国际分子科学杂志。2011; 12(12): 8645–8660.
新城疫病毒株AF2240和V4-UPM对白血病细胞株细胞溶解和凋亡的影响
,1,2,三，* ,1 ,1 ,4,5 ,4 ,4和1,*
艾德·阿拉布西
1马来西亚Terengganu 20400 Sultan Zainal Abidin大学（UniSZA）农业与生物技术学院生物技术系；电子邮件：ym.ude.azsinu@hahsaitis（S.A.A.B.）；moc.oohay@isba_alor公司（共和国）
2马来西亚普特拉大学（UPM）生物技术和生物分子科学学院细胞和分子生物学系，Serdang 43300，Malaysia
三马来西亚吉隆坡马来亚大学（UM）牙科学院，邮编：50603
2马来西亚普特拉大学（UPM）生物技术和生物分子科学学院细胞和分子生物学系，Serdang 43300，Malaysia
三马来西亚吉隆坡马来亚大学（UM）牙科学院，邮编：50603
5马来西亚塞当43300，马来西亚普特拉大学（UPM）生物科学研究所
2011年9月14日收到；2011年11月14日修订；2011年11月15日接受。
版权©2011作者版权所有；持牌人MDPI，瑞士巴塞尔。 摘要
新城疫病毒（NDV）被用作临床肿瘤治疗中的抗肿瘤药物。它作为一种抗癌药物引起了人们的极大兴趣，因为它在人类癌细胞中的复制能力比在大多数正常细胞中高出10000倍。本研究旨在测定NDV株AF2240和V4-UPM对WEHI-3B白血病细胞株的溶瘤潜能。MTT细胞毒性试验结果显示CD50AF2240和V4-UPM的两个菌株的值分别为2和8 HAU。此外，溴脱氧尿苷（BrdU）和台盼蓝染料排除试验显示，不同时期后细胞增殖受到抑制。在NDV处理的细胞上，caspase-3细胞水平的增加和琼脂糖凝胶电泳检测DNA梯状排列证实了细胞死亡的方式是凋亡。此外，细胞DNA含量的流式细胞术分析表明，病毒引起了G1亚区的增加（凋亡峰）。总之，NDV株AF2240和V4-UPM对WEHI-3B白血病细胞株有杀伤作用。
关键词：NDV、细胞溶解、细胞凋亡、流式细胞仪、白血病
1.简介
白血病是一种恶性肿瘤，其特征是造血细胞的肿瘤性增殖，即它们弥散地替代正常骨髓[1,2]. 化疗药物用于防止白血病细胞增殖、侵袭、转移并最终杀死患者，但它们毒性很强，可抑制癌症和正常细胞的复制[三]. 在过去的一个世纪里，一系列的案例研究和轶事报道表明，病毒确实可以用作抗癌疗法[4]. NDV是一种非工程溶瘤病毒，作为一种广谱溶瘤剂具有悠久的历史，可以破坏肿瘤细胞并刺激免疫系统[5]. NDV具有一些独特的特性，使其成为一种优秀的抗癌药物；它具有良好的细胞结合特性，能与肿瘤细胞特异结合，在肿瘤细胞细胞质中选择性复制，相对安全，可以作为佐剂[6]. 它具有溶瘤活性，可以破坏肿瘤细胞并刺激免疫系统。许多NDV菌株（73-T、MH68、意大利语、Ulester、Rokin、PV701和HUJ）显示出溶瘤活性[5,7]. 此外，还研究了6株NDV马来西亚株（AF2240、01/C、Ijuk、S、F和V4）对几种肿瘤细胞株的溶瘤作用[5,7]. 然而，还没有研究使用NDV溶瘤活性治疗粒细胞白血病。因此，本研究检测了两株马来西亚本地NDV株AF2240和V4-UPM的溶瘤作用在体外针对小鼠粒细胞白血病细胞系WEHI-3B。
2.结果
2.1. NDV对正常细胞和粒单核细胞白血病细胞的杀伤作用
在本研究中，研究了新城疫病毒株AF2240和V4-UPM对小鼠粒单核细胞白血病（WEHI-3B）、早幼粒细胞白血病（HL-60）和T淋巴细胞白血病（CEM-SS）、正常小鼠成纤维细胞（3T3）、小鼠脾淋巴细胞和A外周血单核细胞（PBMC）的杀伤作用通过使用比色细胞毒性试验（MTT）测量与未经处理的对照组相比在不同时期杀死50%细胞群的细胞毒性剂量来确定。每个菌株的检测重复三次。AF2240和V4-UPM菌株对WEHI-3B细胞株均表现出剂量依赖性的杀伤作用。杀死50%（CD）的病毒滴度50)与处理72小时后未处理的细胞相比，AF2240菌株和V4-UPM菌株的WEHI-3B细胞的血凝单位分别为2±0.2 HAU和8±0.2 HAU。此外，这两株NDV对HL-60和CEM-SS人白血病细胞株都有杀伤作用(). 另一方面，AF2240和V4-UPM菌株表现出低细胞毒性（CD50)在用作正常细胞的正常小鼠成纤维细胞（3T3）、小鼠脾淋巴细胞和外周血单个核细胞（PBMC）上().
表1
细胞毒性作用剂量（CD50)纽卡斯尔病病毒株（AF2240和V4-UPM），与商业药物（阿霉素和阿糖胞苷）在培养72小时时对抗白血病和正常细胞系。
| 单元格行 | AF 2240（空军2240） | V4-UPM版本 | 阿霉素 | 阿糖胞苷（Ara-C） |
|---|
| WEHI-3B公司 | 2 ± 0.2 | 8 ± 0.2 | 0.8 ± 0.6 | 1.0 ± 0.13 |
| HL-60型 | 25 ± 0.3 | 110 ± 0.8 | 1.8 ± 0.1 | 0.3 ± 0.05 |
| CEM-SS公司 | 16 ± 0.6 | 64 ± 0.5 | 3.5 ± 0.1 | 3.8 ± 0.30 |
| 3T3型 | 无CD50 | 无CD50 | 7.0 ± 0.4 | 2.8 ± 0.20 |
| 中国人民银行 | 无CD50 | 无CD50 | 11.0 ± 0.8 | 7.0 ± 0.80 |
| 小鼠脾淋巴细胞 | 无CD50 | 无CD50 | 6.5 ± 0.2 | 4.7 ± 0.6 |
2.2. BrdU细胞增殖试验
采用BrdU细胞增殖试验，基于DNA合成阶段，研究NDV株AF2240和V4-UPM对WEHI-3B细胞增殖的影响。本试验显示，NDV株AF2240和V4-UPM以时间和浓度依赖的方式处理后，WEHI-3B细胞的570nm光密度（OD）降低(). 如中所述未经处理的WEHI-3B细胞从第1天到第3天OD增加。然而，用CD处理的WEHI-3B细胞50和CD75，从第1天到第3天OD下降。
BrdU增殖试验，不同浓度新城疫病毒AF2240株的影响(A类)和V4-UPM(B类)对WEHI-3B细胞增殖和活性的影响。
类似地，如，CD处理细胞的OD值75下降幅度超过CD50治疗至第三天。从第一天到第三天，两种浓度的OD在治疗后均显著下降(第页<0.05）。
2.3. 台盼蓝排除试验
根据台盼蓝染料排斥试验的结果，增加NDV暴露时间对WEHI-3B细胞活力有显著影响。CD治疗WEHI-3B细胞50和CD75病毒株浓度（AF2240为2和32 HAU，V4-UPM为8和64 HAU）导致细胞活力受到剂量和时间依赖性抑制。如中所述，高浓度（CD75)在AF2240中，与对照组相比，WEHI-3B细胞在24小时时的存活率降低到52%，最终在48小时和72小时后分别下降到34%和22%。在CD上50与对照组相比，AF2240、WEHI-3B细胞活力在24小时时降低到78%，在48和72小时后分别降低到54%和49%。另一方面，高浓度CD75与对照组相比，V4-UPM的WEHI-3B细胞存活率在24小时降至46%，在48小时和72小时后分别降至25%和23%。鉴于，在CD上50与对照组相比，V4-UPM、WEHI-3B细胞存活率在24小时时下降至66%，在48小时和72小时后分别下降至56%和50%。
台盼蓝排除试验。用不同浓度的病毒株在不同时间间隔处理后，WEHI-3B细胞群中活细胞的百分比。
2.4. DNA片段分析
染色体DNA片段化是细胞凋亡的生物学标志。在凋亡细胞死亡期间，细胞内切酶在核苷之间切割基因组DNA，产生长度为180–200 bp的倍数的片段。当使用琼脂糖凝胶电泳进行解析时，这些DNA片段显示为一个核小体阶梯。在本研究中，NDV株AF2240和V4-UPM均在CD处引起WEHI-3B细胞的DNA片段化50值，AF2240和V4-UPM的2和8 HAU，在24、48和72小时后。180–200个碱基对倍数的DNA片段在琼脂糖凝胶上表现为独特的梯状图案().
琼脂糖电泳图谱显示NDV株AF2240和V4-UPM处理的WEHI-3B细胞在CD上的DNA断裂50浓度。从左到右：车道1,7：100 bp DNA标记；车道2,8：用阿霉素（8μg/mL）处理的WEHI-3B细胞；车道三,9：未经处理的WEHI 3B细胞；车道4–6：分别在24、48和72小时后用AF2240菌株处理WEHI-3B细胞；车道10–12：分别在24、48和72小时后用V4-UPM菌株处理WEHI-3B细胞。
2.5. 新冠病毒对细胞周期分布的影响
在本研究中，通过用碘化丙啶（PI）染色凋亡细胞核，根据细胞核变化对凋亡进行量化。用FACS分析法研究NDV株AF2240和V4-UPM（CD）的细胞周期动力学50)在WEHI-3B细胞上，使用Cell Quest软件分析了20000个细胞。如所示,和，用CD治疗24小时后50NDV株AF2240和V4-UPM的值，两种病毒株都能诱导WEHI-3B细胞群14%和13%的凋亡细胞，并且凋亡细胞的数量开始随着时间的推移逐渐增加。经过48和72小时的治疗，NDV株AF2240能够诱导18%和21%的凋亡细胞()NDV V4-UPM株在48和72小时后分别诱导15%和20%(). 随着时间的推移，细胞凋亡（Sub-G1）诱导率显著增加(第页与未经处理的细胞相比，经两株NDV处理的WEHI-3B细胞<0.05）。另一方面，两株NDV在特定细胞周期阶段均未表现出对WEHI-3B细胞的抑制作用，这意味着NDV能够在不同的细胞周期阶段杀死WEHI-3B细胞。这种病毒诱导的细胞周期扰动与之前的结果一致，表明WEHI-3B细胞随着时间的延长发生更广泛的凋亡。
碘化丙啶染色后WEHI-3B细胞群的流式细胞术细胞周期分析。(A类)NDV株AF2240在CD上处理细胞50价值；(B类)NDV V4-UPM株在CD上处理细胞50值。注：每个值代表三次复制±SEM的平均值(第页< 0.05).
NDV株AF2240在CD上处理WEHI-3B细胞的DNA荧光直方图50价值(一)未处理细胞；(b条)24小时后处理的细胞；(c（c）)48h后处理细胞；(d日)72h后处理细胞(B类)子G1；(C类)G1；(D类)S；以及(E类)G2/M组。
NDV V4-UPM株CD处理WEHI-3B细胞的DNA荧光直方图50价值(一)未处理细胞；(b条)24h后处理细胞；(c（c）)48h后处理细胞；(d日)72h后处理细胞(B类)亚-G1；(C类)G1；(D类)S；以及(E类)G2/M组。
2.6. 激活Caspase-8，外源途径的启动子Caspase
确定caspase-8在NDV治疗反应中的作用。12 h活化caspase-8的治疗率为26.8%，治疗后24 h增至59.1%().
NDV对caspase 8的影响(A类)，半胱天冬酶9(B类)和半胱天冬酶3/7(C类)在WEHI-3B细胞中。数据表示为三个实验的平均值±SEM(n个= 3). 与未经处理的对照组相比，有显著差异第页< 0.05.
2.7. 内禀途径启动子Caspase 9的激活
还研究了caspase-9在NDV治疗反应中的作用。如所示caspase-9的活性从12小时逐渐增加到24小时，分别为46.5%和55.8%。
2.8. 效应器/执行器半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-3/7）的激活
进一步确定了效应器caspase（caspase-3/7）在NDV治疗中的作用。NDV处理WEHI-3B细胞12 h后激活的caspase-3/7为42.67%，24 h后增加到78.4%().
3.材料和方法
3.1. 新城疫病毒AF2240和V4-UPM株的繁殖和纯化
NDV在9–11天龄鸡胚的尿囊液中37°C培养48小时。采集尿囊液并通过血凝试验确认病毒的存在[8]. 按照钱伯斯和萨姆森（1980）之前的描述纯化NDV[9].
3.2. 细胞与细胞培养
（WEHI-3B）小鼠粒细胞白血病细胞系和3T3（小鼠成纤维细胞）细胞系由马来西亚普特拉大学生物科学研究所分子和细胞生物学实验室提供。将WEHI-3B和3T3细胞系培养在含有10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM（美国西格玛）中，37°C，5%CO的湿润环境中2在空中。在实验之前，每隔三到四天将细胞生长到汇合处并进行亚培养。
3.3. 细胞活性和增殖评估
3.3.1. MTT细胞毒性试验
用微量滴定法测定NDV对白血病细胞的抑制作用[10,11]. 将约150μL完整培养基添加到96孔平板（丹麦Nunclon™）中，并将50μL 2倍系列病毒稀释液添加到孔中。在最后一个孔中，添加50μL PBS代替病毒，作为对照。然后50μL的5×105加入CEM-SS（人类T淋巴细胞白血病）、WEHI-3B（小鼠粒细胞白血病）、HL-60（早幼粒细胞白血病272小时后，向每个孔中添加20μL PBS溶液中的MTT（5 mg/mL），然后将平板进一步培养4小时。去除大部分培养基，并向孔中添加100μL DMSO（二甲基亚砜）以溶解晶体。最后，用（ELISA）读卡器在570nm波长下测量OD。然后是活细胞百分比图与绘制病毒滴度HAU。CD的价值50根据与对照组相比导致50%细胞减少的浓度下获得的曲线图确定。
3.3.2. BrdU增殖试验
使用试剂盒BrdU Cell proliferation assay（CHEMICON，USA）对经处理和未经处理的WEHI-3B细胞进行BrdU增殖试验。浓度为1×10的WEHI-3B细胞5两株NDV在CD上处理的细胞/mL50和CD75浓度（AF2240为2和32 HAU，V4-UPM为8和64 HAU）。然后在5%CO的气氛中培养平板2在37°C下放置24、48和72小时。培养期结束后，用PBS清洗细胞两次。根据制造商规定的协议进行进一步的程序。使用分光光度计微孔板阅读器在450 nm和550 nm的双波长下读取平板。将样品的OD绘制成时间曲线，以确定给定值中细胞的生长速率。
3.3.3. 台盼蓝排除试验
采用台盼蓝排除试验测定培养物中活细胞的数量。用不同的CD培养细胞50和CD7537°C下两种NDV菌株的浓度（AF2240为2和32 HAU，V4-UPM为8和64 HAU）。然后在指定的时间间隔测定细胞的活力。通过活细胞计数分析细胞，获得细胞存活率。结果表示为一式三份培养物的细胞活力的平均百分比±SEM。
3.4. DNA片段分析
浓度为5×10的细胞6细胞/mL接种到6孔板（NunclonTM（TM）（丹麦）在2 mL培养基中，CD浓度为50病毒的价值。一些井没有留下病毒作为对照。培养72小时后，以1000 rpm转速旋转细胞10分钟，并用PBS清洗颗粒两次。根据QIAGEN血液和培养细胞试剂盒的方案，从处理和未处理的细胞中提取DNA。纯化的DNA在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳。凝胶电泳并在溴化乙锭中染色。用紫外透射仪观察谱带。
3.5. 用碘化丙锭分析细胞DNA含量
浓度为5×10的细胞6细胞/mL的WEHI-3B细胞系在6孔板中与一定浓度的CD一起孵育5072小时内的病毒值。一些井没有留下病毒作为对照。孵育期结束后，通过添加500μL 80%冷乙醇固定细胞，并在−20°C下保存至少2 h。将细胞以1000 rpm的转速造粒10分钟，并丢弃乙醇。用1mL（PBS/叠氮化钠）洗涤细胞颗粒两次。用1mL（PBS+0.1%triton X-100+10mm EDTA+50μg/mL RNase+2μg/mL碘化丙啶）重新悬浮颗粒，然后在4°C下培养1/2至1h。最后，用流式细胞仪（美国贝克曼·库尔特）分析样品。
3.6. 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7、8和9活性分析
Caspase-3/7、8和9的活性是用Caspase-Glo测定的®3/7、8和9检测试剂盒（美国Promega）。该试剂盒在针对caspase活性、荧光素酶活性和细胞裂解进行优化的试剂中提供了致发光caspase-3/7、8和9底物。WEHI-3B细胞生长在白色、光学底部96-well板中，并在CD上用NDV处理50培养时间为0、12和24小时。培养时间结束后，将等量的试剂添加到细胞中，并进一步培养1小时。使用摇床以300至500 rpm的转速轻轻混合内容物30秒。使用新发光板阅读器Tecan（Infinite M200）测量发光强度。从实验值中减去空白值。
3.7. 统计分析
数据表示为平均值±SEM。使用Student’st吨-MTT细胞毒性试验、BrdU增殖试验、台盼蓝排斥试验、流式细胞术和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的数据检验，p值小于0.05。
4.讨论
溶瘤病毒是一种在癌细胞中感染和复制的病毒，它破坏这些有害细胞，使正常细胞基本上不受影响。NDV是一种溶瘤病毒，能够通过不同机制诱导肿瘤溶解[12]它似乎能复制并杀死肿瘤细胞，但不能杀死正常的人类细胞[13]. 开发生物靶向药物，利用癌细胞和正常细胞之间的差异，对正常细胞损伤较小的癌细胞具有更大的特异性，仍然是抗肿瘤药物研发领域的最终目标[14]. 本研究表明，NDV AF2240和V4-UPM株具有诱导（WEHI-3B）小鼠粒细胞白血病细胞株细胞溶解、凋亡和抗增殖的能力。
根据MTT分析，两种NDV株处理对WEHI-3B细胞产生浓度和时间依赖性的细胞溶解作用，但对小鼠成纤维细胞（3T3）、小鼠脾淋巴细胞和外周血淋巴细胞（用作正常细胞）没有影响。这些结果与之前的其他研究一致[7,15–18]这表明NDV株AF2240和V4 UPM作为溶瘤剂在乳腺癌细胞系（MCF-7和MDA-231）、白血病细胞系（HL-60和CEM-SS）和脑肿瘤细胞系（DBTRG.5MG和U87MG）上的有效性。
为了进一步研究病毒的细胞溶解作用，使用溴脱氧尿苷（BrdU）细胞增殖测定法测定了对WEHI-3B增殖的抑制作用，该测定法基于DNA合成阶段[19]. 两株NDV在高滴度的WEHI-3B细胞上的接种表明，细胞的生长速度比低滴度的接种下降得更多。另一方面，未经处理的WEHI-3B细胞的生长速度增加。因此，两株NDV都能抑制WEHI-3B细胞增殖。
台盼蓝排斥试验也表明NDV对WEHI-3B细胞具有显著的抗增殖作用。这项测试基于这样一个原理：活细胞具有完整的细胞膜，可以避开染料，而死细胞则没有[20].
细胞凋亡与病毒的发病机制特别相关；它是哺乳动物免疫系统清除病毒的主要机制，诱导感染细胞凋亡。越来越明显的是，许多病毒已经进化出能够减弱细胞凋亡的蛋白质[21]. 研究人员使用了许多方法来区分凋亡和坏死。在本研究中，我们报道了两株NDV均能在接种后24、48和72小时刺激WEHI-3B细胞系凋亡的DNA片段特征。DNA的核小体间断裂可能处于凋亡过程的后期[22–24]. DNA阶梯试验通常被认为是针对凋亡的特异性试验，因为它检测的是寡核苷酸分裂，而不是人工DNA分裂或坏死。迄今为止，通过内切酶的激活产生180–200 bp的核小体间DNA片段，已经从生物化学角度对细胞凋亡进行了表征[23].
通过细胞周期的流式细胞术分析进一步证实了细胞死亡模式，这是通过DNA染料染色对细胞凋亡变化的快速定量测量[25]. 此方法可用于定量估计细胞周期不同阶段的细胞分数[26]. 通过DNA流式细胞术（FCM）测量凋亡细胞的数量，评估未处理和处理的WEHI-3B细胞系的凋亡情况。在本研究中，我们发现两株NDV处理WEHI-3B细胞时，细胞凋亡峰值出现在G1期之前。两种NDV株都导致亚G增加1时间增加的区域。这种时间依赖性效应在诱导细胞凋亡时非常明显，在任何特定阶段都没有诱导细胞周期阻滞。荧光直方图显示，在细胞周期的所有三个阶段，处理的WEHI-3B细胞都较少（G1、S和G2/M） 伴随着G1以下区域的大量增加（凋亡峰）。
半胱天冬酶是效应器和执行器。效应半胱天冬酶可以通过多种途径激活，其中一些涉及线粒体，另一些则独立于该细胞器。一旦效应器半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活，它们就会裂解并激活下游执行器半胱天冬酶。这些下游半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶随后裂解并激活一系列参与最终凋亡事件的分子。如果没有正常功能的半胱天冬酶，上游抑癌基因可能无法激活凋亡途径。因此，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶是肿瘤治疗的重要指标。在本研究中，Caspase-8被鉴定为由死亡受体触发的启动子Caspase。因此，caspase-8的激活提示NDV可能通过外源性死亡受体途径诱导细胞凋亡。死亡受体是属于肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族的细胞表面细胞因子受体，与一组结构相关配体或特异性抗体结合后触发细胞凋亡[27–29]. NDV处理的WEHI-3B细胞中caspase-9的激活可能与线粒体的参与有关。线粒体是细胞损伤的重要传感器。线粒体外膜渗透性的任何增加都会使某些蛋白质，例如细胞色素c（c），从线粒体膜间隙释放到胞浆中并激活凋亡小体。在凋亡小体内激活后，caspase-9通过激活caspase-3和-7传播caspase级联反应。Caspase-3反过来激活caspases-2和-6，然后促进下游caspases-8和-10的激活[30]. 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3也参与反馈放大回路，以进一步处理半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9[31]. 因此，很明显，一旦凋亡小体内的caspase-9被激活，死亡信号就会通过激活大量其他caspase而迅速放大。执行者caspase包括caspases-3、-6和-7。许多研究表明，caspase-3是caspase的主要执行者，而caspase-6和-7的生理底物相对较少[32]. 据推测，caspase-3在哺乳动物中具有中枢执行caspase的地位，caspase 3的作用由死亡受体和线粒体介导的死亡途径在caspase-3激活时的汇聚以及广泛的潜在caspase-3底物支持[33,34].
总之，我们研究了NDV株AF2240和V4-UPM作为WEHI-3B粒细胞白血病细胞溶瘤剂的使用。我们的研究表明，NDV对白血病细胞有强大的作用，其细胞毒性随着病毒滴度的增加而增加。还发现NDV通过诱导WEHI-3B白血病细胞凋亡而起作用。
致谢
这项研究部分由马来西亚国家癌症委员会（MAKNA）资助。作者还感谢马来西亚普特拉大学（UPM）、苏丹扎伊纳·阿比丁大学（UNISZA）的短期研究资助以及马来西亚高等教育部的基本研究资助计划（FRGS）的额外支持。
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