如何培养、记录和刺激微电极阵列(MEA)上的神经网络
摘要
协议
A.简介
B.脑解剖
全脑提取自胚胎第18天(E18)大鼠。 定时怀孕的雌性大鼠被吸入异氟醚麻醉并斩首。 根据国家研究委员会的《实验动物护理和使用指南》,按照埃默里大学IACUC批准的方案,对胚胎进行切除和解剖。 在使用无菌技术的同时,将胚胎大脑取出并放置在100 mm无菌培养皿中的冷Hank’s Balanced Salts溶液(HBSS)中。 解剖方案的其余部分在层流罩中的解剖显微镜下进行,以将污染风险降至最低。 每次将一只大鼠的大脑转移到第二个装有HBSS的无菌培养皿中进行解剖。 当淹没在HBSS中时,脑干、丘脑和小脑被切除,大脑半球被一分为二。 嗅结节被用作固定半球的手柄,同时轻轻切除脑膜。 然后将皮层从下面的海马体和纹状体上剥离,并将其储存在无菌的15毫升锥形管中,置于冰上的冬眠溶液中。 12 由于通常有多个胚胎,因此根据所需的MEA数量和所需的细胞密度重复此过程。 下面讨论了细胞分离过程中皮层的结合。 在分离之前,皮层可在4°C的冬眠溶液中保存24小时,细胞活力损失最小。 作为使用内部解剖组织的替代方法,解剖的脑组织可以从brain Bits购买( 网址:www.brainbitsllc.com ).
C.MEA制备和皮层分离
MEA来自ALA Scientific( 网址:www.alascience.com ),制造商Multi-Channel Systems的供应商。 MEA有几种不同的配置,电极方向和间距、是否有内部接地电极、是否有玻璃环以及玻璃环的大小都不同。 在我们的基础实验中,我们使用了标准的微电极阵列,该阵列包含60个电极,以8×8的网格排列,带有一个小玻璃环。氮化钛电极直径为30μm,电极中心之间的距离为200μm。 其中一个电极较大,用作接地或内部参考电极。 处理MEA时,绝对不要让固体物体(例如吸液管尖、纸巾或橡皮警察)接触盘子内部,因为这可能会损坏电极。 有关MEA和处理的更多详细信息,请参阅MEA用户手册( www.multichannelsystems.com/products-mea/microelectrode-arrays.html网站 ). 在细胞制备前的晚上,用去离子水冲洗MEA,然后在70%乙醇中浸泡15分钟。 然后将盘子放在层流罩中,打开紫外线灯过夜。 为了便于搬运,每个MEA都放在一个标准的100 mm无菌聚苯乙烯培养皿中,培养皿上有日期和标签。 值得注意的是,MEA用户手册中提到了其他灭菌技术,包括高压灭菌和在90°C下用水。 然而,我们根据经验发现,高压灭菌似乎可以减少MEA的使用次数。 如果您正在重复使用当前具有培养基的MEA,则必须去除有机物。 将PBS中300-400μl 0.25%胰蛋白酶在35-37°C的MEA上培养20分钟。 用去离子水冲洗MEA,然后用光学显微镜检查。 如果细胞物质仍然存在,则重复胰蛋白酶步骤直至清洁。 如果盘子是干净的,则按照上述步骤进行灭菌。 一般来说,MEA可以在适当的注意下多次重复使用。 同样在电镀前一天晚上,准备MEA盖子并进行高压灭菌。 盖子是定制的,但也可以从ALA-Scientific购买。 它们由聚四氟乙烯特氟龙制成,顶部有一层透明膜(氟化乙烯-丙二醇特氟龙)。 该膜允许气体扩散,但限制了水的扩散,从而实际上消除了对增湿大气的需要,并防止了蒸发和高渗的有害影响。 1 一旦完成上述解剖,将100μl聚乙烯亚胺(PEI)溶液置于每个MEA的中心,继续MEA制备。 13 在我们手中,与使用多聚赖氨酸相比,PEI解决方案在MEA中提供的细胞聚集更少。 将培养皿置于层流罩中的室温下30分钟,盖子轻轻放在MEA上,以防止蒸发。 提醒一下,任何开放式MEA或脑组织的工作都应在标准细胞培养层流罩中进行,以将污染风险降至最低。 然后用1-2 ml无菌去离子水冲洗MEA 3次。 理想的层流罩设置包括一个吸液器装置,用于从盘子中取出液体。 可将200μl无菌吸液管尖端连接到吸液管上。吸液时不要接触MEA表面,因为这可能会损坏电极。 最终冲洗后,允许MEA在层流罩中干燥至少30分钟。 在干燥期间,将皮层放入一个15毫升无菌锥形塑料瓶中的2毫升木瓜蛋白酶溶液中,开始神经元分离过程。 1 向混合物中添加50μl DNAse。 将小瓶置于35-37°C的水浴中,并培养约20分钟。 每5分钟轻轻敲打溶液以进行混合,小心避免产生气泡。 随着消化的进行,皮层应该开始呈现出模糊的外观。 然后用移液管小心地移走木瓜蛋白酶溶液,将皮层留在15毫升的锥形瓶中。 将2ml细胞培养基添加到皮层中,孵育2-3分钟,然后轻轻取出。 这是为了洗掉任何残留的木瓜蛋白酶,它也会被培养基中的血清所抑制。 将另一2ml细胞培养液加入皮层,然后高速旋转样品5-10秒。 15毫升锥形小瓶的底部应该有一个混浊的溶液,没有残留的脑片。 或者,可以使用P-1000手持移液管将1ml培养基研磨3次,以分离组织。 1 为了进行适当的研磨,每次吸管冲程都需要一秒钟。 然后通过重力使溶液轻轻通过无菌40μm细胞过滤器。 用P-1000缓慢地将细胞溶液一滴一滴地添加到过滤器中。 使用35mm无菌培养皿来收集应变的细胞溶液。 然后将细胞悬液转移回15 ml锥形小瓶,并将细胞培养基添加至最终体积4.0 ml。 14 然后用P-1000将500μl 5%w/v BSA溶液小心分层放入15ml锥形小瓶的底部。 14 这将使小瓶中含有细胞的溶液向上移动。 然后将底部分层有BSA的细胞溶液以200 x g的速度离心6分钟,以去除小碎片和可能有毒的细胞内物质。 14 在细胞离心步骤期间,目视评估MEA以确保它们完全干燥。 然后小心地将20μl层粘连蛋白溶液置于MEA的中心,确保所有电极都被覆盖。 1 避免将气泡引入该溶液中,因为这可能导致电极表面准备不足。 如果MEA不是完全干燥的,那么层粘连蛋白的滴将在培养皿上扩散,这可能会使电镀时更难在电极上充分定位细胞。 这一步非常精细,有可能导致MEA表面损伤,导致手不稳或注意力不集中。 此时将聚四氟乙烯盖置于MEA上,以防止层粘连蛋白蒸发。 盖子的放置也很精细。 只有当MEA位于完全平坦的表面上时,才应放置或移除盖子。 否则,不均匀表面施加的额外力可能会使阵列的玻璃底部破裂,从而导致阵列无法使用。 然后将盘子放入培养箱中20分钟。 当层粘连蛋白与培养皿结合时,将含有细胞的15 ml锥形小瓶从离心机中取出,并转移回层流罩。 小瓶底部应能看到颗粒。 用无菌5ml塑料血清移液管小心地移走上清液。 保存上清液,以防离心过程不完整。 然后,根据预期产量,在300-500μl细胞培养基中使用P-1000研磨或快速旋涡轻轻地将颗粒重新悬浮。 取10μl细胞悬液,置于血细胞仪上测定细胞浓度。 如果产率低,在显微镜下分析上清液,以确定离心步骤是否不完整。 可能需要重复离心。 如果产量高,则可能需要稀释以实现更准确的计数。 每个MEA的细胞板密度范围为5000到300000个细胞。 计算稀释度,使电镀所需的电池数量最终达到15-20μl。 我们通常使用每微升1000到3000个细胞的最终浓度。 一对皮质通常会产生1000万到1500万个细胞。 如果使用研磨,这个数字可能会稍低。 此时,MEA上的层粘连蛋白培养应完成。 将聚四氟乙烯盖从MEA中取出,并将大部分层粘连蛋白滴吸出或吸出。 然后立即用移液管将15-20μl所需细胞悬浮液移到层粘连蛋白的剩余湿区。 小心避免将气泡引入这个小体积的电池悬浮液中,因为气泡会阻止电池均匀覆盖所有电极。 轻轻地盖上盖子,小心地将MEA放回培养箱中30分钟。 然后在光学显微镜下检查培养皿,以确保细胞粘附并覆盖所有电极。 如果所有的电极都没有覆盖,那么可以添加更多的细胞,并将MEA放回培养箱中,盖上盖子,让这些新细胞粘附。 如果在静置几分钟后使用一管细胞悬浮液,一定要轻轻旋转,使沉淀的细胞重新悬浮。 一旦达到足够的电极覆盖率,然后用1ml温热(35-37°C)细胞培养基缓慢地浸没培养皿。 更换聚四氟乙烯盖子,将培养皿放回培养箱。 层流罩可以在MEA上快速干燥小层粘连蛋白体积和细胞悬浮液体积一次,因此请注意用聚四氟乙烯盖将其密封。 密封MEA的理想培养箱环境是5%CO 2 ,9%O 2 35-37°C时湿度为65%。 低氧对长期培养很重要,可以减少氧化损伤。 12 保持65%的湿度可以减少通过聚四氟乙烯膜的蒸发(与没有湿度控制相比),并允许MEA电子设备在培养箱中使用,而不会因水凝结而损坏(与正常培养箱加湿至饱和一样)。
D.改变细胞培养基并关注MEA上的游离培养物
细胞电镀后第二天,在光学显微镜下检查MEA。 如果培养基的颜色仍然是桃色到红色,并且细胞碎片和细胞死亡的数量有限,那么第一次培养基更换可以推迟一天。 然而,如果培养基开始呈现更多橙色或黄色和/或有大量细胞碎片和细胞死亡,则更换培养基。 所有培养基更换都应在标准细胞培养层流罩中进行。 第一次更换培养基包括取下MEA盖,吸走培养皿中的所有培养基,用新鲜的细胞培养基替换掉取出的培养基,然后更换盖子。 在第一次更换培养基时,更换全部培养基,以清除电镀过程中残留的细胞碎片。 随后更换介质时,只应吸走大约一半的介质,然后用新鲜介质替换掉所吸走的介质。 这使得分泌到细胞培养基中的一些生长因子能够与细胞一起保持更理想的生长环境。 如果在介质更换过程中盖子的底部被污染,或者如果盖子有损坏或安装松动的迹象,则使用新的高压灭菌盖子。 细胞培养基可以储存在培养箱中的无菌容器中,该容器带有定制的改良盖(带有特氟隆(氟化乙烯-丙二醇)膜,以便进行气体交换)。 细胞培养基也可以在4°C下储存,但在更换培养基之前,应在培养箱中加热并使其平衡。 大约每周两次,取出并更换盘子中大约一半的培养基。 一些细胞制剂可能会导致介质中颜色变化更快,从而需要更频繁的变化。 如果介质显示为黄色,则更换整个介质。 快速变黄也可能是污染的迹象,因此在光学显微镜下检查培养皿是否有感染的视觉迹象。 根据实验条件和无菌技术,经过精心护理的培养物可以存活一年以上。 1
E.MEA记录
每个MEA有59个记录电极和一个内部接地电极。 有几种商用录音系统以及定制版本。 供应商包括Multi-Channel Systems、Tucker Davis Technologies、Axion Biosystems、Alpha Med Scientific MED64、Plexon、Ayanda Biosystes和BioLogic。 我们的实验室目前使用多通道系统的商业设置,这是一个定制设计的基于Windows的系统,名为NeuroRighter 15 以及一个定制设计的基于Linux的系统MeaBench 16 每个系统都可以使用多通道系统前置放大器从MEA(多通道系统)进行记录。 塔克·戴维斯技术公司的商业设置也在使用中。 本协议将演示使用NeuroRighter从MEA进行的记录。 NeuroRighter软件是开源的,可以免费下载,同时还可以在NeuroRighter谷歌群组上下载硬件设计。 ( http://sites.google.com/site/neurorighter/ ) MEA培养需要2-3周才能达到稳定的活动状态。 17,18 这种活动包括自发动作电位和全文化爆发(一系列动作电位在文化中突触传播)。 然而,实验的性质将决定理想的天数 在体外 录制之前。 神经元的活动取决于理想的环境条件,包括温度和pH。 1 因此,我们的记录是在上述培养箱中进行的。 如果设计了短实验(<30分钟),还可以将商用加热模块连接到MCS前置放大器,以保持理想的MEA温度。 为了开始记录,将MEA(仍在培养皿中)从培养箱轻轻转移到记录培养箱。 保持盘子底部与地面平行。 避免快速移动MEA或震动MEA,因为这可能会使培养物与基质分离。 然后将MEA从皮氏培养皿中取出并放置在记录前置放大器中。 将我们当前演示的盘子中的内部接地电极与前置放大器上的接地电极(MCS前置放大器的通道CR15)相匹配。 使用蘸有70%乙醇的纸巾或棉签擦拭MEA周围的触点,以去除可能妨碍良好连接的指纹或其他碎片。 确保MEA正确就位后,将前置放大器盖降下并锁定到位。 前置放大器盖上的触点应牢固地固定在MEA上的电极接触垫上。 目视检查触点对齐情况,必要时用棉签进行调整。 将前置放大器放在培养箱中的珀尔贴设备上。 它由两块铜板组成,中间夹着一个珀尔贴热电热泵。 我们在大约5V的电压下运行此功能,以消除前置放大器电路产生的一些热量。 这样可以防止聚四氟乙烯膜盖内部形成冷凝。 任何冷凝都表明,由于蒸发,与细胞接触的培养基渗透压增加,会对培养物造成损害。 通过确保前置放大器和培养基比培养箱空气温度低一两度,渗透压的变化最小。 打开NeuroRighter的电源并打开工作站上的软件。 将NeuroRighter设置调整为 在体外 适当的软件/硬件配置也到位。 在软件中选择电极数。 为了减少背景噪声,可以启用数字带通滤波器。 如果要保存数据以供以后分析,请在打开记录的情况下选择数据文件。 选择所有适当的设置后,激活启动按钮。 屏幕应显示活动和背景噪音的运行轨迹。 偶尔可以看到动作电位和全盘活动爆发。 如果预期活动无法可视化,则以下关于MEA故障排除记录的部分将讨论几个常见问题。 屏幕视图可以更改为尖峰检测模式(“Spk Wfms”选项卡),动作电位在3ms时间窗口内静态显示。 对于给定的通道,真实的细胞外动作电位应持续约1ms,并应以相同的方向(正或负)重复激发。 有时,在同一电极上可以看到两个或多个具有不同极性的神经元。 短时间过程和可变极性的峰值可能是人为的。 图1显示了峰值数据的栅格图。 屏幕视图可以更改为局部场电位(LFP),以定位爆发活动的起源。 这种设置在录制时更有用 体内 因为单层培养物的LFP较弱。 值得注意的是,一些前置放大器(包括我们从多通道系统中使用的前置放大器)具有10 Hz的高通滤波器,这将衰减低频LFP节律。
F.在MEA上刺激神经元网络
MEA上相同的59个记录电极也可以用于刺激培养物。 实验的性质将决定刺激的程度。 NeuroRighter是开放源代码,为刺激实验设计提供了灵活性。 15 刺激文化的挑战在于,刺激会产生一个可以持续几毫秒的人工制品。 这种伪影可能大到足以触发尖峰检测和模糊刺激反应。 NeuroRighter利用SALPA算法最小化并在某些情况下基本上消除刺激伪影。 19 为了在MEA上刺激神经元网络,在“记录设置”选项卡下训练SALPA算法以限制刺激伪影。 在“联机设置”选项卡中激活SALPA。选择一个文件名,然后像前面一样单击开始按钮开始录制。 然后点击“Stim”标签。在这个页面上有很多设置刺激的选项。 一个简单的实验是刺激一个电极,用“开环”部分观察盘子的反应。 选择速率、电压、相位宽度和通道编号。 按下开环部分的启动按钮。 可以在主“Spikes”选项卡和“Spk Wfms”选项卡上显示对该刺激的响应,并在数据文件中进行分析。 在实时情况下,可以通过多个电极以一赫兹0.5V的刺激时间锁定的方式显示脉冲。 图2显示了刺激后反应的光栅图。 先前的观察表明,有两种不同类型的刺激诱发活动:直接诱发动作电位(dAP)和突触诱发动作电位。 20 培养中的神经元有自发的活动爆发。 对于某些实验,这种突发可能会干扰控制网络动态的尝试。 有趣的是,每个电极1-2 Hz的分布式刺激可以开始抑制MEA上神经元网络的突发活动。 21
G.MEA故障排除记录
当软件打开时,MEA中不存在动作电位或爆炸: 这种文化够古老吗? 行动潜力应在第一周结束时可见 在体外 .破裂发生在两到三周左右 在体外 . 硬件是否通电? NeuroRighter系统使用两个6V铅酸电池为硬件供电。 电源开关需要处于打开位置,电池需要充电。 文化还活着吗? 有时,由于胶质细胞过度生长,这一点很难确定,尤其是在密集或较老的培养基中。 然而,人们可以寻找健康的神经元(相位对比显微镜下的闪亮椭圆形细胞体)和完整的(非碎片化)细胞过程。 如果有证据表明存在可见污染或快速降解的培养基(在培养基更换之间仅1至2天后变酸),则培养基也可能存在问题。 电极阻抗是多少? 在多次使用中,MEA的微电极或绝缘可能会退化。 NeuroRighter有能力评估电极阻抗。 15 1kHz左右的正常阻抗读数应在10000至100000欧姆之间。 较高的阻抗表明导线或电极断裂,小于10000欧姆的读数表明绝缘泄漏。 前置放大器是否连接到硬件板? 前置放大器应有一根连接到硬件板的输出电缆。 前置放大器还有4个小刺激器板,这些板也连接到主硬件板,仅对刺激很重要。 NeuroRighter软件设置是否已更改? 软件中的硬件配置设置必须正确才能录制。安装更新版本和多个用户更改设置可能会导致此问题。 MEA是否处于35-37°C? 较低的温度会导致皮层网络中自发活动的减少。 这通常不是问题,因为记录发生在气候控制培养箱中,但是如果MEA在培养箱外超过几秒钟,则必须考虑温度平衡。 在过去的几个小时里,媒体已经改变了吗? 我们观察到,培养物在喂食后通常会停止燃烧数小时。 因此,最好在喂食前进行实验。
背景噪音过大的电极使记录窗口饱和: 前置放大器引脚与MEA上的电极接触是否足够? 此问题可能是由前置放大器盖上的销错位、一小块垃圾、一滴介质、电极表面退化或盖上重叠的透明膜引起的。 第一步是检查联系人是否存在这些问题。 用浸有70%乙醇的棉签调整别针有时可以改善接触,尤其是当有一滴介质需要清洗时。 在乙醇蒸发之前,信号可能会变差。 电极是否损坏? 光学显微镜下的可视化有时会显示导致此类伪影的开裂或麻点电极绝缘层。 接触垫是否磨损或划伤? 有时,MEA上可能有几个电极触点难以优化。 在多次使用MEA和电镀后,这种情况更为常见。 浸有金丝的橡胶垫片仅在其0.5mm厚的方向上导电,可以改善前置放大器引脚与MEA的接触。 这款材料可从富士宝购买,非常适合MEA和盖子。
整个MEA显示背景噪音过大: MEA的方向是否正确,以便MEA上的接地电极能够接触到前置放大器上的接地线? 如果多边环境协定的方向正确,那么确保没有地面接触问题(上述2 a-c)也很重要。 通道CR15是否通过与前置放大器机箱的短线接地? 使用跨接导线通过内部30千欧电阻器将其接地,可能会导致噪音过大。 周围的灯光、电源或其他设备是否存在干扰? 最常见的干扰形式之一是来自灯光和设备的60 Hz。 记录系统必须正确接地。 屏蔽外露电缆也有助于减少背景干扰。
具有代表性的结果
披露
讨论
致谢
工具书类
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