胞对TRAIL的亚毒性水平敏感（图​（图5）。5). TRAIL浓度从20 ng/ml降至1 ng/ml，在TRAIL敏感的MDA-MB-231细胞系中未能激活细胞死亡反应（图​（图5A），5A级)，并如上所述进行了乳房培养。单独添加TRAIL会降低对乳腺完整性的影响，但联合治疗会消除BT474、SKBR3和MDA-MB-231细胞培养中的MFU，正如之前在较高浓度的TRAIL中观察到的那样。对联合治疗反应最差的细胞，MCF-7（图​（图3B），3B公司)，在降低TRAIL条件下以极低频率（1/12000个细胞接种）开发了自我更新MFU（图​（图5A5A级)。

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图4

c-FLIP公司_L（左）但不是c-FLIP_S公司敲除使乳腺癌干细胞对TRAIL敏感BT474和MDA-MB-231细胞转染siRNA序列，这些siRNA序列针对短或长c-FLIP亚型（FLIPi）或对照siRNA（SCi）。然后将细胞置于乳腺培养物中，并用20 ng/ml TRAIL处理。

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图5

贴壁培养中肿瘤干细胞对TRAIL的敏感性.A类TRAIL敏感的MDA-MB-231细胞系受到TRAIL浓度增加的影响，孔内caspase-8活性被绘制为caspase-Glo分析获得的相对发光。用siRNA（FLIPi和SCi）转染细胞系，并在存在或不存在1 ng/ml TRAIL的情况下，如图3所示在乳腺条件下进行电镀。如图3所示，图表表示在培养7天（第1段）和胰酶消化和再交配7天后形成的乳房球（MFU）的百分比（第2段）。B，转染siRNA的细胞系在贴壁单层培养中，用或不用TRAIL处理18小时。存活细胞群以20000个细胞/ml接种在低血清、非粘附培养条件下。如前所述，计算乳房球形成单位百分比（MFU）。

乳腺形成试验主要测试细胞抵抗失巢凋亡的能力，失巢凋亡是肿瘤起始（癌症干细胞）细胞的关键特性。据报道，c-FLIP在其他肿瘤细胞类型中是失巢凋亡抑制剂[49]我们希望测试MFU对TRAIL的敏感性是否依赖于非粘附条件所施加的附加应力（图​（图5B）。第5页). 每个细胞系均接受c-FLIP RNAi，然后在贴壁培养中与TRAIL孵育18小时，如之前在活力分析中所执行的那样（图​（图1）。1). 随后，在不存在TRAIL的情况下，将活细胞洗涤并在非粘附的乳细胞培养物中培养7天，并计数乳细胞的数量。在MCF7、MDA-MB-231和BT474细胞系中，MFU的自我更新能力再次被取消，尽管SKBR3细胞表现出剩余的MFU自我更新能力。因此，虽然一些细胞系在培养条件下保持对联合治疗的敏感性降低，但所有细胞系的CSC特性都继续显著降低。