结果
K-Ras转化增强小鼠成纤维细胞糖酵解通量并降低氧化TCA循环通量
我们之前已经证明转化的NIH3T3小鼠成纤维细胞表达致癌K-Ras蛋白(G12V)(Shih等人,1981年;Pulciani等人,1982年;Bossu等人,2000年)与永生NIH3T3小鼠成纤维细胞相比,表现出对葡萄糖利用率的敏感性增加,线粒体功能降低,与复合物I活性和蛋白质水平降低相关,以及在葡萄糖、谷氨酰胺或半乳糖缺乏时增殖减少(Chiaradonna等人,2005年,2006年a;Gaglio等人,2009年;Baracca等人,2010年). NIH3T3细胞是一种具有良好遗传特性的永生化细胞系,长期以来一直被认为是研究细胞转化的“正常”细胞模型,因为与等基因转化细胞系相比,这些细胞受到接触抑制,在软琼脂中不生长,并且在免疫受损小鼠中不形成肿瘤(Bossu等人,2000年).
因此,我们进行了基本的代谢分析,以比较NIH3T3细胞(正常,N)和NIH3T_K-Ras(转化,T)54 h(T型54)电镀后。之所以选择这个时间点,是因为它对应于两个细胞系开始显示不同增殖能力的时间(Chiaradonna等人,2006b). 如所示测定细胞特异性葡萄糖(Glc)和谷氨酰胺(Gln)消耗量以及乳酸(Lac)和麸胺酸(Glu)分泌量。在T细胞中观察到Glc摄取和Lac生成显著增加(),与链接的其他报告一致ras(拉斯维加斯)有氧糖酵解突变(Elstrom等人,2004年;Vizan等人,2005年). 虽然以前的研究表明其他类型的癌细胞株对谷氨酰胺的摄取增加(Yueva等人,2007年;怀斯等人,2008年;Gao等人,2009年),我们没有检测到两个细胞系之间Gln摄取和Glu分泌的任何显著变化。为了进一步定义N细胞和T细胞代谢,我们通过目标代谢组学分析确定了各种细胞内氨基酸和有机酸的相对丰度(). 值得注意的是,与糖酵解和生物合成过程相关的代谢物在T细胞中大量存在,包括丙酮酸(Pyr)、Lac、柠檬酸(Cit)和天冬氨酸(Asp)。另一方面,TCA循环中间产物,如α-酮戊二酸(AKG)、琥珀酸(Suc)和富马酸(Fum),主要来源于氧化代谢,在T细胞中的含量低于N细胞。
K-Ras转化的成纤维细胞解耦糖酵解和TCA循环。(一)生长54小时的N和T细胞对Glc、Lac、Gln和Glu的细胞外摄取和分泌。(B类)用GC/MS测定N细胞和T细胞中的相对代谢物丰度(C类)用1:1混合物培养的N细胞和T细胞中Cit和Glu的M2标记-13C] 葡萄糖和[U-13C类6]葡萄糖。(D类)[U存在下培养细胞中天冬氨酸的质量同位素分布(MID)-13C类5]谷氨酰胺。误差条表示s.e.m(n个=3). (E类)使用[U标记M3-M4天冬氨酸涉及的代谢途径示意图13C类5]谷氨酰胺示踪剂。在该方案中,代表了参与这些代谢途径的关键细胞质和线粒体酶。(F类)在N细胞系和T细胞系中,参与方案(E)中所述途径的一些基因的绝对表达值。收集生长在25 mM Glc+4 mM Gln(正常培养基)中的两个细胞系,在两个不同的时间点(48和72小时)进行转录分析。基因缩写列表见补充信息.
同位素示踪剂提供了确定底物对特定代谢途径的相对贡献的有效手段,质谱能够量化每个代谢物池中同位素标记数不同的分子的相对丰度(即M0、M1、M2……其中M2丰度包括所有具有两个同位素标记的分子13C标记原子)。例如,统一标记的Glc([U-13C类6]葡萄糖)转化为M3 Pyr(三个13C原子)和随后M2 Cit通过丙酮酸脱氢酶和柠檬酸合成酶的联合作用。同样,M2 Cit沿着TCA循环进行,通过TCA循环相关反应(即转氨作用和还原胺化作用;补充图S1). 我们在以下条件下培养N和T细胞13C-标记葡萄糖,并通过气相色谱/质谱(GC/MS)量化Cit和Glu的质量同位素分布(MID)。这些数据表明,T细胞将较少的Glc碳氧化为Cit和Glu,可能会将更多的Pyr转化为Lac,正如在这些代谢物中观察到的M2标记显著减少所证明的那样().
与Glc氧化减少的观察结果一致,平行[U-13C类5]谷氨酰胺标记实验表明,T细胞中Gln碳对代谢中间体合成(如Asp)的利用率增加。我们特别观察到M3和M4天冬氨酸丰度相对增加()分别由异柠檬酸脱氢酶还原羧基化下游的M5 AKG和氧化戊二酸脱氢酶生成(补充图S2). 这些结果支持这样一种观点,即进入T细胞TCA循环的Gln可能遵循典型的正向氧化反应和还原羧基化反应(Yoo等人,2008年). 此外,鉴于天冬氨酸在氨基酸和核苷酸合成中的重要作用,这些结果表明T细胞在生物合成中强烈依赖谷氨酰胺碳(Weinberg等人,2010年).
单凭质量同位素数据,对细胞代谢的了解就有点有限。为了在系统水平上更好地描述N细胞和T细胞的代谢,我们将细胞外摄取和分泌结果与用[U-13C类5]谷氨酰胺。利用这些数据,我们使用基于基本代谢单元(EMU)的方法估计了每种细胞类型的细胞内流量13C代谢通量分析(MFA)算法(Young等人,2008年). 在获得可接受的拟合后,我们进行了敏感性分析,为网络中的每个通量生成95%的置信区间(Antoniewicz等人,2006年;Antoniewicz等人,2007年). N和T电池的通量结果列于,中提供了完整的数据集和模型描述补充信息和补充图S3和S4这些数据表明,转化诱导了中心碳代谢的显著重组。T细胞将通过PDH复合体的通量减少约50%(即Pyr→AcCoA的通量值麻省理工学院+CO公司2). 此外,整个TCA循环中的净通量减少了相同的数量。这两种细胞类型之间的置信区间没有重叠,证明了每一种变化都非常显著。虽然TCA循环可逆反应中的大多数交换通量无法准确测定,但我们观察到通过IDH或苹果酸酶的还原通量没有显著变化。使用培养细胞的标记数据进行MFA时,观察到代谢通量的一致变化13C-葡萄糖(参见补充信息但使用这些示踪剂时,一些通量(例如IDH交换通量)的可观测性显著降低。这些发现提供了证据,证明转化导致细胞糖酵解与TCA循环解耦,TCA循环内氧化反应活性总体降低。
表1
利用[U-13C类5]谷氨酰胺作为示踪剂
反应 | 正常
| 转化
| 电话号码 |
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| 通量 | 置信区间 | 通量 | 置信区间 | |
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有关详细描述、假设、完整结果和数据,请参阅补充信息净通量:(νF类−υR(右))(→)和交换通量:min(νF类,υR(右)) (↔). 为了简洁起见,省略了一些标度和未确定的交换通量(即无限置信区间Inf)。通量比较(转换与正常)描述为U=向上,D=向下,NC=无变化,ND=不可检测。焊剂已列出×1014mol/(细胞×h)。 |
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糖酵解
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谷氨酸提取→ G6P公司 | 65.5 | 61.2, 69.9 | 83.1 | 77.6, 88.6 | U型 |
G6P→F6P | 62.5 | 58.2, 66.9 | 82.1 | 77.6, 87.6 | U型 |
G6P公司↔六楼 | 4.1 | 0.0,信息 | 18.6 | 0.0,信息 | ND(无损检测) |
F6P→DHAP+间隙 | 64.2 | 59.9, 68.5 | 82.4 | 76.9, 88.0 | U型 |
DHAP→GAP | 64.2 | 59.9, 68.5 | 82.4 | 76.9, 88.0 | U型 |
DHAP公司↔间隙 | 36.7 | 0.0,输入 | 13.1 | 0.0,信息 | ND(无损检测) |
间隙→3PG | 129.2 | 120.6, 137.9 | 165 | 154.0, 176.1 | U型 |
间隙↔第三方集团 | 0 | 0.0,信息 | 0 | 0.0,信息 | ND(无损检测) |
3PG→Pyr | 129.2 | 120.6, 137.9 | 165 | 154.0, 176.1 | U型 |
Pyr→Lac | 114.9 | 105.9, 123.4 | 158.1 | 146.9, 169.2 | U型 |
梨↔拉克 | 300.5 | 0.0,信息 | 9.2 | 0.0,信息 | ND(无损检测) |
紫胶→紫胶提取 | 114.9 | 105.9, 123.4 | 158.1 | 146.9, 169.2 | U型 |
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戊糖磷酸途径
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6PG→P5P+CO2 | 3 | 2.71, 3.29 | 1 | 0.90, 1.10 | D类 |
P5P+P5P→S7P+GAP | 0.83 | 0.73, 0.93 | 0.17 | 0.13, 0.20 | D类 |
S7P+间隙→F6P+E4P | 0.83 | 0.73, 0.93 | 0.17 | 0.13, 0.20 | D类 |
P5P+E4P→F6P+间隙 | 0.83 | 0.73, 0.93 | 0.17 | 0.13, 0.20 | D类 |
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TCA循环
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梨麻省理工学院+合作2→ 办公自动化 | 0 | 0.0, 3.2 | 0 | 0.0, 1.9 | 数控 |
Mal→Pyr麻省理工学院+CO公司2 | 1.8 | 0.9, 5.9 | 1.8 | 0.7, 4.7 | 数控 |
马尔↔梨麻省理工学院+CO公司2 | 2.8 | 0.0, 3.2 | 1.6 | 0.0, 1.9 | 数控 |
梨麻省理工学院→ AcCoA公司麻省理工学院+合作2 | 16.1 | 13.5, 19.1 | 8.6 | 7.6, 9.6 | D类 |
AcCoA公司麻省理工学院+OAA→Cit | 16.1 | 13.5, 19.1 | 8.6 | 7.6, 9.6 | D类 |
Cit→AKG+CO2 | 10.1 | 9.1, 11.2 | 5.4 | 4.9, 6.0 | D类 |
Cit公司↔AKG+CO公司2 | 3.3 | 2.7, 3.9 | 3.7 | 3.2, 4.2 | 数控 |
AKG→Suc+CO2 | 12.1 | 10.6, 13.7 | 7.4 | 6.1, 8.7 | D类 |
Suc→Fum | 12.1 | 10.6, 13.7 | 7.4 | 6.1, 8.7 | D类 |
成功↔烟气 | 37.2 | 0.0,信息 | 0 | 0.0, 1.5 | ND(无损检测) |
Fum→Mal | 12.1 | 10.6, 13.7 | 7.4 | 6.1, 8.7 | D类 |
福姆↔马尔 | 0 | 0.0,输入 | 42 250 | 1.5,信息 | ND(无损检测) |
Mal→OAA | 10.3 | 6.7, 11.3 | 5.6 | 3.5, 6.1 | D类 |
马尔↔办公自动化 | 36.2 | 0.0,信息 | 57 630 | 3.2,信息 | ND(无损检测) |
Pyr→Pyr麻省理工学院 | 14 | 12.0, 17.0 | 7 | 6.0, 8.0 | D类 |
梨↔梨麻省理工学院 | 74 | 39.0, 133 | 276 | 87.0, 4566 | U型 |
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谷氨酰胺代谢
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格林提取→ 格林 | 20 | 19.0, 22.0 | 16 | 15.0, 17.0 | D类 |
Gln→Glu | 20 | 19.0, 21.0 | 16 | 15.0, 17.0 | D类 |
Glu→Glu提取 | 18 | 16.0, 19.0 | 14 | 12.0, 15.0 | D类 |
Glu→AKG | 2 | 1.0, 3.0 | 2 | 1.0, 3.0 | 数控 |
谷氨酸↔AKG公司 | 168 | 115, 341 | 202 | 106, 1895 | U型 |
梨麻省理工学院+谷氨酸→丙氨酸+AKG | 0.15 | 0.13, 0.16 | 0.15 | 0.14, 0.17 | 数控 |
OAA+Glu→Asp+AKG | 0.18 | 0.16, 0.20 | 0.18 | 0.16, 0.20 | 数控 |
N和T成纤维细胞的转录谱与代谢通量分析基本一致
各种报道表明癌基因改变了编码代谢酶的基因的表达(Mathupala等人,1997年;Zhong等人,1999年). 为了鉴定致癌K-Ras依赖性转录效应,我们对如上生长48和72小时的N和T细胞进行了微阵列转录谱分析。
这些数据由中的热图表示补充图S5表明糖酵解投资阶段的几个基因(香港1号和Pfkp公司)以及Pfkfb 2号机组,三和4通过调节果糖-2,6-二磷酸水平变构控制6-磷酸果糖-1-激酶,其在T细胞中的表达水平始终低于N细胞(补充图S5A)(绿色)。此外,五个编码糖酵解酶的基因(Gpi1号机组,Pfkl公司,Pfkm公司,阿尔多A和税收优惠1)与N细胞(红色)相比,T细胞高表达(补充图S5A). 此外,还观察到与糖酵解(生成ATP)的支付阶段有关的基因的高表达。事实上,在48和72小时这两个时间点,几乎所有这一阶段的基因在T细胞中的表达水平都高于N细胞(Gapdh公司,第1页,Eno1公司,Eno2公司,平方公里,利达和Ldhb公司).
与我们观察到的TCA流量减少一致,三个编码激酶的基因抑制PDH酶复合物活性(预测值k1,Pdk3,和预测值k4)在T细胞中显著表达(补充图S5B). 此外奥格德,编码氧戊二酸脱氢酶复合物的一个亚基,也是TCA循环的另一个关键控制点,在T细胞中减少(补充图S5B). 相反,少数编码TCA循环阳性调节因子的基因,如Aco2公司,苏格拉2和成功2,以及同上2能够催化AKG的还原羧基化,在分析的整个时间窗口内,T细胞中的表达水平高于N细胞(补充图S5B). 总之,这些结果表明,致癌K-Ras调节的许多基因可能会驱动观察到的代谢重编程,尽管我们不能排除其他机制(如翻译后修饰、质量作用和变构酶调节)的可能性也参与观察到的转化细胞的代谢变化。
谷氨酰胺进入TCA循环的转录分析
以前的实验()与N细胞相比,Gln在T细胞中对细胞生物量前体(例如天冬氨酸)的贡献更大,尽管观察到摄取量略有下降。这些发现与其他报告一致,这些报告描述了Myc通过谷氨酰胺水解(部分通过参与Gln摄取和代谢的基因表达介导)增加Gln的使用(怀斯等人,2008年;Gao等人,2009年). 为了研究这一特征,我们分析了与谷氨酰胺摄取和代谢有关的编码酶基因的表达,特别注意那些与代谢途径有关的能够产生天冬氨酸的酶。如所示天冬氨酸可由细胞质和线粒体中的谷氨酰胺通过AKG通过氧化脱羧和还原羧基化产生。Gln通过高亲和力谷氨酰胺受体进入细胞Slc1a5系列并通过谷氨酰胺酶代谢为谷氨酸(Gls公司) (). 随后,谷氨酸可通过细胞质和线粒体天冬氨酸和丙氨酸转氨酶的转氨酶活性转化为AKG(得到1和得到2和Gpt1号机组和Gpt2公司或通过谷氨酸脱氢酶依赖的氧化脱氨基(粘合1) (). 如所示,Slc1a5系列,Gls1、,和粘合1与N细胞相比,在T细胞中持续表达水平较低(约为2倍)。相反地,得到1和2,表现出相反的行为,与N细胞相比,T细胞中的这两个基因略微上调。这些转录变化可能部分证明了Gln摄取量的轻微减少(例如Slc1a5系列在转化细胞中),如所示并通过分析,AKG通过氧化代谢生成标记的M4-Asp的相关作用(另请参见和补充图S5). 此外,在T细胞中同上2(补充图S5)尤其是Acly公司其水平至少是N细胞的两倍()与前面显示的增加的M3天冬氨酸标记一致。然而,虽然转录数据在很大程度上与谷氨酰胺摄取量的减少及其用于生物合成相一致,但并非所有代谢通量都只在转录水平上进行调节。
转化细胞在生物合成过程中增加谷氨酰胺氮的使用
为了进一步研究Gln在细胞生物合成中的作用,我们使用氨基标记的谷氨酰胺([α-15N] 谷氨酰胺),以确定和量化含有谷氨酰胺衍生氮的代谢物。该方法能够检测和定量示踪剂底物下游所有可观察到的代谢物中的标记(Hiller等人,2010年). 细胞需要氮原子来构建分子,如核苷酸、氨基酸、氨基糖,其中Gln和Glu代表细胞的主要氮储存库。Gln的氨基氮保留在Glu上,并在转氨酶反应中用作氮供体。正如预期的那样,NTFD算法识别出了许多氨基酸和相关化合物,这些氨基酸和化合物在[α-15N] 谷氨酰胺示踪剂,包括Glu、Ala、Asp和5-oxoproline(5-oxo)(). 除了天冬氨酸外,这些代谢物中的每一种在T细胞中的标记都比在N细胞中更显著。此外,我们观察到,M1和M2标记在核碱基腺嘌呤上,由[α-15N] 与N对照细胞相比,天冬氨酸中谷氨酰胺衍生的氮原子在T细胞中高出2–3倍().
用NTFD分析鉴定与[α]培养的细胞中的标记代谢物-15N] 谷氨酰胺54小时(一)N中氨基酸及其衍生物代谢物的M1标记(□)和T(▪) 细胞。(B类)N中游离腺嘌呤中观察到M1和M2标记(□)和T(▪) 细胞。(C类)参与N(蓝线)和T(红线)细胞系Gln代谢的基因的热图,以及在正常培养基中生长并在两个不同时间点(1=48 h和2=72 h)收集的两个细胞系之间的相应比率(T/N)。(D类)N(蓝线)和T(红线)细胞系嘌呤代谢相关基因的热图,以及在正常培养基中生长并在两个不同时间点(1=48 h和2=72 h)收集的两个细胞系之间的相应比率(T/N)。颜色刻度条表示标准化的表达式强度(对数刻度);尤其是绿色低表达,红色高表达,黑色无变化表达。当比率为⩾1.1时,比率值表示为上色,当比率为\10877; 0.9时表示为下绿色,当比率在0.9和1.1之间时表示为无变化的黄色。基因缩写列表见补充信息.
用[α]进行NTFD分析的转录数据支持结果-15N] 谷氨酰胺。N细胞和T细胞的绝对基因表达值及其比率(T/N比率),如所示,补充表S1,强调与T细胞中谷氨酰胺利用密切相关的基因的高表达。尤其是谷胱甘肽代谢相关基因的表达(例如。,全球供应链,Gclm公司)、己糖胺代谢(例如。,Gfpt1型)和核苷酸生物合成(例如。,计算机辅助设计,广告、和Adsl公司)与N细胞相比,T细胞增加。如下游代谢物5-氧标记所示,这些转录变化表明谷胱甘肽途径活性增加,核苷酸合成增强()以及M1和M2在核碱基腺嘌呤上的标记(). 在这方面,对嘌呤代谢相关基因的详细分析()与N细胞相比,T细胞中的表达更持久。总之,与N细胞相比,这些发现进一步表明了Gln在支持T细胞合成代谢过程中的主要作用。
K-Ras转化的人类细胞表现出与小鼠转化细胞相似的代谢变化
为了测试人类癌细胞是否表现出与之前描述的小鼠转化模型相似的代谢变化,我们接下来试图将我们的代谢和转录分析扩展到表达活化K-Ras蛋白(G13D)的MDA-MB-231人类乳腺癌细胞系。为了评估MDA-MB-231细胞的糖酵解表型,在96小时的时间过程中跟踪高和低Glc(分别为25和1 mM)中生长的异步细胞25 mM Glc中培养的MDA-MB-231细胞继续增殖,与1 mM Glc中培养的细胞相比,细胞密度更高。事实上,如增殖曲线所示,低Glc细胞在48小时时完全失去增殖能力,并显示出明显的细胞死亡迹象()并通过形态学分析(数据未显示)。此外,MDA-MB-231细胞依赖Gln进行增殖;与正常培养物相比,即使是低水平的Gln(0.5mM)也显著限制了生长(). 由于Glc和Gln缺乏对MDA-MB-231细胞活性和增殖的影响与K-Ras依赖性转化小鼠模型中观察到的非常相似,因此我们更详细地分析了这些人类癌细胞的代谢表型。细胞外通量定量表明,MDA-MB-231细胞在大约化学计量水平(即2:1;). 事实上,使用1:1混合物培养的细胞的GC/MS分析-13C] 葡萄糖和[U-13C类6]葡萄糖表明,至少90%的Lac来自Glc(即,M3 Lac丰度测量值为44.6±0.1%)。与小鼠N细胞和T细胞相比,MDA-MB-231细胞消耗的Glc比Gln高得多(). 然而,Gln的直接氧化转化仍然占用[U-13C类5]谷氨酰胺(见M4质量同位素丰度;). 综上所述,这些数据表明,与转化的小鼠细胞很相似,MDA-MB-231细胞将大多数Glc转移到Lac,并依赖Gln碳进行修复。
MDA-MB-231人癌细胞株表现出糖酵解增强和TCA循环活性降低。(一)MDA-MB-231细胞以3000个细胞/厘米的速度进行电镀2在正常培养基中的6孔板中。18 h后用正常培养基()或含有1 mM Glc+4 mM Gln的培养基替换培养基(□)或25 mM Glc+0.5 mM Gln()。然后,收集细胞并在指定的时间点进行计数。(B类)54小时后细胞外摄取Glc和Gln以及分泌Lac和Glu(C类)Glc摄取与Gln摄取的比率。(D类)在[U存在下培养的细胞中Fum、Mal和Asp的MID-13C类5]谷氨酰胺。(E类)PDH通量与Glc摄取的比率。误差条表示s.e.m(n个=3)使用误差传播。
使用细胞外流量数据和从MDA-MB-231细胞中获得的MIDs,用[U-13C类5]谷氨酰胺,我们用MFA测定了贯穿中心碳代谢的细胞内流量。该分析的结果(补充图S6;补充表S4)表明,与小鼠T细胞相似,MDA-MB-231细胞表现出较高的糖酵解通量,显著降低TCA循环活性。这种比较最好通过绘制PDH通量与Glc消耗的比率来证明(). 虽然Pyr氧化通量为对照N细胞中Glc摄取量的~25%,但具有致癌K-Ras的细胞显示PDH通量为Glc消耗量的10%。因此,致癌K-Ras持续驱动中心碳代谢的解耦,增加Lac的糖酵解通量,降低不同遗传背景细胞中的氧化TCA通量(和). 重要的是,MDA-MB-231细胞携带突变的p53(Olivier等人,2002年)而K-Ras-NIH3T3细胞具有野生型p53(Wadhwa等人,1999年). 鉴于最近的文献结果表明p53抑癌蛋白是线粒体呼吸和Warburg效应的调节器(Matoba等人,2006年),我们测试了p53状态对这些代谢变化的影响,以确保我们的结果针对致癌K-Ras。比较p53+/+野生型(HCT116 p53+/+)或p53−/−KO(HCT116 p53−/−)表达致癌K-Ras的结肠癌细胞(Bunz等人,1998年),我们观察到在营养缺乏的情况下增殖没有显著差异(补充图S7A和B)或细胞内代谢物丰度(补充图S7C–F). 这些数据表明,致癌K-Ras,至少在这些细胞模型中,以一种不依赖野生型p53存在的方式,促进癌症特异性代谢变化。
为了分析我们的代谢分析和转录谱之间的关系,从公开获取的基因表达谱数据集(GEO和CellMiner)中恢复了MDA-MB-231细胞和正常乳腺组织的微阵列数据集。如前所述,对数据进行了分析(Balestrieri等人,2009年),结果表明,几个糖酵解基因(即。,香港1号,Pfkp公司,Eno1公司、和利达)在癌细胞中的表达水平高于正常乳腺组织(补充图S8A)与中显示的更活跃的糖酵解相一致一些TCA循环基因的基因表达也存在差异(补充图S8B).
这些发现共同表明,致癌K-Ras转化诱导细胞特异性转录程序,这些转录程序在我们观察到的代谢改变中起作用(即糖酵解活性增加),并强调了系统级方法的实用性。描绘了新陈代谢的示意图,表明了我们使用13C MFA和转录谱分析。特别是,可以观察到K-Ras转化的小鼠和人类细胞,如先前的代谢分析所示,将大部分消耗的Glc转移到Lac(,红色箭头)。观察到两种细胞系(即。,Adpgk公司,加德夫,Pgk公司,Eno 1号机组和2,平方公里和利达;,右框)。此外,丙酮酸进入线粒体的流量减少(,绿色箭头)和编码TCA循环酶的几个基因的失调()部分解释了在两种转化细胞系中观察到的TCA循环流量减少(,绿色箭头)。同时,我们的代谢数据表明,转化细胞中TCA循环流量的减少具有重要的合成代谢作用,并且基本上由Gln推动,正如Gln衍生的TCA循环中间产物标记的Asp的鉴定所表明的那样(). 此外,Gln在支持癌细胞合成代谢过程中的重要作用(,红色箭头)是通过鉴定含有谷氨酰胺衍生氮的标记代谢物以及谷胱甘肽代谢相关基因表达的增加而提出的(Gclm、Gss、,和Ggta1公司),己糖代谢(Gfpt1型)和核苷酸生物合成(Cad、Adss、和Adsl公司) (). 综上所述,这些发现表明癌细胞代谢发生重大变化,Glc和Gln命运脱钩。
正常和小鼠K-Ras转化细胞中代谢通量和转录数据的综合图示。(一,B类)利用通量分析和转录数据,比较T细胞和N细胞中确定的代谢途径的整合图。代谢通量和基因表达值的T细胞和N细胞之间的比率用颜色代码表示(如右上角的图例所示),如下所示:流量分析用黑色(无变化值)、红色(增加值)和绿色(减少值),以及上色T/N比率⩾1.1,转录数据的下绿色T/N比率为0.9,无变化年色T/N比率在0.9和1.1之间。图中使用的基因缩写列表可以在“补充信息’. 中心碳代谢的代谢通量分析是通过使用来自[U-13C类5]谷氨酰胺,一种[U的混合物-13C类6]葡萄糖和1-13C] 葡萄糖(A)和[α-15N] 谷氨酰胺(B)作为特定同位素示踪剂。净通量和交换通量的计算方法如“材料和方法”所述。如“材料和方法”所述,获得了N和T调节基因的转录数据。
代谢改变依赖于致癌K-Ras的激活和谷氨酰胺的利用
为了直接评估致癌K-Ras在先前描述的转化细胞代谢改变中的作用,我们利用稳定表达显性负性鸟嘌呤交换因子CDC25(GEF-DN)的细胞系NIH3T3-GEF-DN(还原细胞,R)进行了几项代谢分析特异性减弱致癌K-Ras激活(Vanoni等人,1999年;Bossu等人,2000年). 值得注意的是,R细胞表现出与细胞转化回归一致的变化,包括Ras-GTP水平、形态、锚定非依赖性生长、裸鼠Ras-依赖性肿瘤形成减少、葡萄糖和谷氨酰胺依赖性以及线粒体功能障碍,表现为与N细胞相似的表型(Chiaradonna等人,2006b;Gaglio等人,2009年).
为了比较R细胞与N细胞和T细胞的代谢表型,Cit和Mal的细胞内浓度()或Glu和Asp()通过在最佳生长条件(25 mM Glc+4 mM Gln)下培养54 h的细胞中的酶分析测定。结果表明,N细胞和R细胞含有类似的代谢物丰度,而T细胞的代谢丰度与之前使用GC/MS观察到的相似。为了进一步详细说明R细胞与N和T细胞系相比的代谢特征,并评估谷氨酰胺利用是否是K-Ras转化细胞增殖的一般要求,我们在含有低Gln+的培养基中进行了细胞增殖分析,每种培养基含有两种细胞透性谷氨酰胺产物,即天冬氨酸二甲酯(DMD)和α-酮戊二酸二甲酯(DMK)。如所示补充图S9,谷氨酰胺缺乏仅导致T细胞增殖减少,而添加DMD或DMK可部分缓解T细胞的增殖(补充图S9).
N、T和R细胞系中的相对代谢物浓度以及氨基氧乙酸(AOA)和表没食子儿茶素没食子酸(EGCG)处理对其增殖的影响。Cit评估(一),马尔(B类),谷氨酸(C类)和Asp(D类)在正常培养基中生长54h后,用酶法测定细胞内浓度。AOA分析(E类)和EGCG(F类)对N、T和R细胞系增殖的处理。细胞,以3000个细胞/厘米的密度播种218小时后,在完全更换培养基后,用100μM AOA或1 mM天冬氨酸二甲酯(DMD)或2 mMα-酮戊二酸二甲酯或20μM EGCG处理,并在指定的时间点计数。误差条表示s.e.m(n个=3).
为了进一步测试T细胞中诱导的Gln代谢是否依赖于K-ras(拉斯维加斯)癌基因,我们用氨基氧乙酸盐(AOA)处理N、T和R细胞系,AOA是一种转氨酶活性的抑制剂()表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG),谷氨酸脱氢酶(GDH)活性的抑制剂(). 如所示,AOA处理仅抑制T细胞增殖(,比较中间面板和左侧面板:N个单元格和右侧面板:R个单元格),并通过添加DMD而不是添加DMK来挽救(). 这些数据表明,转氨酶活性是维持癌细胞生长所必需的,而谷氨酰胺衍生的天冬氨酸是癌细胞生长的重要合成代谢前体。
用EGCG处理后,在N、T和R细胞系中进行类似的增殖实验。如所示,处理诱导所有细胞株的细胞死亡。然而,与在N和R细胞中观察到的相比,T细胞中的细胞数量减少明显更大。重要的是,添加DMK完全挽救了所有三种细胞系的生存能力(). 鉴于在24小时时所有细胞中观察到显著的细胞死亡水平,我们研究了EGCG对早期时间点(0至8小时之间)细胞存活的影响,以更好地了解细胞毒性的机制。EGCG以时间依赖性的方式降低所有三种细胞系的存活率,T细胞对EGCG治疗最敏感(,浅灰色条)。有趣的是,抗氧化剂N个-乙酰基-L(左)-半胱氨酸(NAC)仅保护T细胞免受EGCG介导的细胞毒性()表明ROS积累对其细胞死亡具有特殊作用。为了确定与N细胞和R细胞相比,EGCG是否在T细胞中诱导了不同类型的细胞死亡,用EGCG处理细胞8小时,并分别用Annexin V(AV)和碘化丙啶(PI)染色,这是晚期凋亡和质膜通透性的指标。未经处理的细胞显示出AV阴性/PI阴性模式,显示出活细胞(,上图),而用EGCG处理8小时的N和R细胞显示出AV阴性/PI阳性模式,显示出具有质膜完整性丧失的死亡群体,典型的坏死(,底部面板)。经EGCG处理的T细胞具有AV阳性/PI阳性模式,显示典型的AV信号增强的凋亡人群。EGCG处理后的细胞形态分析也证实了这些结果。当EGCG诱导N和R细胞(几乎所有的PI-阳性细胞)中的细胞残留变平和附着时,EGCG处理的T细胞是分离和圆形的细胞(数据未显示)。
(一)EGCG抑制剂对N、T和R细胞系的短期影响。细胞,以3000个细胞/厘米的密度播种218小时后,在完全更换培养基后,用20μM EGCG和/或5 mM NAC处理,并在指定的时间点进行计数。(B类)通过荧光显微镜分析细胞死亡,使用PI(红色)、Annexin V(绿色)和Hoechst进行细胞核染色(蓝色)。细胞以3000个细胞/厘米的速度进行培养2在微晶玻璃上,按上述方法处理并在8小时后分析。图像由使用Metamorph 7软件的×60物镜采集。(C类)通过酶测定分析细胞内ATP水平。按照上述方法处理细胞,并在指定的时间点收集。(D类)使用5 mM DCFH测量细胞内ROS水平2-DA染色。按照上述方法处理细胞,并在指定的时间点收集。误差条表示s.e.m(n个=3).
考虑到ATP耗竭更有可能导致坏死,而ROS积累更典型地与凋亡相关,我们在每个细胞系中测量了EGCG处理3小时后的细胞内ATP和ROS水平。如所示EGCG导致N和R细胞内ATP水平显著下降,NAC处理无法挽救。相反,无论EGCG处理与否,T细胞的ROS水平都很高且几乎恒定,而N和R细胞在EGCG治疗后ROS水平下降(). 与N和R细胞相比,3小时未处理的T细胞中细胞内ROS的绝对水平高出约两倍(例如。,N个=193.5;T型=317.2;R(右)=141.7),添加NAC降低了所有细胞中的ROS水平(). 总之,这些发现表明,GDH活性通过不同的机制对所有三种细胞系的生存都是必要的,其抑制可能导致N和R细胞能量紊乱,然后由于ATP耗竭而坏死,而T细胞中的抗氧化耗竭最终可能导致凋亡。总之,这些结果表明谷氨酰胺在内源性抗氧化剂生产中的作用,例如谷胱甘肽的合成,进一步证实了谷氨酰胺在T细胞中的合成代谢作用。
讨论
癌症是一种复杂的疾病,由多种细胞途径上的众多分子变化引起(Mazurek等人,1998年;哈纳汉和温伯格,2000年). 这些变化中包括与生物能量学和细胞生物合成相关的代谢途径的重新编程,代谢干预现在正在成为潜在的治疗靶点(Michelakis等人,2010年;Vander Heiden等人,2010年;怀斯和汤普森,2010年). 在本文中,我们使用了13C MFA、NTFD分析和转录谱分析,以全面分析癌细胞代谢及其由K-ras(拉斯维加斯)致癌基因。结果总结于,强调引入K-Ras突变形式后发生的代谢途径的重新编程。在癌细胞中,大多数消耗的Glc被转移到Lac(,红色箭头),而Pyr通过PDH氧化为AcCoA的反应持续降低(,绿色箭头)。这种减少导致TCA循环通量显著减少(,绿色圆圈箭头),可能是由表达式Pdk公司基因。有趣的是,本文分析的小鼠和人类转化细胞的线粒体复合物I活性显著降低(石川等人,2008;Baracca等人,2010年). 与TCA循环中葡萄糖利用率的降低相一致,癌细胞中的Gln成为细胞生物合成中碳和氮的更相关来源(、黑色、蓝色和天蓝色箭头),通过转氨酶(天冬氨酸标记)和谷氨酸脱氢酶活性(黑色、蓝色和天蓝色箭头)。
K-Ras癌细胞中Glc和Gln通路解耦的示意图。Glc为具有致癌K-Ras的癌细胞提供主要能源。相反,Gln提供碳和氮用于合成生物量构建块(氨基酸、核苷酸和脂肪酸)。红色箭头代表增强通量,绿色箭头代表减少通量,黑色箭头代表无变化通量,蓝色箭头代表TCA循环的正向通量,天蓝色代表还原羧化通量。
总之,在K-Ras转化细胞中,Glc和Gln代谢之间的脱钩导致Gln中的碳和氮高效利用为生物量构建块(氨基酸和核苷酸)和谷胱甘肽。维持生长和抑制活性氧生成的能力都可能促进癌细胞增殖和/或存活。因此,转化细胞生长对谷氨酰胺可用性的强烈依赖并不奇怪(Gaglio等人,2009年;Wang等人,2010年;Weinberg等人,2010年). 我们的分析还表明,转录变化有助于观察到小鼠和人类转化细胞的代谢重编程。未来,对生长维持代谢中涉及的各种酶步骤以及调控这些反应的基因的详细分析可能会为转化的分子基础提供线索。此外,这些结果可能有助于识别代谢网络中的脆弱点和更有效的靶向癌症治疗。
材料和方法
细胞培养
小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3细胞(CRL-1658;美国型培养物收藏)和K-Ras公司转化的NIH3T3衍生细胞系,226.4.1(Pulciani等人,1985年),常规生长在含有10%新生小牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中,4 mML(左)-37°C、5%CO湿化空气中的谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素(正常生长培养基)(均来自美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市英维特罗根)2NIH-GEF-DN(还原细胞系)稳定、组成性表达显性阴性突变Cdc25MmW1056E(GEF-DN;Bossu等人,2000年)在添加了0.7 mg/ml基因素的正常生长培养基中保持(G418;Sigma-Aldrich Inc.,St Louis,MO,USA)。MDA-MB-231人乳腺癌细胞系取自欧洲肿瘤研究所(意大利米兰),在含有5%胎牛血清、4 mML(左)-37°C、5%CO湿化空气中的谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素(正常生长培养基)(均来自美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市英维特罗根)2.HCT116 p53型+/+和HCT116 p53−/−从欧洲肿瘤研究所(意大利米兰)获得的细胞,用完全DMEM加10%FBS培养。使用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)使细胞通过,并在操作前保持培养48小时。
细胞增殖分析和细胞治疗
长期研究中,细胞以3000个细胞/厘米的密度进行培养2在完全生长培养基中。18小时后,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞两次,并在不同葡萄糖浓度(25和1 mM葡萄糖)或不同谷氨酰胺浓度(4和0.5 mM谷氨酰胺)的培养基中培养(时间0)。当需要时,用100μM AOA处理细胞(O(运行)-(羧甲基)羟胺半盐酸盐)或20μM(-)-EGCG或2 mM 2-羟戊二酸二甲酯-DMK-或1 mML(左)-天冬氨酸β-甲酯盐酸盐-DMD-(Sigma-Aldrich Inc.)。对于短期研究,细胞按照上述方法进行电镀和生长,然后用20μM EGCG或5 mM NAC(Sigma-Aldrich Inc.)处理。为了测量细胞增殖,采集的细胞通过Burker小室进行计数。
微阵列数据采集
从两个不同的数据集提取微阵列转录谱。小鼠时间进程数据是从NIH3T3和NIH3T_K-Ras小鼠成纤维细胞的转录图谱收集中获得的,这些成纤维细胞是在我们的实验室中生成的,在25 mM葡萄糖+4 mM谷氨酰胺中生长,沿着72 h的时间进程生长。特别是,用于时间进程转录分析的细胞是在最初播种后18 h收集的,介质变化对应的时间(表示为T型0)以及24、48和72小时(NCBI GEO数据库从GSM741354标准到GSM741361标准和来自GSM741368标准到GSM741375NIH3T3和NIH3T_K-Ras)。对于每个时间点,通过使用Affymetrix单周期靶标记和对照试剂盒(Affymetrix Inc.,Santa Clara,CA,USA),按照制造商的方案产生标记的cRNA,并使用Affymetrix基因芯片(小鼠基因组430 2.0阵列)进行杂交,以确定全局基因表达模式。在Affymetrix Complete基因芯片上清洗和扫描阵列®仪器系统并处理成CEL文件。
U133A阵列的人类原始表达数据来自公开访问的基因表达谱数据库GEO(网址:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)或CellMiner(http://discover.nci.nih.gov/cellminer/home.do). 特别是,我们使用了人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231(CellMiner登录号13409hg133a21)和人类正常乳腺组织(NCBI GEO登录号GSM44683标准). 小鼠和人类的转录数据分别按照相同的归一化和噪声过滤程序提交,以便在不同的实验中获得良好的比较。简单地说,通过RMA方法,将数据文件(CEL文件)导入GeneSpring GX 11.0.2软件(安捷伦科技公司),并将其归一化,总结为探针级强度测量(Irizarry等人,2003年). 特别是,在GeneSpring中实现的算法,从一组数组的完美匹配Probelevel数据开始,进行背景校正、归一化,最后将结果总结为每个探针集的一组表达式度量。随后,还按照GeneSpring手册中的描述执行了“per-gene归一化”。总之,这些程序允许获得以值0为中心的log2刻度中每个探针集的相对表达式。该测量比例尺用于本文所示的热图。从这两个数据集(小鼠和人类)中,已经确定并收集了编码糖酵解、TCA循环和谷氨酰胺代谢相关蛋白的基因的表达水平,在小鼠数据集的48和72小时,以及在作者指定的时间,人类组织和细胞系样品的表达水平。已报告的小鼠和人类基因总数及其强度表达水平补充数据集.
代谢物提取
对于标记实验和基于GC/MS的代谢组学,异步NIH3T3、NIH3T_K-Ras和MDA-MB-231以3000个细胞/厘米的速度电镀2在具有正常生长介质的6孔板中。总之,在接种后18小时,用PBS清洗细胞,并在不同的DMEM(Sigma)中培养,再加上10%的透析血清,补充未标记的葡萄糖或谷氨酰胺,以及4 mM[U-13C类5]谷氨酰胺或25 mM 1:1的[U混合物-13C类6]葡萄糖和[1-13C] 葡萄糖。54小时后,收集废培养基并在YSI7100分析仪上分析葡萄糖、乳酸和谷氨酰胺消耗量。用PBS快速冲洗细胞,以尽量减少废培养基携带,并用0.4 ml冰镇甲醇淬火。添加等量的含1μg去甲缬氨酸内标物的水,用移液管尖端刮取细胞。加入两体积的氯仿,在4°C下旋转细胞30分钟。在3000℃下离心样品克持续10min,将水相收集在新管中,并在室温下在气流下蒸发。
衍生化和GC/MS测量
将干燥的极性代谢物溶解在60μl吡啶(Pierce)中的2%甲氧基胺盐酸盐中,超声30 min,并在37°C下保持2 h。溶解和反应后,添加90μl MBTSTFA+1%TBDMCS(Pierse),并在55°C下孵育样品60 min。使用配备30 m DB-35MS毛细管柱的Agilent 6890 GC进行GC/MS分析,该毛细管柱连接至Agilent 5975BMS,在70 eV的电子冲击(EI)电离下工作,在270°C下以无分离性模式注入1μl样品,使用氦气作为载气,流速为1 ml/min。GC烘箱温度保持在100°C下3分钟,并在3.5°C/min下增加到300°C,总运行时间为~60分钟。MS源和四极分别保持在230和150°C,检测器在选定的离子监测模式下运行。获得每种被测代谢物的MID,并将其与细胞外流量测量值结合,用于流量测定。为了测定相对代谢物丰度,每个代谢物片段的所有潜在标记离子的综合信号通过去甲缬氨酸的信号和每孔细胞数(通过计算替代平板获得)进行标准化。
非目标示踪剂归宿检测
进行NTFD分析以确定谷氨酰胺的α-胺氮原子的代谢命运(Hiller等人,2010年). 如上所述,将细胞培养54小时,但不使用未标记的谷氨酰胺,而是使用未标记和[α-15N] 谷氨酰胺(剑桥同位素实验室)用于每种生长条件。由于这是NTFD的一项要求,因此用完全未标记的谷氨酰胺作为参考培养额外的细胞。两种培养均进行了三次,并按照上述方法提取和测量细胞内代谢物。将原始GC/MS数据用作NTFD软件的输入,并使用代谢物检测器软件包的算法匹配所有生长条件下检测到的所有标记化合物(Hiller等人,2009年). 最后,使用NIST参考库进行化合物鉴定(Babushok等人,2007年).
代谢物分析
对于天冬氨酸、柠檬酸、苹果酸和谷氨酸的酶分析定量,异步NIH3T3、NIH3T_K-Ras和NIH-GEF-DN以3000个细胞/厘米的速度进行电镀2用正常的生长培养基。总之,在接种后18 h,用PBS清洗细胞,并在含有25 mM葡萄糖和4 mM谷氨酰胺的培养基中培养。54小时后,用PBS冷洗两次细胞,并用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)收集。对细胞进行计数,并用适当的冰上分析缓冲液快速均质50万份细胞等分。样品在15000下离心克持续10分钟,以清除细胞碎片并使用高氯酸/KOH方案(BioVision)脱蛋白。将样品加入96孔板的一式三孔中,并用测定缓冲液将体积调至50μl。样品在室温或37°C下培养30分钟,避光。然后,在微孔板阅读器中测量外径。
细胞内ATP定量
使用CellTiter Glo测量细胞内ATP水平®荧光素-荧光素酶分析(Promega)根据制造商的方案。特别是,100μl含有104将细胞加入96孔板的单个孔中的等体积CellTiter-Glo试剂中。使用Cary Eclipse荧光分光光度计(Varian)在560 nm波长下孵育后收集发射的发光,并在设置校准曲线后将发光值转换为ATP数量。
ROS水平测量
使用带有CellQuest软件(BD Biosciences)的FACScan流式细胞仪(Becton-Dickinson)通过流式细胞术分析检测ROS水平。用5μM二氯二氢荧光素二醋酸盐(DCFH2-DA;分子探针,Invitrogen)在37°C下放置30分钟。然后,对细胞进行胰蛋白酶化,收集在冰中,并通过FACScan采集。使用WinMDI软件对流式细胞术数据进行分析。
AV/PI细胞死亡分析
使用细胞凋亡检测试剂盒(免疫科学)估计细胞死亡。将细胞接种在先前用2%明胶处理过的盖玻片上。通过添加50μl结合缓冲液、5μl Annexin V-FITC和5μl PI对盖玻片上的细胞进行染色。在37°C的黑暗中培养15分钟后,用5μg/ml Hoechst(Invitrogen)在RT下处理细胞5分钟。安装在DABCO中的盖玻片在配备b/w CCD相机的尼康ECLIPSE 90i荧光显微镜(日本滨松公司滨松-CoolSNAP)下使用Plan Apo物镜(×60油;数值孔径分别为0.75和1.4)。图像是使用成像软件Metamorph 7采集的,然后在Adobe Photoshop CS3中进行处理,调整亮度和对比度。