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N英格兰医学杂志。作者手稿；PMC 2012年2月25日提供。
以最终编辑形式发布为：
N Engl J Med.2011年8月25日；365(8): 709–717.
2011年7月27日在线发布。 数字对象标识：10.1056/NEJMoa1106920
预防性维修识别码：项目经理3168948
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院320785
PMID：21793740

的起源大肠杆菌导致德国溶血性尿毒症爆发的菌株

大卫·A·拉斯科，博士。，戴尔·R·韦伯斯特，博士。，杰森·萨赫，博士。，阿里·巴希尔，博士。，纳迪亚·博伊森，博士。，Flemming Scheutz公司，博士。，埃伦·帕西诺斯，博士。，罗伯特·塞布拉，博士。，陈珊琴，博士。，迪米特里斯·伊利奥普洛斯，博士。，亚伦·克拉默，博士。，保罗·佩卢索，博士。，劳伦斯李，博士。，安德烈·基斯柳克，博士。，詹姆斯·布拉德，博士。，安德鲁·卡萨斯基，博士。，苏珊娜·王，理学学士。，约翰·艾德，博士。，大卫·兰克，博士。，朱莉娅·雷德曼，理学学士。，苏珊·斯泰耶特，博士。，雅各布·弗里莫德·默勒工程硕士。，卡斯滕·斯特鲁夫，博士。，安德烈亚斯·彼得森，博士。，凯伦·科洛菲尔，博士。，詹姆斯·纳塔罗医学博士、博士、文学学士。，埃里克·沙特博士和马修·沃尔多医学博士、博士。
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

背景

由一种不寻常的产志贺毒素血清型引起的腹泻和溶血尿毒症综合征的大规模爆发大肠杆菌（O104:H4）于2011年5月在德国开始。截至7月22日，大量由产志贺毒素引起的腹泻病例大肠杆菌据报道，有3167株没有溶血尿毒症综合征（16例死亡），908株有溶血尿毒综合征（34例死亡）。这表明该菌株的毒力明显高于大多数产生志贺毒素的菌株大肠杆菌菌株。暴发毒株的初步遗传特征表明，与大多数这些毒株不同，它应该被归类为以下肠聚集性疾病类型：大肠杆菌。

方法

我们使用第三代单分子实时DNA测序来确定德国暴发菌株的完整基因组序列，以及七种腹泻相关肠聚集性菌株的基因组序列大肠杆菌O104血清型：来自非洲的H4菌株和四株肠聚集性菌株大肠杆菌属于其他血清型的参考菌株。使用这些肠聚集物进行全基因组比较大肠杆菌基因组，以及之前测序的40个基因组大肠杆菌分离物。

结果

企业聚集大肠杆菌O104:H4菌株密切相关，在大肠杆菌和肠聚集性大肠杆菌菌株。然而，德国暴发菌株的基因组可以与其他O104:H4菌株的基因组区分开来，因为它包含编码志贺毒素2的前噬菌体，以及一组独特的附加毒力和抗生素抗性因子。

结论

我们的研究结果表明，水平遗传交换允许产生高毒性志贺毒素的肠聚集性菌株的出现大肠杆菌O104:H4毒株，导致德国疫情爆发。更广泛地说，这些发现突显了细菌基因组的可塑性促进新病原体出现的方式。

2011年5月初，德国北部爆发腹泻并伴有溶血尿毒症综合征；随后在其他15个国家报告了病例。截至7月22日，共有3167例非溶血性尿毒症综合征患者产生志贺毒素大肠杆菌据《德国感染防护法案》（German Protection against Infection Act）报道，已有16例死亡，908例溶血尿毒症综合征病例（34例死亡）。一些团体报告说，疫情是由一种产生志贺毒素的病毒引起的大肠杆菌属于O104:H4血清型的菌株，具有肠聚集性常见的毒力特征大肠杆菌病理类型。1——三这个不寻常的大肠杆菌血清型以前与人类疾病的散发病例有关4,5但大规模疫情却没有。

大肠杆菌通常是共生生物，但有六种腹泻病类型大肠杆菌每一种都具有不同的表型和遗传特征。6与溶血尿毒症综合征和神经系统并发症相关的腹泻通常由以下原因引起大肠杆菌产生志贺毒素。6大多数这类菌株，通常被称为肠出血性菌株大肠杆菌含有肠细胞清除致病岛，有利于大肠定植。意外的是，聚合酶链反应分析1——三揭示了德国暴发菌株缺乏这种致病岛，以及基因组测序的快速发布结果7和细胞粘附测定1证实了最初的观察结果，即德国O104:H4爆发毒株是一种肠聚集性大肠杆菌菌株而不是典型的肠出血性菌株大肠杆菌应变。暴发菌株类似于肠聚集性大肠杆菌O104:H4菌株55989，从中非共和国一名患有人类免疫缺陷病毒感染（HIV）并持续腹泻的患者中分离，8不产生志贺毒素。

企业聚集大肠杆菌病理类型被认为是旅行者腹泻的病因，9儿童，10,11和HIV感染患者，12以及几起可能是食源性疫情。13——16企业聚集大肠杆菌尽管肠聚集性毒力变异的基础大肠杆菌人们对其了解甚少。17企业聚集大肠杆菌致病性已被证实，通常包含由AggR转录因子调节的大量毒力相关基因。这些包括编码聚集粘附菌毛（AAF）的质粒基因，8,18——20将细菌固定在肠粘膜上并引起炎症，21以及蛋白质外壳分泌系统（Aat）、其分泌的分散蛋白，22和一种假定的VI型分泌系统，称为Aai。23企业聚集大肠杆菌菌株通常精心制造肠杆菌科（SPATEs）的毒素和可变数量的丝氨酸蛋白酶自动转运体，与粘膜损伤和定植有关。24

在当前肠聚集性疾病爆发之前大肠杆菌O104:H4，只有三个肠聚集性大肠杆菌基因组已经测序25——27; 因此，肠聚集性系统发育的基因组尺度知识大肠杆菌是有限的。我们使用第三代DNA测序技术快速确定大肠杆菌O104:H4爆发株，其他7株肠聚集性大肠杆菌O104:H4菌株和四个参考菌株(表1)。28——32

表1

肠聚集性菌株大肠杆菌在本研究中进行排序或分析。*

隔离†血清型隔离装置的位置隔离源参考
O42号机组O44:H18型秘鲁腹泻儿童粪便样本Nataro等人。28
17至2臭氧：氢气智利腹泻儿童粪便样本西林瓶等。29
JM221型O92:H33型墨西哥成人腹泻大便样本Mathewson等人。30
C1010-00元奥罗：H-丹麦腹泻儿童粪便样本Olesen等人。31
55989O104:H4型中非共和国成人腹泻大便样本Bernier等人。8和Touchon等人。26
C35-10‡O104:H4型非洲腹泻儿童粪便样本SSI集合
C682-09号‡O104:H4型非洲腹泻儿童粪便样本SSI集合
C734-09号‡O104:H4型非洲无腹泻儿童粪便样本SSI集合
C754-09号‡O104:H4型非洲无腹泻儿童粪便样本SSI集合
C760-09号‡O104:H4型非洲无腹泻儿童粪便样本SSI集合
C777-09‡O104:H4型非洲腹泻儿童粪便样本SSI集合
TY2482型O104:H4型德国成人腹泻大便样本Rohde等人。32
LB226692型O104:H4型德国成人腹泻GenBank登录号，AFOB00000000美元
H112180280型O104:H4型德国成人腹泻www.hpa-bioinformatics.org.uk/lgp/genomes网站
C227-11号O104:H4型丹麦成人腹泻本研究
†粗体显示的分离物来自当前疫情（2011年5月）。
‡这些分离物并非来自单个克隆暴发，因此代表了O104:H4组中基于人群的多样性。

方法

隔离

我们分离出一种肠聚集性大肠杆菌菌株C227-11，来自德国汉堡一名64岁女性，她在哥本哈根的Hvidovre大学医院住院。她出现血性腹泻；没有出现溶血尿毒症综合征。我们选择了五个参考菌株（JM221、17-2、042、55989和C1010-00）来代表研究得最好的肠聚集性大肠杆菌菌株并捕获肠聚集性毒株的地理、血清型和毒力因子多样性大肠杆菌病理类型。我们培养了6株O104:H4临床分离物，这些临床分离物是我们从哥本哈根史坦登斯血清研究所获得的（C35-10、C682-09、C734-09、C754-09、C6760-09和C777-09），5株肠聚集性大肠杆菌参考分离物和C227-11分离物。（有关培养条件的详细信息，请参阅补充附录，可在NEJM.org上查看本文全文。）

DNA制备、序列测定和比较分析

我们纯化并测序了来自6个非洲肠聚集性大肠杆菌C227-11的基因组DNA大肠杆菌临床分离物和五种典型肠聚集性大肠杆菌使用PacBio RS DNA测序仪进行分离（序列读取档案登录号，SRA038239；GenBank登录号，AFST00000000美元). 我们还与另一个暴发菌株TY2482的序列进行了比较分析。（参见Rohde等人在本期其他地方发表的文章日记账用于分析从TY2482获得的序列数据。32)补充附录提供了有关DNA测序的其他详细信息，33,34DNA结构变异的组装、重测序分析和检测，以及系统发育树的构建和兰巴达克噬菌体元素、毒力因子、质粒和暴发菌株特有区域的特征描述。

结果

13的基因组测序和组装大肠杆菌基因组

使用三个平行测序仪器，我们在每个分离物约5小时内，对测序的每个分离物（平均读取长度，2067个碱基）获得了约75倍的覆盖率(补充附录中的表1)。

我们使用了一个综合过程(补充附录中的图1)组装C227-11基因组，获得33个连续序列（N50为402 kb，最大连续大小为622 kb），覆盖99.7%的细菌染色体，准确率为99.97%(补充附录中的表3). （连接体是一个没有间隙的连续DNA序列；N50是连接体长度，因此该长度或更长的所有连接体覆盖基因组中50%的碱基。）另外四个连接体涵盖了两个大质粒（约88 kb和75 kb）和第三个1.5 kb质粒。1.5-kb质粒可通过两次读取完全解析(补充附录中的图1和表2). 其中一个质粒与典型肠聚集性大肠杆菌中发现的pAA质粒相似大肠杆菌分离物。25C277-11的pAA质粒（此处称为pAA C277-11）编码聚集粘附菌毛（AAF/I变异体）、Aat复合物、分散蛋白、AggR和其他具有肠聚集性毒力因子特征的毒力因子大肠杆菌(图1)。

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八种肠聚集性的基因组比较大肠杆菌O104:H4隔离

在面板A中，八个圆形带代表不同企业聚集的轨迹大肠杆菌（EAEC）O104:H4分离物在我们的研究中测序（从内部到外部的轨道：55989、C227-11、C734-09、C35-10、C682-09、C760-09、C754-09和C777-09）。这些不同的带代表参照基因组TY2482绘制的覆盖图，蓝色或绿色表示高度覆盖，黄色表示中度覆盖，橙色或红色表示很少或没有覆盖。C227-11覆盖图表明与TY2482基因组的近完全序列一致。染色体图外部的注释突出了已知毒力因子基因的位置以及先前在AA质粒上表征的基因在大肠杆菌O42菌株。质粒的带序和颜色编码与染色体图中描述的相同。pAA图中的细红线显示55989和C227-11之间的内部重复，突出了这些元素在质粒序列周围的洗牌。在图B中，参考基因组为55989。图C显示了爆发菌株C227-11的基因组（左半圆）和55989基因组（右半圆）之间的比较，分别与爆发菌株TY2482的55989基因组和基因组进行了映射。最内层轨道（蓝色、粉红色和紫色）内的彩带表示两个基因组C227-11和55989之间的同源映射，表明这些基因组之间存在高度相似性。红线显示重复元件的染色体定位，如插入序列和其他移动元件，这表明基因组之间的异质性比同源性绘图区域明显。

我们将C227-11的序列与来自非洲的6株O104:H4菌株、之前公布的爆发相关菌株的序列数据、暴发菌株TY2482的可用参考基因组序列以及非洲肠聚集性菌株的序列进行了比较大肠杆菌55989株，8,26为了确定所有分离物之间的拷贝数变异和微小核苷酸变异(图1、补充附录中的表3和图3). （参见NEJM.org上的动画）当前疫情分离株的基因组（C227-11，TY2482，LB226692型和H112180280）非常相似，在TY2482和C227-11之间仅检测到236个单核苷酸变异差异(补充附录中的表3和图3)表明疫情是克隆性的。我们观察到C227-11基因组和TY2482的完整基因组序列之间的结构变异，部分基于最近描述的组装草图，32这似乎不太可能是C227-11基因组中错误组装的结果，因为这些区域在C227-11和H112180280基因组中是相同的(补充附录中的图4和图5). 然而，我们观察到O104:H4暴发菌株和其他七个肠聚集性菌株之间存在大规模缺失、插入、反转和其他结构变异大肠杆菌O104:H4分离株测序(图1)。

几个结构不同的区域含有编码毒力因子的基因。例如，C227-11包含两个lambdalike原噬菌体元素，其中一个包含志贺毒素基因。毒物编码噬菌体仅在暴发分离物中观察到(图1，橙色突出显示），而另一个原噬菌体元素(图1，蓝色突出显示）存在于其他几个O104:H4分离物中。图1还揭示了突发性染色体特有的区域，包括包括毒力因子基因区域的结构变异，如照片以及美国航空工业协会致病岛(图1，绿色突出显示）。这一特定地区包括疫情分离株和55989株之间的差异(补充附录中的图6)。

全基因组系统学

我们使用了大约2.56 Mb的DNA，代表在53个样本中发现的保守核心基因组大肠杆菌以及志贺氏菌基因组，包括C277-11、其他德国暴发菌株和非洲O104:H4菌株，以生成描述大肠杆菌(补充附录中的图2、图4和表4). 我们观察到肠聚集大肠杆菌分离株在整个系统发育树（蓝色方框）中传播，表明就基因组组成而言，它们是最多样化的病理类型。然而，肠聚集性大肠杆菌O104:H4血清型（橙色）菌株形成了一个独特的分支，具有高度保守的核心基因组（其中一个O104:H4分离物C35-10为异常值）。德国疫情中分离的志贺毒素编码菌株与众多肠聚集性菌株之间的遗传相似性大肠杆菌O104:H4菌株缺乏志贺毒素编码噬菌体，这表明噬菌体的获得是一个相对较新的事件(补充附录中的图4). 肠聚集性疾病中O104:H4暴发菌株的存在大肠杆菌O104:H4分支证实暴发菌株不是典型的肠出血性菌株大肠杆菌获得肠聚集性毒力特征的菌株大肠杆菌。

我们只分析了肠聚集菌的系统发育大肠杆菌基于3.48 Mb共享基因组序列的分离物(补充附录中的图7). O104:H4菌株，包括暴发菌株，聚集成一个单一的、密切相关的分支，C35-10菌株除外。德国疫情的四个分离物（TY2482、C227-11、，LB226692型和H112180280），其中三个由其他组测序，特别密切相关。

含有STX2基因的类羔羊噬菌体

聚合酶链反应分析显示，暴发菌株含有编码志贺毒素2、，三一种抑制蛋白质合成并导致溶血尿毒症综合征的毒素。6暴发株中编码λDalike原噬菌体的志贺毒素插入位点与大肠杆菌应变EDL933。此外，933W（EDL933携带的产生志贺毒素的噬菌体）和爆发菌株的原噬菌体之间的相似性，特别是在志贺毒素基因侧翼的区域，志贺毒素基因控制志贺毒素的产生和毒素的释放(补充附录中的图8和图9)-表明某些抗生素可能会增加暴发菌株产生志贺毒素2。36与这种可能性相一致的是，我们发现在含有环丙沙星（每毫升25纳克）的培养基中，C227-11的生长增加了机顶盒AB2基因约为80倍(补充附录中的图10)类似于肠出血患者志贺毒素2表达水平的升高大肠杆菌暴露于环丙沙星后的菌株EDL933。36

爆发株基因组中的其他病毒因子

德国疫情感染者中溶血尿毒症综合征的高流行率表明肠聚集性大肠杆菌导致疫情爆发的O104:H4菌株具有额外的毒力因子或毒力因子的特定组合，使其具有极高的致病性(补充附录中的表5). 暴发菌株的基因组中有许多毒性因子基因，常见于肠聚集性大肠杆菌包括一些由AggR转录激活剂协调调节的产物(补充附录中的图11); 这些包括编码AAF/I的基因(aggA-D型)，分散剂(aap公司)，和分散体转运蛋白(aatPABCD公司). 除了stxAB2型肠出血的基因特征大肠杆菌C227-11基因组中不存在。总之，这些观察结果为将暴发菌株归类为肠聚集性菌株提供了支持大肠杆菌应变。

在肠聚集性疾病中常见的德国暴发毒株的毒力因子中大肠杆菌和其他腹泻大肠杆菌菌株（和志贺氏菌属）是SPATE。37然而，C227-11基因组编码的SPATE组合（SepA、SigA和Pic）在肠聚集性疾病中很少有报道大肠杆菌菌株。37我们研究的三个非洲菌株以及55989株中也存在这种组合。肠聚集性疾病也不常见大肠杆菌对两个以上SPATE进行编码。37因此，暴发毒株中SPATE的数量和组合可能有助于提高其毒力。在德国暴发毒株中发现的其他潜在毒力因子包括长极性菌毛(液化石油气)和IrgA同源粘附(国际卫生协会),1先前已在肠出血中发现大肠杆菌和其他大肠杆菌病理类型。38,39

C227-11基因组中的独特区域

C227-11基因组包含58个长度超过100 bp的区域，这些区域在其他11个原型肠聚集蛋白中至少1个缺失大肠杆菌基因组(补充附录中的表6). 这58个区域包含180088 bp（约占基因组的3.4%），但超过120000 bp的这种独特DNA包含上述两个λ噬菌体（分别为61022和59914 bp）。剩下的大部分序列（约60000 bp）由功能未知的基因组成，这些基因也存在于家畜中大肠杆菌因此可能不会增加毒力。这种新DNA的缺乏进一步支持了O104:H4血统最近的出现。如所示图1与参考菌株44898相比，C227-11中缺失的序列在其他O104:H4菌株中也缺失。因此，我们的序列分析表明stx2型可能是由一种不寻常的SPATE补体增强的，可以解释C227-11毒力升高的原因。

血浆序列和其他临床意义标记

我们将12个菌株的原始序列映射到作为TY2482暴发基因组一部分组装的三个质粒序列(图1)（GenBank登录号，AFOG01000000公司). 最大和最小的质粒不包含编码任何已知毒力因子的基因。然而，最大的质粒pESBL C227-11编码超广谱β-内酰胺酶CTX-M-15，与在几种临床中发现的pEC_Bactec质粒非常相似大肠杆菌分离物。40pESBL C227-11质粒在大多数O104:H4基因组测序中未被鉴定，这表明该质粒可能是某些菌株最近获得的，或者可能相对不稳定，因此被许多菌株丢失。

中间大小质粒pAA C227-11(图1)约为75000 bp，类似于肠聚集性中鉴定的pAA质粒大肠杆菌隔离，25,26尽管在这个质粒家族中也有明显的多样性。pAA C227-11质粒与肠聚集性pAA原形质粒的比较大肠杆菌042仅鉴定出约34000 bp的共享序列，pAA C227-11仅与55989毒力质粒共享28000 bp的序列。肠聚集性pAA质粒的序列异质性大肠杆菌O104:H4远远大于染色体序列之间的值，在核心毒力特征中发现了保守性。pAA C227-11质粒编码大量肠聚集性蛋白大肠杆菌–特定毒力因子(图1以及补充附录中的表8和表9)，例如aggR公司以及它调节的基因，包括AggR、AatPA–D、Aap、AggA–D和SepA，因此可能对C227-11致病性至关重要。

讨论

暴发克隆是通过横向转移获得基因的一个引人注目的例子，这种转移导致协同毒性因子的增加。根据所有分子定义，它是一种肠聚集性大肠杆菌菌株，但其中一种获得了志贺毒素——编码噬菌体——志贺毒素的标志——产生大肠杆菌我们的研究结果表明，德国企业集群进化中的关键事件大肠杆菌暴发菌株包括通过该菌株的祖先前体获得一个编码Stx的前噬菌体和一个携带扩展谱β-内酰胺酶基因的质粒(补充附录中的图11). 然而，对当代分离物基因组的分析并不能揭示产生日惹毒素的进化途径的真正复杂性，日惹毒素是产生肠聚集性的大肠杆菌O104:H4爆发株。此次疫情并不是第一例与临床相关的肠聚集性疾病大肠杆菌获取志贺毒素编码噬菌体，41,42但很明显，这种菌株导致了疾病的大规模爆发。当前疫情是否是由一种毒性特别强的志贺毒素阳性肠聚集物引起的大肠杆菌这是一个罕见的流行病学机会，或者两者都不清楚。

暴发分离物中编码志贺毒素的前噬菌体与肠出血患者中此类前噬菌物的相似性大肠杆菌特别是在毒素启动子区域，这表明这些病原体的毒物诱导条件可能类似。我们观察到，O104:H4暴发菌株的毒素产生是由喹诺酮类抗生素诱导的，正如之前在肠出血患者中所见大肠杆菌菌株，36提示在使用某些种类的抗生素对抗这种新出现的病原体时应谨慎。

目前的分离物与常见的肠聚集性菌株不同大肠杆菌分离出SPATE蛋白酶的数量和性质。最容易腹泻大肠杆菌菌株编码单个SPATE，并具有肠聚集性大肠杆菌菌株通常编码两个SPATE37; 在爆发菌株中存在三个SPATE编码基因是不寻常的。其中一种SPATE，Pic，在肠聚集性疾病中很常见大肠杆菌菌株和裂解物宿主肠道上皮细胞粘蛋白，从而促进肠道定植，43以及与白细胞免疫功能相关的粘蛋白相关糖蛋白。44暴发菌株还编码SigA，这是一种SPATE，可裂解细胞骨架蛋白谱蛋白，诱导肠细胞成圆和脱落。45第三种SPATE，即SepA，与肠聚集性增加有关大肠杆菌毒力，但其功能未知（未发表的观察结果）。我们推测这些SPATE与其他肠聚集因子的联合活性大肠杆菌毒力因子导致循环中对志贺毒素的吸收增加，导致溶血性尿毒症综合征的发病率较高。

最后，全世界对德国聚集性肠杆菌基因组进行测序和分析的努力大肠杆菌暴发菌株说明了新兴的高通量DNA测序技术的威力。以前所未有的读取长度在数小时内（而不是数天到数周）对基因组进行测序的能力是第三代DNA测序的新兴标志；如此长的阅读有助于新的基因组组装工作和对结构变异的深入了解。对此次疫情（以及相关菌株）的分离株进行快速测序，对其致病因素有了重要的了解。此外，北京基因组研究所快速发布的DNA序列数据（Rohde及其同事对其进行了分析32)让研究人员群体对细菌爆发的分析以惊人的速度进行，让我们可以一瞥一个新时代，在这个时代，研究人员群体迅速共享对公共卫生至关重要的大规模数据集和分析。

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53个物种的系统发育比较大肠杆菌和志贺氏菌分离物

如Sahl等人所述，使用100个自举计算对基因组序列进行了比较。35利用保守核心基因组的2.56 Mbp推断出基于物种的系统发育。O104:H4分离物显示为橙色，即参考肠聚集性大肠杆菌（EAEC）蓝色分离物和肠出血性大肠杆菌绿色隔离物。（其他菌株的分类如补充附录中的图4和表4O104:H4将集群隔离为单个分支（深灰色）；相比之下，参考EAEC分离株差异很大，在整个系统发育过程中都有代表性。

补充材料

补充1

单击此处查看。（150万，pdf）

致谢

由马里兰大学内部基金以及美国国立卫生研究院（NIH）（AI090873，给马里兰大学医学院）、霍华德·休斯医学院和NIH（R37-AI-42347，给Waldor博士）、NIH（AI-033096，给Nataro博士和Boisen博士）的拨款支持，和丹麦战略研究理事会（09-063070，致Krogfelt博士）。

我们感谢在此次疫情期间继续提供出色病人护理的组织和个人；史蒂夫·特纳（Steve Turner）、休·马丁（Hugh Martin）和迈克尔·菲利普斯（Michael Phillips）（太平洋生物科学），感谢他们深思熟虑的讨论、建议和支持；Brigid Davis（哈佛医学院）对手稿的有用评论；苏珊娜·杰斯佩森和皮亚·默勒·汉森在世界卫生组织斯塔滕斯血清研究所参考实验室寻求技术援助；和Edwin Hauw协助将测序数据上传至国家生物技术信息中心数据库。

脚注

NEJM.org上提供了一个将爆发菌株基因组与其他菌株基因组进行比较的动画

作者提供的披露表格可在NEJM.org上获得本文全文。

参考文献

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