高分辨率定位果蝇属体内热休克基因的Spt5和Spt6：在启动子近端暂停和转录延长中的作用

果蝇Spt5和Spt6在多线染色体上的免疫定位

通过分析转录因子在多线染色体上的分布，可以发现其潜在功能的线索。为了研究Spt5和Spt6的可能作用，我们使用从野生型或转基因非热休克或热休克三龄幼虫制备的多基因染色体，通过免疫荧光检测了它们的染色体定位。在非热休克条件下，Spt5分布在多线染色体上，并对依赖于阶段、蜕皮激素诱导的发育烟团进行染色，这些烟团具有转录活性（图。​（图2A）。2A） ●●●●。Spt5模式取决于幼虫的发育阶段，最集中于转录高度活跃的部位。该模式与之前观察到的模式非常相似，并详细绘制了P-TEFb的细胞周期蛋白T亚基(Lis等人，2000年; （见下文）。Spt6也出现在发育期的烟团中，其整体形态与Spt5非常相似（图。​（图2，2，参见B与A）。为了确定Spt5和Spt6是否定位于相同的染色体位点，我们用不同的Spt5与Spt6抗体组合进行了联合免疫荧光实验。不管测试的不同动物的抗体组合如何，结果都是一样的：Spt5和Spt6在多基因染色体上显示出相当大的共定位，特别是在标记最强烈的染色体簇上，这些簇被认为是高活性转录位点（图。​（图2C）。2C） ●●●●。尽管由此产生的染色模式合并产生了一些更为绿色或红色的带，但仔细检查表明，大多数位点都不同程度地被两者标记。因此，Spt5和Spt6同时存在于活性转录位点。

为了验证Spt5和Spt6被招募到转录活性位点，我们检查了它们在热休克位点的定位。虽然在未诱导的热休克位点或其附近存在一些Spt5染色，但Spt5和Spt6都被强烈招募到激活的主要热休克位点：热休克蛋白7087A和87C的基因，67B的小热休克基因，热休克蛋白8363B，热休克蛋白6895D和93D的非编码热休克转录单位（图。​（图1B、C）。1B、 C）。此外，在含有转基因的位点热休克期间可以观察到Spt5和Spt6hsp70–LacZ位于61A和9E或59B的基因(70Z码; 图。​图1B1B和C）。因此，在热休克基因激活期间，Spt5和Spt6被招募到内源性和转基因热休克位点。

Spt5和Spt6与HSF、细胞周期蛋白T和RNA聚合酶II最大亚单位的比较免疫荧光

我们将Spt5或Spt6的分布与其他对转录延长至关重要的因子（cyclin T和Pol II）的分布进行了比较。最初在非热休克条件下对多基因染色体上的共免疫荧光模式进行了检测。因为Spt5与Spt6共同定位（图。​（图2C），2C） ，我们仅对Spt6与其他因素进行了比较。我们之前已经观察到细胞周期蛋白T（P-TEFb）集中在转录活性位点(Lis等人，2000年). 与Spt6和cyclin T的协同实验表明，它们在非诱导动物的高活性发育位点共同定位最显著（图。​（图2D）。2D） ●●●●。在3龄早期（烟粉虱2期），标记的主要位点为3C、23E、68C、71E和90BC。其中五分之四的位点含有大量表达的唾液腺分泌蛋白。我们观察到Spt6和Pol II之间存在类似的共定位模式，特别是在高活性转录位点（图。​（图22E） ●●●●。

热休克后HSF在主要热休克部位迅速积累。它还集中于一组额外的～150个位点，其中大多数在热休克期间转录不高(Westwood等人，1991年). 在热休克条件下，Spt6不会出现在这些额外的位点上（图​（图3A）。三A） ●●●●。

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图3

本地和转基因热休克烟团Spt6的全球和高分辨率分析。(A类)热休克条件下Spt6（大鼠）和HSF（兔）的比较免疫荧光。Spt6被招募到热休克位点，但不是所有HSF定位位点。(B、 C类)与HSF、cyclin T和Pol II相比，对Spt6分布进行高分辨率研究。本地热休克基因座87A和87C的地图以及hsp70–LacZ显示了转基因。HSF和cyclin T在本地和转基因热休克位点都从Spt6中分解。在转基因时，这些抗体将位点染色在与启动子和5′序列一致的区域。注意HSF染色模式（白色箭头）。cyclin T和Spt6共链中87A和87C以上的位点是热休克位点67B。Spt6和Pol II在热冲击波中几乎完全重叠。(D类)带有cyclin T、HSF和Spt6的三重标签。

为了扩大我们对Spt5和Spt6被招募到热休克位点的观察，并绘制这些因素的分布图，我们对主要热休克发作（87A和87C）和hsp70–LacZ插入转基因蝇系(Simon等人，1985年; 图。​图3B，C）。三B、 C）。Spt5和Spt6在87A和87C时对内源性热休克烟团染色严重，并且在烟团内出现一致性。Spt6同样与Pol II共定位，但部分从cyclin T和HSF分解（图。​（图3B）。三B） ●●●●。转基因插入物允许将荧光带明确分配给特定的DNA片段，因为它位于通常不包含热休克基因的特定染色体位点。此外，转基因位点不同于内源性热休克蛋白70位点，包含单个热休克蛋白70基因。因此，通过将因子定位到这个转基因位点，我们可以更直接地解释烟团中的蛋白质分布。在热休克条件下对该位点进行染色，使我们能够区分转基因位点中Spt6和HSF的离散分布：Spt6在热休克烟团体内显示染色模式，而HSF仅限于烟团边缘（图。​（图3C）。三C） ●●●●。Spt6和cyclin T显示出相似的分布，尽管cyclin T更经常集中在烟团的启动子近端。HSF、cyclin T和Spt6抗体的三重免疫荧光标记显示，cyclin T和Spt5在天然和转基因烟团中显著重叠，并从HSF中分离出来（图。​（图3D）。三D） ●●●●。此外，Spt6与Pol II的共同免疫荧光在转基因烟粉虱体内始终显示出明显的染色重叠。总之，Spt5和Spt6与Pol II共定位，从HSF中分解，并可能在多基因染色体上的内源性和转基因热休克烟团中部分从cyclin T中分解。

热休克基因hsp70、hsp26和hsp83的交联和免疫沉淀分析

Spt5和Spt6在本地和转基因热休克位点的细胞学定位表明，这些蛋白与热休克基因相关。为了证实这一点并更精确地绘制这些蛋白质的位置，我们进行了交联和免疫沉淀分析。我们治疗了果蝇属在非热休克或热休克条件下用甲醛培养细胞，在CsCl梯度上分离交联的蛋白质-DNA复合物，并使用特异性抗体免疫沉淀这些复合物。用扩增启动子和5′-或3′-转录片段的引物，通过聚合酶链反应（PCR）分离和分析共免疫沉淀DNA热休克蛋白70（图。​（图4A，4A、 碎片2,3,4）。将共沉淀DNA的量与交联和免疫沉淀分析中使用的总DNA的10倍连续稀释液组成的标准进行比较。为了控制特异DNA的免疫沉淀，我们使用了PCR引物热休克蛋白70启动程序（图。​（图4A，4A、 片段1）。该分析重复多次，并使用成像软件定量免疫沉淀物中溴化乙锭染色带。典型实验的结果显示了PCR分析的每个片段（图。​（图4B），4B） ，并且还显示了具有标准偏差的几个实验的平均值（图。​（图4C）。4C） ●●●●。

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图4

Spt5和Spt6的交联和免疫沉淀热休克蛋白70. (A类)的示意图热休克蛋白70以及PCR-扩增的片段，这些片段代表了基因的上游区域（1）、启动子（2）、5′端（3）和3′端（4）热休克蛋白70启动子元件、转录起始位点和终止点被标记，但没有按比例绘制。(B类)在溴化乙锭（EtBr）染色的2%琼脂糖凝胶上对交联和免疫沉淀DNA进行PCR分析。使用10%、1%和0.1%的输入DNA进行PCR反应，以确定信号的线性范围。NHS，非热休克；（HS）热冲击；（前）免疫前血清；（−）无DNA。(C类)定量分析用于PCR分析的EtBr染色带。横坐标上的值表示免疫沉淀的量占总输入DNA的百分比。实验一式三份，并显示标准偏差。注意片段3免疫沉淀物条形图的不同比例。

先前的紫外线交联研究表明，在未诱导的细胞中，Pol II与热休克蛋白70启动子近端片段(Gilmour和Lis 1986年). 其他研究表明，Pol II位于一个合成了21–35个RNA核苷酸的暂停复合物中(拉斯穆森和利斯1993). 这里我们还观察到Pol II抗体免疫沉淀热休克蛋白70启动子和5′片段在非热冲击条件下（图。​（图4C）。4C） ●●●●。该观察结果与热休克前占据基因5′端的暂停聚合酶一致。我们还观察到5′DNA片段增加了三倍，3′DNA片段的增加幅度大于10倍热休克蛋白70在热休克条件下用Pol II抗体免疫沉淀DNA片段。这与Pol II在热冲击时密度的估计增加是一致的。未诱导基因包含一个与基因5′端相关联的Pol II，而诱导基因既有一个启动子近端暂停的PolⅡ，又有一个延长的PolⅢ复合物，间隔100 bp(O'Brien和Lis 1993年).

最近的体外研究表明，Spt5和Spt4参与RNA聚合酶II启动子近端暂停(Wada等人，1998年a). 为了确定体内是否存在这种情况，我们使用Spt5抗体进行交联和免疫沉淀分析，并确定Spt5是否位于热休克蛋白70在非热休克样品中，Spt5抗体免疫沉淀大约是热休克样品的八倍热休克蛋白70启动子和5′DNA比3′片段。免疫沉淀DNA的定量比较表明，在由未诱导和诱导细胞制备的样品中，Spt5与启动子和5′区的关联非常相似，但在热休克时似乎增加了～30%（图。​（图4C）。4C） ●●●●。我们观察到在热休克时被Spt5抗体免疫沉淀的3′片段大约增加了五倍。从这些结果中，我们得出结论，Spt5在启动子和5′区的密度相对较高热休克蛋白70未诱导细胞和热休克细胞中的基因，转录单元上的Spt5密度也显著增加。

热休克会触发几个因子向热休克基因的启动子或转录区募集。活化的HSF与热休克蛋白70; 因此，我们使用交联和免疫沉淀法检测HSF分布。HSF抗体免疫沉淀的DNA片段代表基因的启动子和5′端，而不是3′端热休克蛋白70碎片（图。​（图4C）。4C） ●●●●。免疫沉淀DNA的水平在热休克反应中增加了大约两倍，并且积累仅限于启动子和5′区（图。​（图44C） ●●●●。

多基因染色体的免疫荧光研究表明，P-TEFb（cyclin T亚单位；Lis等人，2000年)和Spt6（本研究）被招募来进行热休克吞吐。我们使用交联和免疫沉淀在更高分辨率下检查了它们的招募和分布。Spt6和cyclin T抗体免疫沉淀未诱导细胞中的启动子片段水平较低，但诱导细胞中启动子片段的水平要高出四到五倍（图。​（图4，4，C2）。Spt6和细胞周期蛋白T集中在5′转录序列上，因为两种抗体沉淀的5′片段大约是启动子片段的三倍（图。​（图4，4，参见C3和C4）。此外，Spt6和cyclin T免疫沉淀物显示，从非热休克状态到热休克状态，3′片段增加了四倍，表明这些因子也被招募到基因的3′端（图。​（图4，4，C4）。这些数据表明Spt6和cyclin T可能占据未诱导的热休克蛋白70基因5′区处于低水平，热休克后在基因体上积累到较高密度。

为了研究这些蛋白在其他热休克基因上的分布，我们对其进行了交联和免疫沉淀分析高速第26页和热休克蛋白83使用相同的抗体集合（图。​（图5）。5). 这些结果用引物扩增热休克蛋白26启动子或3′端在性质上与类似片段的类似热休克蛋白70.热休克基因启动子高速第26页和热休克蛋白83，截至热休克蛋白70，即使在热休克之前也被高水平的Spt5占据。此外，5′和3′区域在未诱导细胞中显示出低水平的Spt6、cyclin T和Pol II关联，并且它们的水平在热休克时增加。共免疫沉淀分析热休克蛋白83DNA与高速第26页和热休克蛋白70因为更多的DNA是通过未诱导蛋白的HSF抗体沉淀出来的——DNA制剂（参见图。​图5E5E和图。​图4C4C和​和5C）。5C） ●●●●。这一结果与免疫荧光研究表明的一致热休克蛋白83是非热休克苍蝇中HSF抗体显著染色的一个热休克位点(Westwood等人，1991年). 因此，这些分析表明，这些不同的转录因子沿着热休克基因的启动子和转录区域显示出特征性分布：HSF仅限于启动子区域，而Spt5、Spt6、cyclin T和Pol II更广泛地分布在诱导转录单元上。

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图5

Spt5和Spt6的交联和免疫沉淀高速第26页和热休克蛋白83. (A、 D类)的示意图高速第26页和热休克蛋白83以及代表启动子（1）和3′端（2）的PCR-扩增片段。(B、 E类)EtBr染色2%琼脂糖凝胶上交联和免疫沉淀DNA的PCR分析高速第26页(B类)和热休克蛋白83(E类). (C、 F类)用于PCR分析的EtBr染色带的定量分析高速第26页(C类)和热休克蛋白83(F类). 实验一式三份，并显示了标准偏差。（NHS）非热冲击；（HS）热冲击；（前）免疫前血清；（−）无DNA。

为了以更高的分辨率分析这些因子的分布，我们在免疫沉淀前用限制性内切酶消化交联蛋白-DNA复合物，并通过连接介导PCR（LMPCR）分析共沉淀DNA；Guzman和Lis 1999). 蛋白质-DNA复合物的这种限制性内切酶裂解允许在限制性内切图的水平上定义蛋白质-DNA交联的位置。消化后的DNA片段，一旦免疫沉淀，按照材料和方法中的描述进行处理。如图所示​图6A，6A、 部分消化热休克蛋白70DNA，然后是免疫沉淀和LMPCR，导致产生几个可以量化的特异条带。我们计算并绘制了免疫沉淀物质相对于每个片段总数的百分比（图。​（图6B）6B） 然后在单个片段上绘制相对蛋白质密度（图。​（图6C）。6C） ●●●●。我们使用这种更高分辨率的LMPCR技术来绘制通过上述常规PCR方法分析的转录因子组的分布图。

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图6

蛋白质占有率的高分辨率测定热休克蛋白70. (A类)连接介导的PCR分析hsp70、hsp70部分消化产生的限制性内切酶位点和片段Hin公司fI，和姆博II位置显示在凝胶的右侧，这些位置定义了所分析区域的一端：生态RII用于切割DNA以完成分析，从而确定分析区域的另一端。该消化物产生的片段如图所示：a、b、c和d。从免疫沉淀步骤开始，进行一式三份的完整分析，不同的样品对所有定量的条带显示出非常好的一致性。“Pre”是用免疫前血清对照物进行的免疫沉淀。(B类)确定热休克蛋白70相对于输入的DNA，DNA免疫沉淀。对每个病例的色带进行量化，并减去免疫前对照组的背景信号。绘制四个片段中每个片段的免疫沉淀总样本的百分比。三胞胎出现在Hin公司fI+102（参见A类)小长度多态性的结果热休克蛋白70基因和来自整个三联体的信号被用来量化这个片段。请注意，HSF和Pol II抗体联合免疫沉淀的DNA比Spt6和cyclin T抗体多（请注意横坐标的不同刻度）。(C类)蛋白质密度的测定热休克蛋白70.密度是根据部分测量值计算得出的B类每个区间的密度是通过减去下一个最短的片段（除了a，它是最短的），然后除以DNA区间的长度得出的。注意横坐标的不同比例。（%XL）交联免疫沉淀DNA相对于输入的百分比；（bp）碱基对；(*)³²P端标签。

LMPCR方法的结果与低分辨率PCR分析的结果一致。例如，启动子/5′DNA片段（−148至+102）在热休克前与Pol II抗体共沉淀，热休克时其水平增加（图。​（图6C）。6C） ●●●●。这些观察结果与Pol II在未诱导条件下与近动机区相关，并在热休克时被招募到高密度相一致。热休克前，−148至+102片段也与Spt5和HSF抗体共沉淀，热休克时其水平增加（图。​（图6C）。6C） ●●●●。Spt6和cyclin抗体在热休克前均不能共沉淀−148至+102片段的可检测水平，但在热休克时两者都能共沉淀。然而，我们的分析检测到，在非热休克条件下，所有五种抗体的+102至+238区域的共沉淀DNA水平较低（图。​（图6C），6C） ，在热休克时水平急剧增加。+238至+330段是所分析的最远端片段，在热休克前未被任何所分析抗体检测到共沉淀；然而，在热休克时，Pol II、Spt5和Spt6抗体可以有效地共同沉淀。从这些观察结果来看，Spt5、Pol II和HSF似乎占据了未诱导细胞中从−148到+102的区域。热休克触发Pol II、细胞周期蛋白T、Spt5和Spt6强烈募集到细胞的+102至+330区域热休克蛋白70基因；然而，HSF主要被招募到包含启动子的片段中。因此，这种LMPCR方法证实并扩展了低分辨率PCR和免疫荧光分析。

Spt5和Spt6与未诱导热休克基因的关联

先前的研究表明，Pol II占据了未诱导的5′端高速第26页和热休克蛋白70热休克基因(Gilmour和Lis 1986年;Rougvie和Lis 1990年). 我们的交联和免疫沉淀数据清楚地表明，Spt5也占据了未诱导热休克基因启动子和5′转录区。对这种Spt5定位的一个可能解释是，它可能在与Spt4的复合物中起作用，以保留暂停的聚合酶。或者，Spt5可能负责建立或维持（或两者兼有）与热休克基因启动子近端暂停聚合酶相关的增强染色质结构。Spt6和cyclin T也占据了热休克蛋白705′端在非热冲击条件下，但与Spt5不同，这些因素主要存在于+102到+238之间热休克蛋白70通过高分辨率分析。这接近但不与Spt5和暂停的Pol II的峰值重叠。此前已有研究表明，Spt6与组蛋白相互作用，在体外组装染色质，并在体内调节染色质结构(Bortvin和Winston，1996年). 因此，我们观察到，Spt6与热休克蛋白70与Spt6在未诱导的5′端组织染色质结构中的作用并不矛盾热休克蛋白70基因。或者，Spt6和cyclin T存在于未诱导的热休克蛋白70基因代表了这些因子中的一小部分，这些因子与逃避停顿的Pol II分子有关。

令人惊讶的是，一些HSF占据了未导入的热休克蛋白70和高速第26页在热休克之前启动子，尽管其水平低于热休克期间。虽然我们不能排除HSF通过甲醛诱导的应激反应被招募的可能性，但我们观察到HSF在热休克蛋白70使用甲醛处理短至30秒的细胞的促进剂（数据未显示）。也许HSF与未诱导的启动子结合，尽管其水平和亲和力低于热休克期间。

Spt5和Spt6是通用转录延伸因子

Spt5存在于未诱导热休克启动子上的观察结果表明，DSIF（Spt5/Spt4）可能在转录延伸过程的早期发挥作用。DSIF复合物导致体外转录系统中短转录物的形成(Wada等人，1998年a)其大小与体内暂停的Pol II相似(拉斯穆森和利斯1993). 将P-TEFb添加到体外转录系统中可产生全长转录物(Wada等人，1998年a). 根据这些体外观察，我们预测Spt5和细胞周期蛋白T将在体内转录位点共定位，至少在DSIF和P-TEFb发挥这些明显拮抗作用的转录单元开始时。Spt5、Spt6、cyclin T和Pol II与发育表达的蜕皮激素和胞间膨化相关，并表现出与转录作用一致的时间变化。免疫荧光分析表明，这些因子分布在烟团中，表明它们在转录单位中起作用。因此，这些研究支持Spt5、Spt6和P-TEFb可能协同工作并在体内转录延伸中发挥广泛作用的模型。

Spt5和Spt6被招募用于热休克基因

我们观察到Spt5和Spt6在本地和转基因热休克基因座上的募集。而且，正如在发育表达位点观察到的那样，Spt5和Spt6定位在热休克烟团中。Spt5和Spt6的募集量和动力学与HSF和cyclin T的募集量及动力学惊人地相似。募集还需要活性HSF，因为HSF DNA结合域中的温度敏感性突变阻止了Spt6之间的关联（图。​（图7A）7A） 和cyclin T(Lis等人，2000年)用热休克泡芙。这些结果表明，Spt5和Spt6在转录激活早期被招募，并可能在转录的任何步骤中发挥作用。重要的是，激活的热休克基因对Spt5和Spt6的补充表明，它们可能对这些基因产生积极影响。在天然和转基因热休克泡芙中，Spt5和Spt6彼此重叠，并与Pol II重叠，但从细胞周期蛋白T和HSF中分离出来。这表明，Spt5和Spt6沿着转录单位具有不同于启动子相关因子的功能。

高分辨率交联和免疫沉淀方法证实并扩展了免疫荧光结果。虽然免疫荧光研究表明，Spt5和Spt6被招募用于热休克吞吐，但交联和免疫沉淀分析表明，Spt 5和Spt 6被招募到DNA片段的5′端和3′端hsp70、hsp26，以及热休克蛋白83热休克基因。Pol II定位于诱导热休克基因，这与免疫荧光分析一致，而HSF仅限于启动子。免疫荧光、交联和免疫沉淀分析表明，细胞周期蛋白T分别占据烟团和基因的5′半。基因5′端较高浓度的P-TEFb可能反映了激酶活性的靶向性，以磷酸化新招募的Pol II分子或似乎与暂停聚合酶相关的Spt5多肽(Wada等人，1998年a,b条). 因此，交联和免疫沉淀结果表明，在热休克细胞中，Spt5、Spt6、P-TEFb和Pol II在整个转录单元中被强烈招募，但更集中在5′区，而不是3′区热休克蛋白70HSF主要与启动子相关。

重组蛋白纯化和抗体生产

将麦芽糖结合蛋白融合构建物转化为BL21-DE3细胞，并使用IPTG诱导重组蛋白。根据制造商的建议（NEB），对细胞进行裂解，并在直链淀粉树脂上处理重组蛋白并从中洗脱。蛋白质通过Bradford分析或与BSA标准直接比较进行定量。将每种重组因子的100μg等分样品送往Pocono兔场和实验室进行抗体生产。分别将Spt5N、Spt5M和Spt5C注射到鸡、兔和豚鼠体内。将Spt6注射到大鼠和豚鼠体内。家兔和豚鼠注射HSF。通过Western blot和间接免疫荧光检测抗体以确定效价。

间接免疫荧光

如前所述，唾液腺多线染色体被分离并安装在载玻片上(Lis等人，2000年). 在以下稀释液中用一级抗体对多聚烯进行染色：HSF，1:50或1:100；速度5，1:100；速度6，1:50或1:100；细胞周期蛋白T，1:20；兔抗Pol II（外显子2）由E.Wong（康奈尔大学）亲和纯化并提供。使用带有共轭标签（异硫氰酸荧光素或罗丹明）的适当二级抗体，并收集图像。对于三重标记，第三个二级抗体与Alexa Fluor 350（分子探针）结合。

果蝇细胞的甲醛交联

果蝇属如前所述维持Kc细胞Lis等人，2000年). 细胞生长到5×10的密度⁶在旋转烧瓶中每毫升的细胞数，并去除等量的非热休克和热休克样品的细胞。热休克细胞在处理前在36.5°C下培养20分钟。将甲醛添加到0.1%的最终浓度，并在台式或摇床上与细胞混合不超过3分钟。将甘氨酸添加到125 mM的最终浓度并混合3分钟。细胞在2000年离心克收集细胞5min，倒出上清液。将细胞颗粒重新悬浮在Kc裂解缓冲液中（100 mM KCl、50 mM NaCl、5 mM MgCl₂，pH 7.4时为10 mM Tris-HCl，0.5 mM PMSF）。向浆液中添加0.1体积的10%非idet P-40（NP-40），并将混合物置于冰上5分钟，间歇涡流。2000年对溶解的细胞进行离心克收集细胞核10分钟。去除上清液后，将细胞核完全重新悬浮在悬浮缓冲液中（100 mM NaCl，10 mM Tris，pH 8，1 mM EDTA，0.1%NP-40）。在加入0.1体积%的sarkosyl的情况下裂解细胞核。将粘性材料转移到SS-34管中，并使用Markson MK40超声波处理器进行超声处理，在输出设置50时进行五次，在设置60时进行五次声处理，在设置70时进行五倍声处理。所有的超声波步骤都是在一个寒冷的房间里的冰上进行的，每次脉冲间隔20秒。在琼脂糖凝胶上检查声波DNA，以确定大致大小。为了清除不溶性核碎片，2000年对材料进行了离心分离克将该核裂解物覆盖在氯化铯阶梯梯度（1.75 g/cm）上10 min^三，1.5克/厘米^三和1.3克/厘米^三)并在SW28转子中以26000 rpm在20°C下离心30 h。用18号针头刺穿管子底部后收集碎片。使用折光仪鉴定蛋白质-DNA复合物，并将折光指数在1.38和1.4之间的组分混合。在4°C下对混合组分进行透析，以对抗SE缓冲液的至少三种变化（0.1%沙棘糖、pH 8.0下的50 mM Tris-HCl、2 mM EDTA）。然后将这些蛋白质-DNA复合物进行鉴定并储存在−80°C下，或立即用于免疫沉淀。

蛋白质-DNA复合物的免疫沉淀

用50μL 50%蛋白a琼脂糖珠悬浮液（GIBCO BRL）预处理蛋白质-DNA复合物（1 mL，约1 mg/mL）。这样做2小时，将珠向下旋转，收集上清液并合并。将蛋白质-DNA复合物分为100μL等分样品，并在4°C的旋转轮上用抗体处理过夜。第二天，将50μL 50%蛋白a琼脂糖微珠悬浮液添加到免疫沉淀液中，并孵育4小时。清洗步骤在室温下进行，随后在1000℃下旋转1分钟克。每次清洗均使用1mL清洗液进行。在洗涤缓冲液中洗涤珠子七次（50 mM HEPES/KOH，pH 7.5，140 mM NaCl，1 mM EDTA 1%Triton X-100，0.1%脱氧胆酸钠，0.5 mM PMSF），一次用500 mM NaCl洗涤缓冲液，一次使用锂洗涤缓冲液（10 mM Tris-Cl，pH 8.0，0.25 M LiCl，1mM EDTA，0.5%NP-40，0.5%去氧胆酸盐钠），另一次用TE。最终清洗后，通过添加100μL洗脱缓冲液（pH 8.0下50 mM Tris-Cl，10 mM EDTA，1%SDS）洗脱蛋白质-DNA复合物，并在65°C下培养15分钟。在6000℃下旋转珠克将上清液转移到新试管中。将小球重新悬浮在150μL洗脱缓冲液中，并在6000℃下离心克。将此洗涤液的上清液添加到第一次洗脱中，并在65°C下翻转交联过夜。从起始材料来看，10%被用作总DNA对照。通过添加230μL的1×TE和10μL的10%SDS并在65°C下孵育过夜，总DNA对照样品的交联也被逆转。随后用等量的缓冲苯酚和氯仿分别提取DNA样品两次。然后通过添加25μL 4 M LiCl、2μL糖原（10 mg/mL）和625μL 100%乙醇沉淀DNA。共免疫沉淀DNA在15000下旋转30分钟克用70%乙醇洗涤，最后再悬浮在50μL TE中，用于PCR或连接介导PCR。

用PCR测定蛋白质与DNA的相互作用

为了进行PCR分析，在5个pM引物、5 mM dNTPs、10×Taq缓冲液（0.2 M KCl、0.1 M Tris，pH 8.0）、25 mM MgCl的存在下培养1μL共免疫沉淀DNA₂，2U Taq DNA聚合酶，用水稀释至最终体积20μL。典型的PCR反应为：94°C，1分钟；60°C，30秒；和72°C，30秒25个周期，然后在72°C下一个周期10分钟。PCR引物成对列出：HSP70-998、GCCCCTTT GAGTTCTAACCATCC和HSP70-572、GGTTCTTTGCTT AATTAAACGC；HSP70-365、GGCCTTCTGGCGGACAAC ATCC和HSP70-3、CGCTCCGTCGACGAGCC；HSP70-5、GCGTCAATTCAACAAGC和HSP70+412、CCT GGTTCTGGCCGTCCG；HSP70+1758、CGACAAGG GACGCCTTCGCAGG和HSP70+2182、GGCCTTAGTCG ACCTCCTCGACC；HSP26-382，CCGTTAGCCGGCTGTTT CTTTTGCG和HSP26+113，AACTTGTTTGACTTTAAG CAAAGG；HSP26+702，CGCATCATTCAAATTCAGAGAGAT GG和HSP26+1195，GGTGAACTTTTCGGACACGA GC；HSP83-458、CCACGAGTCTTGAAACTCGG和HSP83-18、GCGTCTGCTTTTATAAAAACC；HSP83+1620、GGTGCGACATTTCCATCGG和HSP83+2030、CCT CATCCTCGCCAACATCCTCG。PCR反应（20μL）加载到2%琼脂糖凝胶上，用溴化乙锭（EtBr）染色检测条带。使用QuantityOne成像软件和Bio-Read Gel Doc 2000对EtBr染色带进行定量。

我们感谢Dong-ki Lee对启动子暂停复合物中Spt5的作用以及全长Spt5质粒中Zhouyu Ni的作用进行了研究；HSF的Paul Mason和Spt5的Brian Schwartz；Michael Seidman负责底漆设计；和David Price检测细胞周期蛋白T抗体。我们还要感谢弗雷德·温斯顿和克雷格·卡普兰在出版之前讨论了他们的研究结果。我们感谢玛丽亚娜·沃尔夫纳、W.Lee Kraus、杰弗里·罗伯茨和利斯实验室成员对手稿和科学讨论的评论。这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）对J.T.L.的拨款GM25232和国家研究服务奖（National Research Service Award）对E.D.A.的拨款GM19999的支持。

这篇文章的出版费用部分是通过支付版面费来支付的。因此，根据《美国法典》第18卷第1734节，本篇文章必须标记为“广告”，以表明这一事实。