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分子细胞。作者手稿；PMC 2012年11月18日发布。
以最终编辑形式发布为：
分子细胞。2011年11月18日；44(4): 609–620.
数字对象标识：2016年10月10日/j.molcel.2011.08.042
预防性维修识别码：PMC3222870
美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院334963
PMID：22099308

NSD2将组蛋白H3在赖氨酸36处的二甲基化与致癌编程联系起来

亚历克斯·J·郭,1,* 张佩姬（Peggie Cheung）,1,* 陈开复,2,* 巴里·泽伊,三 水户清,4 乔什·劳林,5 袁新喜,2 Ben Ho公园,5 史晓兵,6 本杰明·加西亚,三 魏丽,2,#和或者戈扎尼1,#
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关联数据

补充材料

总结

组蛋白赖氨酸甲基转移酶NSD2（MMSET/WHSC1）与多种疾病有关，并且由于t（4；14）染色体重复易位，在多发性骨髓瘤中通常过度表达。然而，NSD2的精确催化活性尚不清楚，阻碍了理解该酶如何影响染色质生物学和骨髓瘤发病机制的进展。在这里，我们表明组蛋白H3在赖氨酸36（H3K36me2）处的二甲基化是NSD2的主要染色质调节活性。NSD2催化H3K36me2足以激活基因。在t（4；14）阳性骨髓瘤细胞中，H3K36me2的正常全基因组和基因特异性分布被破坏，形成了一个染色质景观，选择有利于骨髓增生的转录谱。催化活性的NSD2使t（4；14）阴性细胞形成异种移植瘤，并以H3K36me2依赖方式促进原代细胞的致癌转化。我们的研究结果确定H3K36me2是NSD2产生的主要产物，并证明NSD2对该典型染色质标记的基因组破坏会启动致癌程序。

引言

组蛋白赖氨酸甲基化信号是影响基本核过程的主要染色质调节机制(库扎里德斯，2007年). 赖氨酸(K（K）)残基可接受多达三个甲基，以形成单甲基、二甲基和三甲基衍生物（分别为Kme1、Kme2和Kme3）。甲基化组蛋白物种通过甲基化事件的范围和序列背景指定的方式，通过甲基化赖氨酸结合蛋白被检测并与下游生物功能相联系(Taverna等人，2007年). 人类基因组编码超过50种预测的蛋白赖氨酸甲基转移酶（PKMT），其中一些在人类疾病中被解除调控(库扎里德斯，2007年). 为了了解这种多样的核信号网络如何影响染色质生物学和疾病，有必要阐明单个PKMT在其底物上的精确活性。

绝大多数PKMT酶含有保守的催化SET结构域(Dillon等人，2005年). NSD2（也称MMSET和WHSC1）是一种与多种人类疾病相关的SET域PKMT。例如，NSD2单倍体不足与发育障碍Wolf-Hirschhorn综合征（WHS）有关(Stec等人，1998年)以生长发育迟缓、智力低下、先天性心脏缺陷和抗体缺乏为特征，NSD2缺陷小鼠表现出类似WHS的一系列缺陷(Nimura等人，2009年).

NSD2也与血液恶性多发性骨髓瘤（MM）的发病机制有关(安德森和卡拉斯科，2011年). MM是2第最常见的血癌，占美国所有癌症的1%和癌症死亡的2%(Chng等人，2007年;Palumbo和Anderson，2011年). 15-20%的MM患者在第4和14号染色体[t（4；14）（p16.3；q32）]之间携带易位，这两个基因的转录，NSD2型和FGFR3公司在强IgH内含子Eμ增强子和3′增强子的控制下，导致这两个基因异常上调(Chesi等人，1998年). 值得注意的是，NSD2而非FGFR3的过度表达被认为在t（4；14）介导的骨髓瘤发病机制中很重要(Keats等人，2003年;Santra等人，2003年). 因此，NSD2在哺乳动物的发育过程中起着重要作用，其过度表达与癌症有关。

NSD2的生理催化活性尚不清楚，尤其是因为文献中有几个相互矛盾的报道。具体而言，NSD2和/或NSD2亚型被提议产生许多不同的组蛋白标记，包括H3在赖氨酸K4（H3K4me3）、K27（H3K27me3）和K36（H3K 36me3）处的三甲基化、H4在赖氨酸K20（H4K20me3）处三甲基化，H4在赖氨酸20处的二甲基化（H4K 20me2），以及H3在赖氨酸碱36处的二甲化（H3k 36me2）(Kim等人，2008年;Li等人，2009年;Marango等人，2008年;Martinez-Garcia等人，2011年;Nimura等人，2009年;Pei等人，2011年). 生物学上，据报道NSD2通过产生H3K36me3抑制转录(Nimura等人，2009年)，H4K20me3(Marango等人，2008年)，或H2K27me3(Kim等人，2008年)，并通过产生H4K20me2介导53BP1定位到DNA损伤灶(Pei等人，2011年). 因此，NSD2的真正酶和染色质调节功能尚不清楚。

在这里，我们采用多种独立的生化和细胞方法来调查和解决NSD2酶活性方面的差异。我们发现NSD2在染色质处的主要生理活性是H3K36的二甲基化，在此过程中排除了H3K36me3、H4K20me2和NSD2的其他几种假定甲基产物的生成。我们还阐明了NSD2通过H3K36me2催化启动致癌程序的机制，揭示了染色质稳态破坏与癌症之间的新联系。

结果

NSD2仅在赖氨酸36处为单甲基和双甲基核糖体组蛋白H3在体外

为了了解NSD2酶的特异性，我们测定了NSD2 SET结构域（NSD2）的甲基化活性SET（设置）; 看见图S1A（示意图）使用天然核小体作为生理相关底物。该分析表明，NSD2SET（设置）只甲基化核小体组蛋白H3，类似于阳性对照G9aSET（设置），而SET8/PR-Set7将其已知底物H4甲基化(图1A). 此外，全长NSD2甲基化核小体H3，而非其他核心组蛋白，包括H4(图1B和S1B级). 接下来，与NSD2的甲基化反应SET（设置）对重组核小体（缺乏所有修饰）进行质谱分析，以确定NSD2的特定组蛋白赖氨酸残基底物和修饰残基的甲基化程度(图1C). 采用这种策略，检测到的唯一甲基化事件是H3K36的单甲基化和双甲基化(图1C; 例如未检测到H4K20甲基化）；这些结果得到了西方分析的独立证实(图1D; 数据未显示）。据报道，NSD2通过H3K36me3特异性甲基化活性抑制转录(Nimura等人，2009年). 然而，NSD2并没有在重组核小体上三甲基化H3K36(图1C和1D). 此外，NSD2SET（设置）-介导的甲基化增加了天然核小体上H3K36me1和H3K365me2的水平，但不增加H3K360e3的水平(图1E). 相反，重组核小体和天然核小体上的H3K36me3水平被已知的H3K36me3赖氨酸甲基转移酶SETD2特异性增加(Edmunds等人，2008年) (图1F; 数据未显示）。全长NSD2和主要NSD2变体RE-IIBP表现出与NSD2相同的活性SET（设置）在核小体上产生H3K36me1和H3K365me2，但不产生H3K 36me3(图1E;图S1C和S1D). 因此，在体外NSD2单甲基和双甲基，但不含三甲基，H3K36。

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NSD2单甲酯和双甲酯H3K36在体外

（A） NSD2型SET（设置）仅在天然核小体上甲基化H3。使用所示重组酶对HeLa纯化核小体进行甲基化分析的自射线照片。组蛋白的考马斯染色如下所示。

（B） 全长NSD2仅在天然核小体上甲基化H3。使用从Sf9细胞纯化的全长NSD2进行甲基化的自射线照相和考马斯氏分析，如（A）所示。通道1：仅核小体（Nu），通道2：与来自非转导Sf9细胞的IPed物质的控制反应。左幅：纯化全长NSD2蛋白的考马斯染色。

（C和D）NSD2在重组核小体上对H3K36进行单甲基和双甲基化。（C） NSD2的定量质谱SET（设置）重组核小体甲基化检测。控制反应缺乏NSD2SET（设置）质谱显示H3K36me0（左）肽水平下降，而NSD2上检测到H3K365me1（中）和H3K36.me2（右）肽SET（设置）甲基化（参见扩展方法）。未检测到其他甲基化事件（例如H3K36me3、H4K20me2）。箭头：预期在-NSD2中出现修饰肽的位置SET（设置）反应。（D） NSD2的西方分析SET（设置）使用所示抗体进行甲基化分析，如（C）所示。

（E） NSD2在天然核小体上生成H3K36me1和H3K365me2。用NSD2甲基化检测的指示抗体进行西方分析SET（设置）HeLa核小体上的全长NSD2（右）。控制反应缺乏NSD2。

（F） SETD2催化H3K36在天然核小体上的三甲基化SET（设置）NSD2甲基化测定的西方分析SET（设置）和SETD2SET（设置）在HeLa核小体上。对照反应无酶。

（G） NSD2在H4K20下不会甲基化。NSD2甲基化检测的西方分析SET（设置）在重组H4上。对照反应缺乏NSD2SET（设置）总H4显示为负载控制。

NSD2最近被提议通过H4K20的二甲基化来调节53BP1在DNA损伤灶中的定位(Pei等人，2011年). 然而，我们的数据显示NSD2（全长，NSD2SET（设置）与阳性对照酶SET8相比，RE-IIBP）不甲基化H4K20，这是通过免疫印迹分析和质谱在多种底物上测定的，包括H4肽、重组H4、纯化H4、重组核小体和天然核小体(图1C-E，1G,S1B–E级; 数据未显示）。此外，NSD2和RE-IIBP不会使先前牵连的底物位点H3K4甲基化(Marango等人，2008年)和H3K27(Kim等人，2008年) (图1D；1E级,S1C；S1D系列; 数据未显示）。我们注意到，肽阵列用于测试我们研究中使用的抗体的表位和甲基状态特异性(Bua等人，2009年) (图S1F; 数据未显示）。因此，在我们的实验条件下，我们的结果不支持先前的说法，即NSD2可以甲基化H3K4、H3K27或H4K20底物。综上所述，我们的结论是在体外NSD2主要是一种H3K36单甲基和双甲基酶。

H3K36的二甲基化是NSD2对细胞组蛋白的主要催化作用

NSD2在293T细胞中的过度表达导致H3K36me2整体水平升高，但对H3K365me3、H4K20me2和其他一些标志物的水平没有影响(图2A). 接下来，在KMS11细胞（模型t（4；14））中研究NSD2活性+IgH增强子导致NSD2过度表达的骨髓瘤细胞系(Lauring等人，2008年). RNA干扰（RNAi）介导KMS11细胞中NSD2表达的下调，使用两个独立的shRNAs(图S1A)导致H3K36me2水平的特定下降，但没有其他组蛋白甲基标记，包括H4K20me2和H3K365me3(图2B). 相反，在SETD2缺失的KMS11细胞中，H3K36me3（而非H3K365me2）的整体水平下降(图2C). 此外，HT1080和U2OS癌细胞株中NSD2的缺失降低了H3K36me2的水平，而没有改变H3K365me3的水平(图2D).

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NSD2在细胞中生成H3K36me2

（A） NSD2过表达增加细胞中H3K36me2的整体水平。用转染全长NSD2或对照载体的293T细胞的全细胞提取物（WCE）的指示抗体进行Western分析。总H3显示为负载控制。

（B） RNAi对NSD2的耗竭可显著降低t（4；14）中的全球H3K36me2水平+骨髓瘤细胞。西方人对t（4；14）中WCE（A）的分析+KMS11骨髓瘤细胞稳定表达对照shRNA或靶向NSD2的两个独立shRNA。

（C） 耗尽SETD2可降低骨髓瘤细胞中的H3K36me3水平。表达所示shRNAs的KMS11细胞的WCE（B）的Western分析。

（D） NSD2的耗竭可特异性降低非骨髓瘤癌细胞系中H3K36me2的整体水平。来自用对照siRNA或两种靶向NSD2的独立siRNA转染的HT1080（上图）和U2OS（下图）细胞的WCE指示抗体的Western分析。

（E） KMS11、TKO和NTKO细胞系示意图（参见Lauring等人，2008年). t（4；14）中的同源重组+KMS11细胞靶向t（4；14）相关的失活NSD2型等位基因（TKO）或野生型NSD2型等位基因（NTKO）。

（F） 骨髓瘤细胞中t（4；14）相关NSD2表达的缺失导致H3K36me2耗竭，但不会导致其他组蛋白甲基化标记。（F） 使用所示抗体对KMS11、TKO和NTKO细胞的WCE进行西方分析。（G） NSD2在指定细胞系中的长期暴露和定量分析。（H） KMS11细胞和两个独立的TKO细胞系中所示甲基化事件相对量的定量质谱。折叠Δ：KMS11与TKO样品的比率。±标准偏差，与一式三份分析的2份副本相比。

KMS11细胞，其中t（4；14）驱动NSD2型等位基因已被同源重组灭活(t吨迁移k诺克-o个与亲本KMS11细胞或仅靶向灭活野生型等位基因的细胞相比，ut（TKO）细胞的致瘤性减弱(n个上的-t吨迁移k诺克-o个ut（NTKO）；看见图2E) (Lauring等人，2008年). 在两个缺乏t（4；14）的独立TKO细胞系中NSD2型等位基因、全球H3K36me2水平低于KMS11和NTKO细胞，H3K365me3或H4K20me2水平没有变化(图2F). 因此，KMS11细胞中NSD2蛋白丰度是TKO细胞系的6-7倍(图2G和S1G系列).

比较KMS11和TKO细胞组蛋白甲基标记水平的无偏定量质谱筛查显示，KMS11细胞中H3K36me2水平比TKO细胞高3倍(图2H). 相反，KMS11细胞中非甲基化H3K36和H3K36me1的水平比TKO细胞低2倍，这表明KMS11中这些标记转化为H3K365me2(图2H). 组蛋白甲基化无其他显著差异(图2H). 因此，我们得出结论，NSD2不会三甲基化H3K36或二甲基化H4K20，并且NSD2是多种癌症细胞类型中存在的大多数H3K36me2所必需的，包括t（4；14）+骨髓瘤细胞。

t（4；14）+-驱动NSD2过度表达触发H3K36me2的全基因组重编程

接下来，我们使用ChIP-seq（染色质免疫沉淀（ChIP），然后进行高通量测序）来确定在不存在或存在t（4；14）易位（分别为TKO2和KMS11细胞）的情况下H3K36me2的基因组分布。在仅从一个野生型等位基因表达NSD2的TKO2细胞中（参见图2E、2G,S1G系列)，H3K36me2信号优先富集于代表性染色体上的基因内和基因间区域(图3A，底部面板用于更高分辨率的图像）。相反，在t（4；14）中+KMS11细胞H3K36me2信号并不映射到基因体，而是散布在整个染色体上(图3A). 在全基因组范围内，在两个独立的H3K36me2 ChIP-seq实验中，TKO2细胞中的大多数H3K36me2峰定位于基因内区域，而在KMS11细胞中，H3K36me2峰主要位于基因间区域(图3B;图S2A; 独立的生物ChIP-seq复制品如所示补充数据). 尽管KMS11细胞中H3K36me2的全球水平较高，但由于H3K365me2在KMS11基因组中广泛富集（例如，在21号染色体上，KMS11的细胞中有35个峰值，而TKO细胞中有236个峰值(图3A)). 为了避免调用峰值中潜在的计算偏差，确定了每个核苷酸的H3K36me2相关读取原始数量的基因组分布。如所示图3CKMS11细胞中的H3K36me2结合核苷酸与读取数无关，分散在整个基因组中，基因间/基因内比率与整个基因组的基因间/基因组内组成相平行(图3C;图S2B). 相反，在TKO2细胞中，H3K36me2结合核苷酸，如H3K365me2峰值，优先在基因体内定位(图3C;图S2B).

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t（4；14）驱动的NSD2过度表达消除了H3K36me2的正常全基因组和基因特异性分布

（A） 与（B）和（C）t（4；14）相关的NSD2过度表达消除了H3K36me2的正常全基因组分布。（A） 图中显示了来自KMS11和TKO2细胞穿过代表性染色体的H3K36me2 ChIP-seq信号。顶部两个插入：H3K36me2分布在所示细胞系的第21号染色体上。指示H3K36me2峰值#。底部两个插图：21号染色体上23-29兆碱基对（mb）的H3K36me2 ChIP信号的高分辨率轨迹。基因标记在轨迹下方。（B） 在KMS11和TKO2细胞的基因组中，H3K36me2富集峰的百分比定位于基因间（黄色）或基因内（紫色）区域。显示了每个细胞系中H3K36me2峰的数量。（C） 与指定数量的H3K36me2 ChIP-seq相关的核苷酸分布显示KMS11和TKO2细胞中基因间（黄色）和基因内（紫色）区域的映射。针对指示的读取阈值计算p值。显示了整个基因组的基因间和基因内组成。

（D） 基因内正常H3K36me2分布在t（4；14）中被废除+骨髓瘤细胞。KMS11（左；蓝）和TKO2（右；红）细胞中20910个注释基因的平均H3K36me2 ChIP信号。所有基因的转录体均归一化为15千碱基对（kb）。示意图中的箭头显示了TSS。

为了专门研究H3K36me2在基因体内的分布，在TKO2和KMS11细胞中测定了20910个注释基因中H3K365me2的平均信号。在TKO2细胞中，H3K36me2信号在启动子区域是适度的，在转录起始位点（TSS）附近达到峰值，并逐渐在下游衰减到远离TSS的转录体中(图3D，右侧插图；图S2C). 相反，在KMS11细胞中，H3K36me2富集的TSS近端区域不明显，平均基因单元中H3K365me2信号强度的总体差异很小(图3D，左侧插图；图S2C). TKO2细胞的结果与基于ChIP-ChIP的全基因组结合研究一致果蝇属H3K36me2分布(Bell等人，2007年). 因此，在哺乳动物细胞中，我们认为H3K36me2通常映射到基因体，并且t（4；14）驱动的NSD2过度表达破坏了H3K365me2的生理基因组组织。

NSD2促进转录

先前的研究表明NSD2是转录的负调控因子(Kim等人，2008年;Marango等人，2008年;Nimura等人，2009年)虽然H3K36me2通常与基因激活有关(Bannister等人，2005年;Kizer等人，2005年;Krogan等人，2003年). 为了研究NSD2与转录的关系，对KMS11细胞与TKO细胞之间以及稳定表达对照shRNA或两个独立的NSD2靶向shRNA的KMS11电池之间的基因表达进行了比较分析(图4A和S3A系列). 采用线性模型统计分析(Smyth等人，2003年)，NSD2的表达与大多数基因的上调相关，这些基因表现出统计上显著的表达变化(图4A和S3A系列). 实时PCR独立地证实了微阵列分析中确定的一些基因的差异表达(图S3B). 基于这些数据，我们得出结论，NSD2的表达与转录激活有关。

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NSD2激活KMS11细胞中的转录并促进致癌程序

（A） 靶向灭活t（4；14）相关基因导致NSD2耗竭NSD2型KMS11细胞中的等位基因与转录的整体下调相关。KMS11细胞与两种TKO细胞系的比较基因组表达谱。上图：TKO2与KMS11细胞差异表达基因的热图表示（n=3）。每个基因的数字表达值以中间值为中心，并按比例从−1.0（蓝色；低表达）到1.0（黄色；高表达）不等。底部：两个TKO细胞系之间差异表达基因的重叠。激活：KMS11/TKO细胞上调；抑制：KMS11/TKO细胞下调。p值：重叠的统计显著性。

（B） H3K36me2富集与基因表达之间的正相关被NSD2过度表达所抵消。根据（A）中描述的数据集的绝对表达单位，将20910个注释基因分为三组，在所示细胞系中平均H3K36me2分布。

（C） 在KMS11细胞中，H3K36me2水平在NSD2依赖性上调基因处升高。KMS11/TKO2细胞中前500个基因上调（A组：蓝色）和KMS11/TKO2细胞内前500个下调（B组：绿色）的所示细胞系中的平均H3K36me2谱。

（D） NSD2促进正常沉默基因的表达。上图：KMS11与TKO2细胞中20910个注释基因的绝对基因转录水平散点图。右侧显示了属于3个表达分位数类别（低、中、高）的A组（蓝色）和B组（绿色）基因的百分比。

（E） t（4；14）驱动的NSD2过度表达促进参与肿瘤形成途径的基因表达。使用p值截止值=0.1对A组和B组基因进行KEGG通路分析，并根据功能组内基因的百分比进行排序。

（F） t（4；14）中上调的基因+骨髓瘤细胞是多种癌症的共同特征。使用Q值截止值=0.05和比值比截止值=3，对不同癌症中基因过度表达的A组和B组基因进行肿瘤概念分析。按比值比排序的重要癌症概念。

（G） t（4；14）中上调的基因+骨髓瘤患者样本中KMS11细胞与NSD2共表达。表：多发性骨髓瘤研究联盟患者样本数据库中与NSD2表达正相关（276）或负相关（203）的基因数量，以及与A组和B组基因的重叠。p值：重叠的统计显著性。

（H） NSD2直接与靶基因结合。全国NSD2入住率的ChIP分析TGFA公司和PAK1KMS11和TKO2细胞中的基因。上图：两个基因的示意图。箭头表示TSS并对ChIP引物对的位置进行编号。中间：H3K36me2 ChIP-seq信号快照TGFA公司和PAK1在指定的细胞系中。底部：指示引物对处的NSD2 ChIP信号。用于控制ChIP的蛋白A珠。误差条表示3个实验的平均值（s.e.m.）的标准误差。

接下来，我们确定了NSD2介导的H3K36me2富集与基因表达水平之间的关系。使用从KMS11和TKO2细胞获得的表达谱，数据集中存在的20910个注释基因根据绝对表达水平分为高、中和低表达组，并确定每个组的平均H3K36me2分布。在TKO2细胞中，H3K36me2与基因表达之间存在明显的相关性：表达量最高的基因具有最高的H3K365me2信号，表达量最低的基因几乎没有H3K360me2富集(图4B，底部面板；图S3C). 这些结果提供了全基因组证据，证明H3K36me2在基因体上的定位与哺乳动物细胞中的转录水平呈正相关。

在KMS11细胞中，高H3K36me2信号与基因表达无关，表明H3K365me2不是转录严格要求的(图4B，顶部面板；图S3C). 然而，对细胞转录谱中t（4；14）依赖性变化的观察表明，在基因子集中，局部H3K36me2富集足以激活表达。因此，我们分析了H3K36me2在KMS11细胞中相对于TKO2细胞差异表达的基因中的分布，这些基因分为前500个上调基因（A组）或前500个下调基因（B组）。如所示图4C在KMS11细胞内，A组的平均H3K36me2信号高于B组，而在TKO2细胞内，B组的平均信号高于A组（另见图S3D). 这些发现表明，在KMS11细胞中，H3K36me2在一组不同基因上的富集与转录呈正相关（即a组与B组）。此外，比较KMS11和TKO2细胞中所有20910个基因的绝对表达水平的散点图显示，大部分a组基因在TKO2电池中表达水平较低(图4D). 总之，这些结果表明：（i）H3K36me2足以诱导转录，但不是必需的；（ii）在KMS11细胞中，NSD2介导的H3K365me2局部升高可诱导正常惰性基因的转录。

NSD2促进致癌基因表达程序

京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析用于描述与t（4；14）驱动的NSD2过度表达相关的生物信号通路。A组基因的顶级功能类别包括癌相关和细胞迁移信号通路(图4E). 相反，B组基因与免疫相关的B细胞功能相关(图4E). 此外，由A组而非B组基因组成的上调基因的特征与Oncomine概念数据库中存在的几种癌症的转录特征重叠(图4F). 最后，A组基因与骨髓瘤患者样本中与NSD2共同上调的基因有显著重叠(图4G和图S3E). 因此，KMS11细胞中NSD2过度表达可能会改变转录程序的平衡，使其偏离正常浆细胞基因表达途径，从而激活促进骨髓增生的途径。

接下来，使用系统的定量直接ChIP策略来确定a组基因是否是NSD2的直接靶标。在跨越四个癌基因的所有区域(TGFA公司,PAK1、MET、，和RRAS2（RRAS2）)KMS11细胞中H3K36me2信号大于TKO2细胞，KMS11的NSD2结合显著高于TKO2(图4H;图S3F). 总之，这些数据支持一种模型，即t（4；14）驱动的NSD2过度表达导致H3K36me2在正常沉默的癌相关基因处异常富集，从而触发这些癌基因的表达增加。

NSD2催化活性促进致癌位点的转录激活

为了测试NSD2甲基化活性在异常癌基因诱导中的特殊作用，我们根据与其他SET域蛋白的序列同源性筛选NSD2催化突变体(Dillon等人，2005年)(图S1A). NSD2蛋白含有文献中报道的几种氨基酸替换以灭活NSD2(Marango等人，2008年;Martinez-Garcia等人，2011年;Pei等人，2011年)保持稳健的甲基化活性(图S4A; 数据未显示）。相反，在氨基酸Y1092或Y1179（分别为Y1092A和Y1179A）处进行酪氨酸到丙氨酸的取代，可消除核小体的NSD2甲基化在体外(图5A). 为了模拟t（4；14）驱动的NSD2表达，建立了一个重建系统，其中TKO2细胞被NSD2补充重量，NSD2Y1092A型，或NSD2Y1179A型（命名为NSD2的细胞系重量，NSD2Y1092A型，或NSD2Y1179A型分别为；参见示意图图5B)将NSD2数量恢复到KMS11细胞中检测到的数量(图5C). 仅NSD2重量而非NSD2催化突变体，将全球H3K36me2信号重建为KMS11细胞中检测到的量(图5C).

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NSD2催化活性是致癌位点转录激活所必需的

（A） 无催化活性NSD2突变体的鉴定。顶部：的自动射线图在体外NSD2甲基化检测SET（设置）以及天然核小体上的两个突变体（Y1092A和Y1179A）。NSD2考马斯染色SET（设置）蛋白质（中间面板）和核小体（底部面板）如图所示。

（B） NSD2细胞重建系统示意图。全长NSD2或无催化活性的NSD2（NSD21092a年和NSD2Y1179A型)通过慢病毒转导引入TKO2细胞。

（C） TKO2细胞与NSD2的互补重量但非催化活性NSD2可将全球H3K36me2水平提高至KMS11水平。对KMS11细胞、TKO2细胞和用野生型或催化非活性NSD2稳定转导的TKO2电池的WCE进行Western分析。

（D和E）TKO2细胞与NSD2的互补重量但不使用催化突变体增加靶癌基因的H3K36me2水平并激活这些基因的表达。（D） 在以下位置对NSD2占用率（顶部；y轴：%输入）和H3K36me2信号（底部；y轴为H3K365me2/H3）进行ChIP分析：图4H和S3F系列:TGFA公司(#4),遇见(#2),PAK1（#2）和RRAS2（RRAS2）(#5). 误差条表示3个实验的s.e.m。（E） 启动子区H3K4me3水平的ChIP分析（顶部）和（D）中基因的mRNA转录物的定量RT-PCR分析（底部）。

在染色质处，t（4；14）相关NSD2靶基因的NSD2占有率TGFA公司,遇见,PAK1和RRAS2（RRAS2）在NSD2中进行了部分至完全重组重量，NSD2Y1092A型，或NSD2Y1092A型细胞系(图5D). 然而，只有NSD2重量而不是催化突变体，将四个基因的H3K36me2 ChIP信号重建到接近KMS11细胞中观察到的水平(图5D). 此外，NSD2结合和H3K36me2升高的同时发生与H3K4me3启动子的富集和NSD2靶基因的转录有关(图5E). 这些数据进一步支持H3K36的NSD2二甲基化在激活转录中的直接作用，并认为NSD2过度表达可以改变染色质的状态，从惰性形式变为活性形式，从而促进转录。

具有催化活性的NSD2恢复t（4；14）阴性骨髓瘤细胞的致瘤性

与TKO2细胞相比，KMS11细胞在非凤尾鱼依赖的环境中增殖更快，生长更适宜(Lauring等人，2008年). 此外，与对照细胞相比，RNAi介导的NSD2缺失KMS11细胞的增殖减弱，表明NSD2剂量调节癌细胞表型(图S4B). 与RNAi结果一致，TKO2细胞与NSD2互补重量而非NSD2催化突变体增加了细胞增殖率，以匹配KMS11细胞的增殖率(图6A). 此外，NSD2重量细胞，但不是TKO2和NSD2Y1179A年细胞，在甲基纤维素中形成菌落（测量凤尾鱼非依赖性生长），其效率与KMS11细胞相当(图6B).

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催化活性NSD2赋予t（4；14）致瘤性−阴性细胞

（A） 与NSD2互补重量但非催化活性的NSD2可加快TKO2细胞的增殖速度。在9天内测定了所示行中的细胞数。误差条表示来自3个独立实验的s.e.m。

（B） TKO2细胞与NSD2的互补重量但不适用于NSD2Y1179A型促进锚定植物的独立生长。显示了所示细胞系在甲基纤维素中生长菌落的能力。条形图显示播种后21天每个田地的菌落数。误差条表示3个独立实验的s.e.m。

（C和D）催化活性的NSD2赋予异种移植瘤形成和侵袭t（4；14）阴性细胞的能力。（C） KMS11、TKO2、NSD2和NSD2Y1179A型通过腹腔注射将稳定表达GFP-荧光素酶生物标记物的细胞系导入SCID/米色小鼠。上图：使用抗GFP抗体对WCE进行西方分析。总H3显示为负载控制。中间：第28天两个独立实验中的荷瘤小鼠数量。底部：注射4周后小鼠的典型生物发光图像。（D） 通过静脉尾静脉注射将（C）中的细胞系导入未经照射的SCID/米色小鼠。上图：西方对WCE的分析，如（C）所示。中间：第28天的荷瘤小鼠数量。底部：注射4周后小鼠的典型生物发光图像。

采用小鼠异种移植模型系统评估NSD2甲基化活性在肿瘤形成中的作用体内SCID/米色小鼠腹腔注射KMS11、TKO2、NSD2重量，和NSD2Y1179A型稳定表达GFP-荧光素酶生物标记物的细胞体内活细胞成像(Creusot等人，2008年). 注射后28天-在两个独立实验和多个小鼠中-KMS11和NSD2重量细胞在腹腔内形成肿瘤，而TKO2和NSD2Y1179A年细胞无法生长(图6C). 在骨髓瘤病中，骨髓（BM）室中恶性浆细胞的增殖最终会压倒并破坏正常的BM功能(安德森和卡拉斯科，2011年). 通过静脉注射生物标记细胞系，在未经辐射的SCID/米色小鼠中测定了NSD2在BM接种和侵袭中的作用。在多只小鼠中，来自TKO2和NSD2的信号Y1179A型注射后一周未检测到细胞(图6D和S4C系列). 相反，在KMS11细胞的5/5注射和NSD2的4/5注射中重量细胞，随着时间的推移，信号变得更强，并且与植入股骨和骨盆等主要骨骼BM中的细胞一致(图6D;图S4C). 骨髓切片的免疫组织化学染色证实股骨骨髓腔内存在KMS11细胞（数据未显示）。因此，我们得出结论，具有催化活性的NSD2直接促进肿瘤生长体内.

NSD2是一种普通癌蛋白

对Oncomine数据库中正常与癌症基因表达数据集的比较分析显示，NSD2转录在许多癌症中优先且显著上调(图7A和7B). 此外，RNAi介导的NSD2缺失降低了HT1080纤维肉瘤和U2OS骨肉瘤细胞系的增殖率(图S4D). 因此，除了t（4；14）+骨髓瘤，NSD2可能有助于其他癌症类型的发展。的确，在t（4；14）中−KMS12-PE和U266骨髓瘤细胞系，与t（4；14）相比，NSD2和H3K36me2的含量更低+单元格(图S4E)，NSD2的表达重量，但不是NSD2Y1179A型，增加了（i）全球H3K36me2水平(图7C)，（ii）细胞增殖率(图7D)以及（iii）相对于亲代细胞系，细胞在非依赖于凤尾鱼的条件下生长的能力(图7E). 因此，t（4；14）中NSD2表达增加−细胞系促进癌相关细胞表型。

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NSD2是一种致癌蛋白，有助于多种癌症的致瘤性

（A） 和（B）存在于Oncomine数据库中的多种癌症中的NSD2上调。（A） 在Oncomine数据集中，NSD2相对于具有>3倍变化和p值<0.05的截止值的对照组有差异表达。红色：上调；蓝色：下调。（B） 方框图显示（从上到下）最大值，75第个百分位数，中位数，25第个与正常（N）组织相比，癌症（C）组织（灰色）中NSD2上调的15个代表性数据集的百分比和最小值。A、 皮肤黑色素瘤；B、 乳腺导管癌；C、 皮肤鳞状细胞癌；D、 浸润性膀胱尿路上皮癌；E、 肺腺癌；F、 皮肤鳞状黑色素瘤；G、 胃肠型腺癌；H、 胃混合腺癌；一、 食管腺癌；J、 卵巢浆液性囊腺癌；K、 急性髓系白血病；五十、 纤维肉瘤；M、 恶性纤维组织细胞瘤；N、 滑膜肉瘤；O、 平滑肌肉瘤。

（C） 与NSD2互补重量但非催化活性NSD2增加t（4；14）中的全球H3K36me2水平−骨髓瘤细胞。西方从t（4；14）分析WCE−NSD2稳定转导的KMS12-PE（左）和U266（右）细胞株重量，NSD2Y1179A型或空病毒。

（D） 和（E）NSD2，但不是NSD2Y1179A型增加t（4；14）的增殖和非锚固生长−骨髓瘤细胞。（C）中细胞系的生长曲线测定如下图6A.（E）细胞系的甲基纤维素集落形成分析，如图6B。（D）和（E）的误差线表示至少3个独立实验的标准偏差。

（F） NSD2但非NSD2Y1179A年促进p19的致癌转化ARF−/−MEF公司。左图：第19页WCE的西方分析ARF−/−与NSD2稳定转换的MEF重量，NSD2Y1179A年或空病毒。右：每个细胞系在甲基纤维素中形成的菌落数。误差条表示3个独立实验的s.e.m。

（G和H）NSD2增加H3K36me2 at和表达福斯,免疫球蛋白2,图、和Mdk公司在第19页ARF−/−MEF公司。（G） 所示基因转录水平的定量RT-PCR分析。（H） 所示基因转录体中的H3K36me2 ChIP。误差条表示3个实验的s.e.m。

小鼠原代细胞可以通过两种基因“命中”进行转化：要么失去一个抑癌基因，同时激活一个癌基因，要么激活两个癌基因(Land等人，1983年). 因此，候选癌基因的转化活性可以在已经遭受首次打击的原代细胞中进行测试，例如p19的缺失农业研究基金肿瘤抑制剂。因此，我们测试了NSD2的能力重量和NSD2Y1179A型转换p19农业研究基金敲除小鼠胚胎成纤维细胞（p19ARF−/−MEF）。NSD2的表达重量导致H3K36me2的全球水平高于对照组和NSD2Y1179A型-表达细胞(图7F和图S4F). 引人注目的是，NSD2重量-表达p19ARF−/−MEF有效地在甲基纤维素中形成菌落，而对照组和NSD2Y1179A型-表达细胞没有(图7F;图S4F). 据我们所知，NSD2是在这一原型转化实验中唯一表现出类似经典癌基因的PKMT。

NSD2的全基因组基因表达谱重量-表达p19ARF−/−MEF显示，与对照组和NSD2相比，一些与癌症相关的基因表达更高Y1179A型-表达p19ARF−/−MEF公司(图S4G)经实时PCR证实福斯,免疫球蛋白2,图、和Mdk公司基因(图7G). 转录体中的H3K36me2信号福斯,免疫球蛋白2,图、和Mdk公司反映了表达模式，在NSD2中较高重量-表达细胞比对照组和NSD2Y1179A型-表达细胞(图7H). 总之，我们的结果表明，在p19中ARF−/−MEF与骨髓瘤细胞一样，NSD2驱动的H3K36me2升高调节促进细胞转化的转录程序。

讨论

NSD2染色质生理酶活性的阐明

尽管临床证据支持NSD2在t（4；14）病因中的作用+多发性骨髓瘤、NSD2的酶活性及其与癌症发展的关系尚不清楚(Chng等人，2007年). 正确分配NSD2等酶的催化特异性对于理解组蛋白修饰如何调节染色质以及开发基于表观遗传学的治疗MM等疾病的药物至关重要，关于NSD2的酶和染色质调节功能的错误结论可能会阻碍识别治疗t（4；14）的药物的进展+骨髓瘤。在这里，我们证明了NSD2在染色质处的主要甲基化活性是H3K36me2的生成，并且该活性驱动NSD2相关的致癌程序。

我们的发现与研究报告一致在体外NSD家族三个成员NSD1、NSD2和NSD3/WHSC1L1在H3K36的二甲基化活性(Li等人，2009年). 然而，我们的结果与最近一项基于免疫印迹分析的研究结论相冲突，即NSD2三甲基化物H3K36(Nimura等人，2009年)，我们没有检测到的活动。针对Kme3表位的抗体经常与二甲基物种发生交叉反应(Egelhofer等人，2011年;Fuchs等人，2011年)，对免疫印迹特异性的错误解释可能导致错误结论，即NSD2是H3K36三甲化酶(Nimura等人，2009年). 事实上，H3K36me2和H3K365me3之间的功能差异具有重要的临床意义。我们发现NSD2是一种癌蛋白，它在多种细胞类型中产生大量H3K36me2(图2B和2D). 相反，SETD2在不同细胞中合成大量H3K36me3(Bell等人，2007年;Edmunds等人，2008年)，在透明细胞肾细胞癌中起肿瘤抑制作用(Dalgliesh等人，2010年;Duns等人，2010年). 因此，H3K36的甲基化状态（me2与me3）可能将该残基的修饰与显著不同的功能后果联系起来，并突显出通过组蛋白甲基化的细微变化可以实现的精细的生物调控水平。

NSD2最近被报道在肿瘤抑制ATM激酶DNA损伤反应通路中发挥作用(Pei等人，2011年). 作者声称NSD2二甲基化物H4K20在体外在ATM介导的细胞对DNA损伤的反应中，这种活性介导53BP1在DNA损伤灶的定位和功能。然而，类似NSD2的癌蛋白是典型ATM肿瘤抑制途径中的关键成分，这是违反直觉的。此外，利用多种方法，我们观察到H4K20处NSD2没有甲基化活性(图1A–E，1G,2A、2B,S1B、S1C、S1E; 数据未显示）。因此，虽然推测NSD2在DNA修复途径中的作用很有趣，但它并不是通过H4K20直接甲基化发生的。

NSD2在核小体上的活性远高于游离组蛋白（数据未显示），然而，H3K18和H4K44的两种甲基化活性（与H3K36具有高度序列相似性(图S5A; 数据未显示）–NSD2在游离组蛋白上催化，但在核小体上不催化（数据未显示(Li等人，2009年)). 这两项辅助活动的功能相关性尚不明确，需要进一步调查。最后，根据质谱分析，NSD2亚型RE-IIBP被报告为甲基化H3K27(Kim等人，2008年). 然而，研究中甲基化事件引起的质量偏移与甲基部分的正确质量不相符。我们的分析表明，NSD2和RE-IIBP均为二甲基H3K36，但不使用H3K27作为底物(图1C、1D、1E,S1C、S1D). 总之，通过使用生物化学、蛋白质组学和细胞方法，我们的结果不支持之前的说法，即H3K4、H3K27和H4K20是NSD2的底物位点，提供了令人信服的证据，表明针对NSD2抑制的治疗应侧重于H3K36二甲基化，作为该酶在核小体上的唯一活性。

NSD2致癌程序的机制

单克隆丙种球蛋白病（MGUS）是一种无症状的癌前疾病，在50岁以上的人群中检测到3%，其发展为MM的年平均风险为1%(Chng等人，2007年). MGUS患者的一个子集是t（4；14）+，这表明NSD2过度表达可能会引发骨髓成像，这些患者可能具有向骨髓瘤转化的高风险(Chng等人，2007年). 我们认为NSD2的病理性过表达——通过改变H3K36me2的全基因组图谱——导致正常沉默基因的局部染色质松弛，进而选择有利于浆细胞转化的基因表达程序(图S5B). 例如，癌症相关基因PAK1在t（4；14）中通常是无声的−但在KMS11细胞中有较高的表达。我们的模型认为，增加NSD2水平会导致随机NSD2结合和H3K36me2生成PAK1该基因足以通过一种尚待确定的机制促进转录。除了像PAK1，NSD2还将刺激与肿瘤发生无关的基因的转录。然而，随着时间的推移，将选择有利于细胞增殖和存活的蛋白质表达，从而构成骨髓瘤细胞中NSD2相关上调基因的大多数。

t（4；14）的能力−在小鼠中形成异种移植物肿瘤的细胞是由具有催化活性的NSD2的表达所赋予的(图6). 此外，NSD2在不同类型的癌症中表达升高(图7A和7B)据我们所知，在经典的原发性MEF转化试验中，只有PKMT可以作为癌基因(图7F). 与赋予TKO2细胞致瘤性的作用一样，NSD2介导的MEF转化机制是H3K36me2依赖性的。总之，我们的结果表明，NSD2介导的H3K36me2组织的破坏可能会促进许多细胞类型的致癌编程，并且抑制这种酶可能对多种癌症具有广泛的治疗效果。

实验程序

材料

重组酶（NSD2SET（设置），G9ASET（设置）、SET8、SETD2SET（设置）)表示为大肠杆菌Sf9细胞中的全长NSD2蛋白。H3氨基酸1-42被克隆到pGEX-6P1中，具有指定的取代基。描述了NSD2抗体(Lauring等人，2008年;Li等人，2009年). 甲基化分析、定量质谱、微阵列基因表达、ChIP-seq协议和数据分析在扩展实验程序中进行了详细描述。

异种移植小鼠模型

将稳定表达GFP-荧光素酶融合蛋白的10^6细胞直接注入SCID/米色小鼠的腹腔或尾静脉。每周通过生物发光成像测量肿瘤生长。所有小鼠均按照斯坦福大学AAALAC批准的指南进行治疗（方案编号：15066）。

数据访问

原始数据已提交给NCBI基因表达总署（GEO），注册号为GSE29305。基因组浏览器轨迹和与本文相关的其他数据可在http://dldcc-web.brc.bcm.edu/lilab/NSD2/

​

集锦

  1. H3K36的二甲基化是NSD2的主要染色质调节活性
  2. NSD2通过H3K36me2催化促进转录和细胞转化
  3. NSD2将H3K36me2的基因组解体与致癌编程联系起来
  4. NSD2催化活性是t（4；14）+骨髓瘤细胞致瘤性所必需的。

补充材料

01

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致谢

我们感谢D.Reinberg提供的NSD2和SETD2抗体。这项工作得到了NIH向O.G.（R01 GM079641）、W.L.（U01DA025956）和B.A.G.（DP2OD007447）、葛兰素史克向OG、DOD向W.L（PC094421）、ASMS研究奖和NJCCR SEED向B.A.G的拨款的部分支持，基因泰克基金会a.J.K.博士前奖学金和国家科学基金会B.M.Z.W.L.奖学金获得邓肯学者奖。O.G.是埃里森老龄问题高级学者奖的获得者。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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