用于逐步确定细胞命运的组合信号代码果蝇属胚胎中胚层

表达Eve的体细胞肌肉和心脏祖细胞来源于L'sc预集群 2

为了理解祖细胞规范化的机制，我们重点研究了表达Eve的两种背侧中胚层衍生物。每个胚胎半段包含一对表达Eve的心包细胞（EPCs）和一个Eve阳性的背侧躯体肌DA1(Frasch等人，1987年). 这两个内皮祖细胞来自一个共同的祖细胞P2，而第二个祖细胞P15产生肌肉DA1(Buff等人，1998年;Carmena等人，1998年). P2由L'sc簇2（C2）发展而来，该簇最初只表达L'sc，并由前C2的背侧细胞组成（图。​（图1G）。1G） ●●●●。然后，Eve在所有C2细胞中与L'sc共存（图。​（图1H）。1H） ●●●●。L'sc和Eve逐渐限制为单个C2细胞，即P2祖细胞（图。​（图1I、J）。1一、 J）。此时，另一组L'sc簇C14–C16出现在与C2之前占据的区域相邻并重叠的背部中胚层中（图。​（图1K）。1K） ●●●●。C15也表达Eve并产生P15祖细胞（图。​（图1L、M）。1五十、 M）。每一个夏娃祖先分裂形成两个创始细胞（图。​（图1M，N；1M、 N；F2和F15），但每个兄弟姐妹对中只有一个创始人保留Eve表达（数据未显示）。Eve持续阳性的F2再次分裂，每半段形成两个EPC，而Eve所在的F15则促进肌肉DA1的形成(Buff等人，1998年;Carmena等人，1998年). 因为给定L'sc簇中的所有细胞最初都表达像Eve这样的身份基因（图。​（图1H、L），1H、 L），并且在神经原突变体的整个簇中持续存在同一基因表达(Carmena等人，1995年)，这样的簇可以被视为中胚层等效群(格林沃尔德和鲁宾1992).

中胚层L'sc制剂依赖于Wg和 Dpp公司

Wg和Dpp都是EPC和肌肉DA1前体形成所必需的(Frasch 1995年;劳伦斯等人，1995年;Wu等人，1995年;Park等人，1996). 鉴于交叉的Wg和Dpp表达域与preC2的边界精确相关，我们研究了这两个信号是否在中胚层L'sc表达中起作用。preC2的存在是非常短暂的；在其出现后不久，L'sc就被限制为组成C2的前C2细胞的子集（图。​（图1G1G和​和2A、B）。2A、 B）。在重量（wg）突变胚胎，既不发育前C2也不发育C2（图。​（图2C）。2C） ●●●●。不可能检查前C2或C2形成中对Dpp的类似要求，因为背腹命运的转移与完全丧失dpp（数据处理程序）功能导致中胚层组织的严重错乱（数据未显示）。然而，我们能够通过使用Gal4–UAS系统体外表达Dpp来证明Dpp参与早期中胚层L'sc表达(布兰德和佩里蒙1993).两倍–Gal4介导的Dpp靶向对preC2的形成没有影响（图。​（图2D）2D） 但确实延长了前C2腹肌细胞中L'sc的表达（图。​（图2，2，参见B和E）。L'sc表达的腹侧范围没有扩大，而是在第10阶段Wg条纹中正常形成的侧隙处结束（数据未显示）。这表明L'sc在暴露于Wg和Dpp的中胚层细胞中被诱导。与此假设一致，异位Wg沿胚胎前后轴诱导额外的L'sc表达，但仅限于局限于Dpp结构域的背侧中胚层细胞（图。​（图2F）。2F） ●●●●。

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图2

中胚层L'sc表达对Wg、Dpp、Htl和DER的依赖性。(一个)在晚期10野生型胚胎的单个半节段中，L’sc在preC2中的表达。神经系统（NS）中出现额外的L'sc表达。(B类)C2中的L'sc表达。(C类)纯合子中PreC2完全缺失重量（wg）^CX4系列突变胚胎。腹侧前C1区以及大多数背侧和腹侧L'sc簇也是重量（wg）依赖（未显示数据）。(D类)Dpp的异位表达由两倍–Gal4不影响前C2的形成。(E类)当正常发生对C2的限制时，异位Dpp导致L’sc维持在preC2的所有细胞中。(F类)异位Wg在正常C2前后的背侧中胚层细胞中诱导L'sc。异位Wg加Dpp导致L'sc结构域在前C2期前后延伸(G公司)以及在C2期持续存在扩大的preC2(H（H）). 两者都没有两倍–Gal4+直径f2–Gal4诱导显性阴性Htl的表达(我)也不是两倍–Gal4介导显性阴性DER的表达(J型)影响前C2的形成。显性-阴性Htl(K（K）)但不是显性负DER(L（左）)阻挡C2编队。(M（M）)早期11个野生型胚胎中C14–C16中L'sc的表达。(N个)显性负Htl抑制C14、C15和C16的形成。(O（运行）)显性负DER抑制C15而非C14或C16的形成。（箭头）缺失C15的位置。中的星号A–L指示神经系统祖细胞的位置，作为比较各种中胚层L'sc模式的参考点。里面的钻石米-米标记晚期胚胎中的外周神经系统（PNS）细胞。

为了进一步测试中胚层L'sc表达对Wg和Dpp的双重需求，我们将这两种信号分子在体外同时表达。这导致了异位Wg导致前C2和C2的L'sc前后延伸，以及异位Dpp导致C2期前簇腹侧L'cc持续存在（图。​（图2G、H）。2G、 H）。这些发现表明，以早期L'sc表达为代表的中胚层前模式是由Wg和Dpp的联合活性建立的。然而，还必须考虑其他因素，因为异位Wg和Dpp在丛集前阶段不会诱导全中胚层L'sc表达。

EGF和FGF受体的信号传导在Wg和 Dpp公司

除了Wg和Dpp外果蝇属EGF和Htl FGF受体是测定肌肉和心脏祖细胞亚群所必需的，包括那些表达Eve的祖细胞(Buff等人，1998年;Michelson等人，1998年). 因此，我们对DER和Htl是否也参与L’sc预簇或簇的形成感兴趣。为了研究这个问题，我们将这两种受体的显性-阴性形式的表达定位于胚胎中胚层。既不是显性Htl也不是阴性Htl（图。​（图2I）2一） 也不是显性负DER（图。​（图2J）2J） 影响了前C2的发展。然而，抑制Htl而非DER信号导致C2丢失（图。​（图2K，L）。2K、 L）。这种对Htl的需求反映了细胞命运规范的直接参与，因为在当前条件下，当显性负性Htl表达时，中胚层迁移是完全正常的(Michelson等人，1998年).

在挑选出P2后，C15在C2之前占据的位置形成（图。​（图1K1K和​和200万）2M） ，该过程需要DER和Htl（图。​（图2N，O），2N、 O），与我们之前的证明一致，即肌肉DA1发育需要两个RTK(Buff等人，1998年;Michelson等人，1998年). Htl（但不是DER）也有助于其他背侧L'sc簇的形成（图。​（图2N，O）。2N、 O）。总之，建立L'sc准备程序不需要DER或Htl的活动。然而，这两个RTK对于Wg和Dpp编制的中胚层区域内L'sc等效群的后续组织至关重要。

MAPK在中胚层等效组中局部激活，并持续存在 祖先

RTK信号的传递至少部分通过Ras/MAPK级联进行(van der Geer等人，1994年;Seger和Krebs 1995年). 通过使用对丝裂原相关蛋白激酶（MAPK）的二磷酸化或活化形式（二磷酸MAPK）特异的抗体，可以识别RTK信号在细胞内的定位位点果蝇属胚胎(Gabay等人，1997年a，b条). 我们使用该试剂监测DER和Htl在中胚层L'sc簇形成中的时空参与以及相应祖细胞的规格。

MAPK在完全迁移的中胚层中的最早激活发生在C2，与L'sc的限制相一致，并且早于Eve在该簇中的出现（图。​（图3A；三A；数据未显示）。这些发现与之前Htl对C2开发的要求一致。Eve表达开始后，二磷酸MAPK在C2中持续存在（图。​（图3B），三B） 但在祖细胞选择过程中，大多数C2细胞会褪色（图。​（图3C）。三C） ●●●●。激活的MAPK暂时停留在P2中，然后消失（图。​（图3D，E）。三D、 E）。同时，C15开始表达二磷酸MAPK和Eve（图。​（图3F）。三F） ●●●●。C15中MAPK的激活预计来自于C15形成中Htl和DER的参与（图。​（图2N，O）。2N、 O）。然后P2分裂产生兄弟创始细胞，这两个细胞最初都不包含激活的MAPK（图。​（图3G；三G；F2s）。然而，当P15被选中时，MAPK在其中一个兄弟F2中被重新激活（图。​（图3H）。三H） ●●●●。与P2的情况一样，P15中的二磷酸MAPK仍处于高水平（图。​（图3F、H）。三F、 H）。此外，MAPK激活的持续性与两个祖细胞中Eve表达的维持相关（图。​（图3D，H）。三D、 H）。在来自C14、C16和C17的细胞中观察到额外的双磷酸MAPK表达（图。​（图3G，H），三G、 H），与Htl参与这些簇的形成一致（图。​（图2N）。2N） ●●●●。因此，双磷酸MAPK表达的时间和空间模式与RTK信号在中胚层L'sc簇形成、中胚层Eve表达诱导以及肌肉和心脏祖细胞分离中的要求一致。

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图3

中胚层Eve祖细胞鉴定过程中活化MAPK的原位定位。野生型胚胎染色以检测二磷酸MAPK（绿色）和Eve（红色）的表达。(一个)在后期阶段10，双磷酸MAPK首先出现在所有C2细胞的Eve之前。(B类)夏娃在C2细胞中启动，一些C2细胞的双磷酸MAPK开始褪色。(C类)除祖细胞2（P2）外，大多数C2细胞中的二磷酸MAPK持续下降。Eve还没有限制为P2。(D类)P2被挑选出来并保留了Eve和双磷酸MAPK。(E类)尽管不再检测到二磷酸MAPK，但Eve仍存在于P2中。(F类)Eve和二磷酸MAPK在C15中共表达，在P15中这两种蛋白的水平最高。(G公司)同父异母的F2创始人在P2分裂后表达Eve，但不表达双磷酸MAPK。P14、P16和P17中出现额外的双磷酸MAPK。(H（H）)当P15被挑出来时，二磷酸MAPK在一个F2创始人中被重新激活。P15和F2的指示位置与L'sc加Eve双重标记一致（见图。​图1L，M）。1五十、 M）。与F2一样，MAPK仅在一个F15中重新激活（未显示数据）。

Ras1信号转导指定中胚层祖细胞并促进创始细胞 区别

我们之前已经证明，DER、Htl或Ras1的构成活性与多余表达Eve的中胚层细胞的发育有关（图。​（图4A、C；4A、 C类；Gisselbrecht等人，1996年;Buff等人，1998年; A.M.Michelson和S.Gisselbrecht，未公布）。然而，这些早期的实验并没有确定这种反应是由于激活Ras1诱导正常Eve细胞的增殖，还是由于补充额外的细胞导致Eve阳性。激活的Ras1不会增加L'sc簇的大小（数据未显示），这表明Ras1不仅仅是刺激中胚层细胞的分裂。然而，为了明确地解决这个问题，我们检查了构成性Ras1活性在一串(stg公司)突变胚胎。因为强等位基因stg公司防止所有胚层后细胞分裂(埃德加和奥法雷尔1989)激活的Ras1的潜在细胞增殖效应应该在这种遗传背景下被阻断。另一方面，stg公司如果Ras1促进Eve表达细胞的测定，则不应抑制其过度生产。在一个stg公司突变体，每个半段中只有一到两个Eve阳性细胞（图。​（图4B）。4B） ●●●●。这些细胞对应于野生型胚胎中形成的夏娃祖细胞（图中的P2和P15）。​图1J、L1J、 L和3E，H）。在某些片段中只存在一个夏娃祖先stg公司突变胚胎可能是由于当合子细胞分裂不发生时，对L'sc簇有贡献的中胚层细胞数量较少。值得注意的是，激活的Ras1在stg公司与仅在突变体中看到的突变体相比（图。​（图4B、D）。4B、 D）。我们的结论是，Ras1通过诱导更多的中胚层细胞承担这种命运，而不是通过刺激正常祖细胞分裂，来促进更多夏娃祖细胞的形成。

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图4

组成型Ras1信号传导对中胚层祖细胞规格和肌肉创始人分化的影响。(A–D)对所示基因型的11期胚胎进行Eve表达染色。(E–H（E–H）)对16期胚胎进行Eve（黑色）和肌球蛋白重链（棕色）染色。(一个)在每个野生型半节段中观察到三到四个Eve阳性细胞。这些代表兄弟F2创始人加上单个P15祖细胞或来自P15分裂的兄弟细胞。(B类)在一个stg公司突变体，每半段形成一到两个夏娃祖先。组成性Ras1激活在其他野生型中产生额外的Eve阳性中胚层细胞(C类)或stg公司突变体(D类)胚胎。(E类)Eve在每个野生型半段的两个心包细胞（EPC）和一个背侧躯体肌（DA1）中表达。(F类)肌肉融合不会发生在mbc公司表达Eve（F_{数据采集1})可以通过纺锤形的形态来识别。(G公司)组成性Ras1激活诱导包含多个Eve阳性核的大合胞体的形成。(H（H）)额外表达Eve的肌肉创建者出现在mbc公司Ras1组成性激活时的突变胚胎。

接下来，我们通过检测Ras1在野生型和野生型发育后期的肌源性效应，评估Ras1通路是否足以诱导祖细胞分化成肌细胞城市(mbc公司)突变胚胎。如果没有mbc公司功能，肌肉融合不发生，分化的肌肉创始者表现为纺锤形成肌细胞，表达肌球蛋白和创始细胞标记物，如Eve（图。​（图4E、F；4E、 F；Rushton等人，1995年). 相比之下mbc公司一种突变体，其中每个半段中存在一个表达Eve的肌肉DA1创建者，在mbc公司激活Ras1影响下的胚胎（图。​（图4H）。4H） ●●●●。在这些胚胎中看到的所有伊芙加肌球蛋白阳性成肌细胞都具有肌肉形成者的细长形态，而不是相邻的伊芙阴性成肌细胞的圆形。当Ras1在野生型背景下激活时，存在含有许多Eve阳性细胞核的大合胞体（图。​（图4G）。4G） ●●●●。尽管额外的Eve心包细胞最初是在激活的Ras1的影响下出现的（数据未显示），但Eve在这些细胞中的表达在后期会丢失（图。​（图4G，H）。4G、 H）。我们的结论是，Ras1通路的异位激活不仅刺激了其他祖细胞中Eve的表达，还促进了多余肌肉形成者的形成和分化。

Wg和Dpp制备的整个中胚层结构域能够响应Ras1 激活

激活的Ras1诱导的额外Eve阳性细胞局限于具有类似L'sc前簇2的前后和背腹边界的簇。这些扩大的Eve星团的前后向尺寸与Wg条纹的边界精确对齐（图。​（图5A、B）。5A、 B）。此外，活化的Ras1在所有preC2细胞中过早诱导Eve表达（图。​（图5C）。5C） ●●●●。这个Eve表达式出现得比通常更早，因为在这些实验中，构成Ras1表达式是由两倍–Gal4，在第7阶段启动(格雷格和阿卡姆1993)，在第10阶段后期背侧中胚层MAPK正常激活之前（图。​（图3A）。三A） ●●●●。当L'sc在野生型胚胎中被限制为单个P2时，在激活的Ras1胚胎中至少观察到两到三个这样的细胞（数据未显示）。当C14–C17正常出现时，激活的Ras1诱导包含所有C15以及大多数C14、C16和C17的大组细胞中L'sc和Eve的共表达（图。​（图5D）。5D） ●●●●。其中许多细胞比正常细胞保留L'sc的时间更长，并成为分裂产生额外Eve表达创始者的祖细胞（图。​（图5E、F）。5E、 F）。因此，Ras/MAPK通路的离域激活在Wg和Dpp制备的整个中胚层结构域中诱导祖细胞特异性基因表达。

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图5

Ras1获得功能和神经原基因丧失功能的中胚层效应的比较。(A、 B类)对11期胚胎进行Wg（绿色）和Eve（红色）染色。(C–J型)对10-11期胚胎进行染色，以检测L'sc（绿色）和Eve（红色）的表达。(一个)野生型胚胎中中胚层夏娃细胞在Wg域发育。(B类)构成型Ras1诱导的额外中胚层夏娃细胞仅限于Wg条纹。(C类)激活的Ras1诱导所有preC2细胞中Eve的过早表达。(D类)在指定了几个P2后，激活的Ras1导致Eve和L'sc在C15和C14、C16和C17的大多数（或如本例中的所有）细胞中共存。(E、 F类)来自C2和C14–C17的其他夏娃祖先和创始人在激活Ras1的影响下产生。无法在中解析单独的L'sc群集D–F型因为激活的Ras1延长了L'sc在每个细胞中的表达。初始C2编队在Dl公司突变胚胎(G公司)夏娃在C15中被激活，在C15里它最初与野生型L'sc共存(H（H）). (我)当L'sc和Eve正常情况下仅限于单个祖细胞时，所有C15细胞都在Dl公司突变体。(J型)额外的C15衍生的Eve细胞在Dl公司突变体。(K（K）)野生型L'sc和Eve表达的示意图，Dl公司突变体和表达Ras1激活形式的胚胎。详见正文。

从中胚层等效群中挑选祖细胞取决于神经原基因介导的侧向抑制(Corbin等人，1991年;Bate等人，1993年;Carmena等人，1995年;贝克和舒比格1996). 如果没有Dl公司在C2和C15中，L'sc和Eve在正确的时间和正常数量的细胞中启动（图。​（图5G、H）。5G、 H）。与野生型不同，D1突变体中的所有C2细胞最初通过获得高水平的L'sc和Eve而像祖细胞一样发育。然而，这种表达在神经源性突变体中是暂时的；在C15形成之前，大多数C2细胞中的这两个标记物都消失了（数据未显示），这与之前记录的神经源性突变体中心包细胞的丢失一致(Hartenstein等人，1992年). 相反，所有C15细胞都作为夏娃的祖细胞存在于Dl公司突变胚胎（图。​（图5I，J）。5一、 J）。本构Ras1和Dl公司与图中的前体规范的正常进展相比，功能损失以示意图的形式显示​图5K。5K.虽然整个预编码区域能够响应RTK/Ras信号，但Dl仅在单个等效组中调节细胞命运决定。此外，Ras1和神经原信号都不影响L'sc前簇的形成。

中胚层功能需要Wg和Dpp Ras1（Ras1）

所有前C2细胞在激活Ras1后发育为夏娃祖细胞。由于preC2的形成依赖于Wg和Dpp，因此我们研究了Ras1的中胚层效应是否需要Wg和Ppp。这种上位性实验是可能的，因为Ras1功能的获得导致夏娃祖先的过度生产（图。​（图4C4C和​和5B–F），5B–F），而这些细胞在重量（wg）和dpp（数据处理程序）突变胚胎（图。​（图6A、B；6A、 B类；Frasch 1995年;Wu等人，1995年). 在任一重量（wg）或dpp（数据处理程序）突变背景下，激活的Ras1对中胚层Eve表达的影响被完全阻断（图。​（图6C、D）。6C、 D）。也就是说，即使Ras1通路是组成性功能，夏娃祖细胞的规范也需要Wg和Dpp。

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图6

涉及中胚层夏娃祖细胞规范的正负信号通路之间的上位关系。对所示基因型的11期胚胎进行Eve表达染色。(一个)在重量（wg）突变体，无中胚层夏娃祖细胞发育。(B类)损失dpp公司该功能导致胚胎强烈的腹化和异常的菌带延伸。然而，中胚层细胞在这些胚胎中迁移，使得中胚层的背缘占据箭头所示的位置。在中胚层的这个或任何其他位置均未检测到Eve的表达dpp（数据处理程序）突变胚胎。(C类)在缺乏重量（wg）功能。(D类)损失dpp（数据处理程序）功能阻断激活的Ras1生成中胚层夏娃祖细胞的能力。(E类)额外的夏娃祖先形成于Dl公司突变胚胎。(F类)没有中胚层夏娃祖先在wg；Dl公司双突变体。

Wg对中胚层功能具有上位性 Dl公司

鉴于相反的中胚层夏娃表型与重量（wg）和Dl公司函数，我们检验了这些阳性和阴性信号之间的上位关系。虽然损失了Dl公司功能导致夏娃祖先的过度生产（图。​（图5I、J5一、 J和6E）和损失重量（wg）功能阻止中胚层夏娃的表达（图。​（图6A），6A） ，一个wg；Dl公司双突变胚胎的Eve表达模式与重量（wg）突变体（图。​（图6F）。6F） ●●●●。因此，即使在没有神经源性基因介导的抑制信号的情况下，Eve祖细胞的形成也需要Wg的积极影响。

中胚层Wg、Dpp和RTK/Ras通路的组合信号传递模型 发展

胚胎中胚层发育中的组合信号模型如图所示​图8。8根据这个方案，Wg和Dpp的联合影响产生了一个广泛的L'sc表达区域，我们称之为预聚类。该区域完整地包含L'sc簇2和15，并包括最接近C2和C15的C14、C16和C17细胞(Carmena等人，1995年). 此预打印区域内的所有细胞都能够响应随后的Ras1信号。然而，由于Htl（C2）或DER加Htl的局部激活（C15），Ras1通路仅在簇前细胞亚群中起作用。RTK信号稳定离散细胞簇中L'sc的表达，随后在整个细胞簇中诱导Eve的表达。整个集群的这种最初的一致反应是一组发育等效细胞的特征(格林沃尔德和鲁宾1992). 最后，神经原基因的抑制作用与三个阳性信号的组合活动相反，以促进单个夏娃祖细胞的鉴定。

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图8

胚胎中胚层发育中Wg、Dpp、Ras1和神经原信号的组合效应模型。Wg（红色）和Dpp（蓝色）表达域的交集描绘了一个预处理器（紫色），其中L'sc最初表示为预聚类（绿色）。整个预集群能够响应随后的RTK/Ras1信号。然而，Htl和DER的局部激活将L'sc限制为表示等价组的预聚类单元的子集。进一步的RTK/Ras1信号激活L'sc簇（橙色）所有细胞中的Eve表达。在神经原基因（粉红色）的侧向抑制作用下确定单个祖细胞。该模型适用于心包肌群和体肌群Eve/L’sc，这两个肌群均来自同一个前簇。为了简单起见，只显示了一个集群。

我们的结果与该模型的各种特征和预测完全一致，可以概括如下。（1） 以L'sc前簇2为代表的制备蛋白具有前后和背腹边界，与Wg和Dpp域的交叉点精确相关。（2） PreC2的形成依赖于Wg，其边界可预测地通过Wg和Dpp的异位表达而改变。（3） 抑制Htl或DER功能不会干扰L'sc制备物。然而，C2编队需要Htl，而C15需要Ht1和DER。（4） RTK/Ras1信号对C2、C15及其祖细胞中Eve的表达至关重要。此外，Ras1的组成性激活足以在preC2的所有细胞中诱导Eve，表明所有preC2细胞都能对RTK/Ras1信号作出反应。（5） 活化MAPK的空间表达证实RTK信号在等价群形成过程中定位。（6） 与Wg和Dpp赋予中胚层细胞对指导性Ras1信号作出反应的能力一致，激活的Ras1未能诱导Eve在重量（wg）和dpp（数据处理程序）突变胚胎。此外，所有三种信号的组合活动足以诱导中胚层夏娃细胞的命运。（7） 神经原基因功能的丧失会导致L'sc簇中的所有细胞都成为祖细胞，正如对等组中的细胞所预期的那样(格林沃尔德和鲁宾1992). 此外，在没有Dl功能的情况下，祖细胞规范仍然需要正Wg信号。（8） 信号事件的拟议时间顺序与Wg、Dpp和双磷酸MAPK表达的时间以及与改变这些信号中的每一个相关的表型效应一致。

我们模型的一个显著特征是，等效群的形成是对两个RTK在更大的准备区内作用的局部化函数的响应。中胚层二磷酸MAPK表达模式不仅为这一假设提供了有力的支持，还提出了上游受体如何在活性细胞的离散亚群中被激活的问题。对于C15，这可能是通过P2的诱导发生的，P2表达菱体，菱体是一种可以非自主刺激邻近细胞DER的因子(Golembo等人，1996年;Buff等人，1998年). Htl的局部激活可能是由于其尚未识别的配体的限制表达所致。Htl本身富含Eve阳性的中胚层细胞群，这一过程也可能有助于这些簇的Htl依赖性形成(Michelson等人，1998年).

Wg和Dpp对前簇形成有指导作用，但仅允许诱导夏娃祖细胞。然而，由于激活Ras1的中胚层效应在重量（wg）和dpp（数据处理程序）突变胚胎。因此，Wg、Dpp和Ras1通路并不是以严格的顺序方式来指定夏娃祖先。

P2和P15都表达Eve，彼此非常接近，并由相关的信号机制指定，但它们分化为不同的结构。这些祖细胞不同的发育命运可能由参与其形成的不同RTK决定。虽然P2只需要Htl，但Htl和DER对P15都至关重要(Buff等人，1998年;Michelson等人，1998年; 本文）。不同的下游信号通路，或相同信号传感器的不同定量输出，可以解释这两个RTK介导的独特反应(1995年马歇尔;Clandinin等人，1998年). L'sc簇14和16的行为表明存在Eve表达所需的RTK信号阈值。虽然C14和C16是Htl依赖性的，并且至少两个簇中的一些细胞位于Wg/Dpp结构域内，但除非Ras1在体外被激活，否则这两个簇都不表达Eve。其他胚胎肌肉的形成也可能存在不同的DER活性阈值(Buff等人，1998年).

几十年来，人们一直在考虑开发性准备物的概念(斯特恩1954). 制备物的存在通常是通过鉴定一个广泛的区域来推断的，该区域能够承担只有一个或几个细胞通常采用的命运。我们已经证明Wg和Dpp的交叉表达创造了一种中胚层制备物。因为Wg和Dpp表达模式的机制可以追溯到母体系统，母体系统启动了基本身体计划的形成果蝇属胚胎(劳伦斯1992)我们的发现提供了特定组织早期发育过程和后期分化之间的直接联系。

与祖细胞相关的正负信号的对立活动 规范

L'sc和Eve最初通过Wg、Dpp和Ras1的协同功能在C2和C15的所有细胞中激活。然而，神经原基因的抑制作用确保只有一个祖细胞保留这些标记的表达。因此，神经原信号与Wg、Dpp和RTK/Ras通路的积极影响相对立。这些相反功能的一种情况涉及正负信号的连续、非重叠活动。然而，反对这种机制的是我们的观察，即二磷酸MAPK在簇形成后持续存在，并逐渐局限于单个祖细胞。这意味着RTK信号与Notch介导的侧向抑制一致，并表明祖细胞规范涉及Ras和Notch通路之间的竞争或拮抗相互作用。

中胚层信号分子与核决定因子的相互作用 命运

已鉴定出几种在中胚层发育中具有重要功能的转录因子，包括Twi和Tin。除了在中胚层决定中的早期作用外，Twi表达水平的后期波动细分了中胚层(Dunin Borkowski等人，1995年;Baylies和Bate，1996年). 夏娃祖先通常出现在高Twi域(Dunin Borkowski等人，1995年)这可能解释了为什么异位Wg、Dpp和Ras1对Eve最强烈的激活仅限于Twi水平较高的细胞。

Tin还通过确定背部中胚层的身份（包括以Eve表达为特征的身份）来细分中胚层(Azpiazu和Frasch 1993年;Bodmer 1993年). 除了需要适当水平的Twi外，Ras1还必须存在锡以诱导夏娃祖细胞的形成(Michelson等人，1998年). 由于背侧Tin表达依赖于Dpp(Staehling-Hampton等人，1994年;Frasch 1995年)，锡可以被视为Dpp途径的下游成分，该途径涉及Eve祖细胞规范。因此，中胚层固有的转录因子，但部分由本文分析的外源信号控制，对祖细胞规范的组合模型做出了关键贡献。

中胚层RTK的多重作用 信号

RTK信令果蝇属胚胎中胚层对细胞迁移很重要(Beiman等人，1996年;Gisselbrecht等人，1996年;Shishido等人，1997年)和细胞命运规范(吕尔等人，1997年;Buff等人，1998年;Michelson等人，1998年). 我们在此表明，后一个角色可以划分为几个不同的功能。首先，Htl和DER促进L’sc簇或等价群的形成。第二，Ras1信号在整个等效细胞组中激活身份基因表达。第三，活化的MAPK仅限于祖细胞，这表明RTK信号在祖细胞选择中起作用。第四，MAPK在来自单一祖先的兄弟创始人中被重新激活，这表明RTK活动有助于建立或维持由其祖先的不对称分裂所引发的创始人身份(Ruiz Gomez和Bate 1997;Carmena等人，1998年). 另外，一些创始细胞中的RTK功能可以促进其分化。激活Ras1的能力在mbc公司突变胚胎与最后一种可能性相一致。有趣的是，RTK/Ras1途径在发育过程中以类似的顺序使用果蝇属复眼(弗里曼1996).

我们感谢以下同事提供蝇种、抗体和原位杂交探针：M.Frasch、R.Nusse、D.Kiehart、W.Gelbart、M.Baylies、N.Perrimon、M.Hoffmann、A.Manoukian、H.Krause、S.Greig、M.Akam、E.Olson和Bloomington果蝇属库存中心。J.Skeath为增强抗二磷酸MAPK染色提供了宝贵的建议。我们感谢M.Halfon、L.Garcia-Alonso、M.Baylies和I.Guerrero对手稿的有益讨论和评论。A.C.和F.J.分别得到了一个博士前研究金和西班牙国家调查总署的资助。A.M.M.是霍华德·休斯医学研究所的助理研究员。

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