肺癌结节体积组成的相关组织病理学和CT研究

摘要

介绍

肺癌的分子研究表明，肺癌遗传学具有很大的异质性，目前正在寻找一些潜在的治疗靶点。减少遗传结果影响的一个因素是，肺癌生物量的物理和结构构造尚未定量定义，对肺癌生物量成像或组织学复杂性，尤其是在三维方面，了解甚少或一无所知。这种信息的缺乏大大减少了新诊断测试的开发，也使得无法评估新疗法的细微变化分析。

我们以前开发了一个独特的过程模型系统，用于获取与切除的人类肺癌结节相关的多模式、体积、交叉注册数据[1]. 这些多模式数据集包括多行探测器计算机断层扫描（MDCT）、显微CT扫描和三维病理学，使用专用的精密组织切片机和数码相机（称为大型图像显微镜阵列（LIMA））[2]以及标准组织病理学检查。所有这些来自同一肺癌的样本都是逐像素交叉注册的，这为描述肺癌生物量的复杂性提供了机会。我们还从这些数据集中发布了肺癌生物量组织病理学组织成分的精确定量[三]. 在本研究中，我们利用已开发的数据集检查肺癌生物量组织成分的含量和关系，以及这些组织如何在相应的MDCT Hounsfield单位（HU）中表示。

肺结节的细胞组成是诊断的常规检查，对确定预后和治疗指南很重要[4]. 为此，在确定一种分类或一种或多种组织学亚型时，对肺结节的癌变部分给予了极大的关注[5]. 最近，对肺结节的组织学成分进行了定性描述和评估，其范围超出了结节的癌变成分，包括血管组织、纤维化组织和坏死组织[6，7]. 这些研究表明，肺结节内的坏死和纤维化比例与患者预后之间存在显著的统计学相关性。这可能会导致未来肺结节的亚型分类，其范围超出癌部分，也包括结节的非癌组织。然而，由于在评估复杂三维生物量时，很大程度上依赖于定性分级方法和小的亚取样二维场，因此在获得组织学亚型的一致分类方面已经面临着巨大的挑战。

人们普遍认为肺结节的放射学表现可能与组织学亚型有关，如与支气管肺泡癌（BAC）相关的毛玻璃样混浊[8——10]. 目前尚不清楚的是，计算机断层扫描HU变化与底层组织结构之间的相关性是否超出了实体和非实体结节成分，达到了细胞组织类型的水平。

在这项研究中，我们对切除的肺癌结节（主要是腺癌）的组织学组成进行了控制性定量评估。这项评估包括对包含结节生物量的组织学组织类型、其相对比例以及组织类型区域之间的形状和相互作用的识别。我们使用分段组织病理学数据从MDCT中分离出每种组织类型的HU直方图统计数据，并探索这些直方图之间的统计可分性。

方法

数据采集

Sieren等人描述的处理模型[11]用于生成每个肺结节病例的综合体积数据集，包括交叉注册的MDCT、显微CT和组织学数据(图1). 简言之，肺叶切除标本被插管，膨胀固定在15cmH₂O使用改良的Heitzman注视方法[12]. 固定后，使用西门子Somatom Sensation 64型MDCT扫描仪（西门子医疗解决方案公司，德国福希姆）收集固定肺叶的MDCT数据。MDCT数据扫描在120kV、140mAs、0.6mm准直下进行，并使用B35内核和300微米各向同性体素进行重建。然后从周围组织中解剖肺结节，获得高分辨率MDCT数据和micro-CT（80keV，100microA）数据。一种新型系统，大图像显微镜阵列（LIMA）[2]用以连续切片和成像肺结节。LIMA的输出是将结节体积分割成连续的500微米厚组织切片，以及一个彩色图像数据集，其中每个组织切片之间的空间对应关系与结节体积保持关联。使用标准组织病理学对每个组织切片进行处理，以制作苏木精-伊红（H&E）染色的组织切片。

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图1

生成肺癌结节三维交叉注册数据集的过程模型流程图，将分段组织病理学内容与相应的体外和体内体积MDCT数据集相关联。该过程包括特定的组织制备/成像协议、稳定硬件和使用刚性和非刚性配准的后处理。特征是在配准前后从数据集中提取的样本切片，以及配准后的体积结果描述。基于组织学的组织类型图的创建包含了对癌细胞（黑色）、非固体支气管肺泡癌模式下的癌细胞（紫色）、坏死细胞（灰色）、活性成纤维细胞间质（绿色）、透明纤维化（蓝色）、正常气道壁细胞（黄色）的实体分组的手动分割以及红细胞分组（红色）。

H&E组织学切片使用ScanScope Slide数字化仪（Aperio Technology，Vista，CA）进行数字化，并由具有肺病理学亚专业专业知识的外科病理学家进行分析。分析涉及手动分割：癌细胞固体分组（黑色）、非固体支气管肺泡癌模式下的癌细胞（紫色）、坏死肿瘤（灰色）、活动性纤维化（绿色）、透明纤维化（蓝色）、正常气道壁组织（黄色）和红细胞分组（红色）。分割结果显示为彩色编码的组织类型图，如所示图1.

LIMA图像数据集是数字化组织学数据非刚性注册的基础，可以补偿标准组织病理学处理中出现的变形和收缩。因此，结节的许多组织学切片可以与原始结节体积对齐，因为它不仅在LIMA数据集（注册所基于的数据集）中表示，而且在体积micro-CT和MDCT数据集中表示[11].

来自组织病理学的肺结节成分

组织病理学数据的分割，为每个数据集生成组织类型图，允许对结节的组成进行定量评估。通过将组织类型类中的像素数相加，再除以所有组织类型类的像素总数，计算出每种组织类型的比例。对每个结节的11个组织病理切片进行了平均分析。图2以百分比条形图的形式列出这些结果。数据集中出现了广泛的组织类型百分比分布。

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图2

使用3D组织病理学数据集确定了5例腺癌和神经内分泌癌及鳞状细胞癌的每种组织类型的比例。

肺结节成分的体积组织病理学表现

组织病理学获得的组织类型图也用于生成结节内组织类型的3D重建，图3通常，根据组织病理学数据创建3D重建具有挑战性，因为在创建组织学幻灯片时会发生组织变形。我们独特的数据采集和处理步骤，如上所述，允许纠正这种畸变，并在全球坐标空间中对齐连续组织切片。因此，可以建立体积组织病理学数据集。在组织病理学数据中，平面内分辨率（8.54微米）和后续切片之间的间隔（约500微米）之间存在各向异性。使用Lanczos重采样来降低平面内分辨率，并使用三次插值来桥接后续截面之间的信息。然后通过平滑三角形近似生成每种组织类型的3D曲面。三维组织类型重建在可视化整个结节体积内组织类型的分布方面很有价值。这些重建有助于全面了解结节的体积含量和组织边界之间的关系。

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图3

通过对腺癌结节的分段组织类型进行体积重建，可以更全面、定性地了解不同组织类型之间的关系及其在整个结节体积中的分布。显示了每种组织类型（实体癌、非实体支气管肺泡癌模式的癌性肿瘤、活性成纤维细胞间质、透明质（非活性）纤维化和血液）的单独渲染图，以及综合体积渲染图。

相关组织病理学和MDCT

描述和评估了肺结节内组织类型的组织病理学异质性后，可以将此信息与MDCT表现联系起来。MDCT数据还显示了肺部结节内灰度或Hounsfield单位（HU）的异质性，但尚不清楚两者之间是否存在相关性。

将组织病理学组织类型图和放射学数据集注册到公共坐标系后，在放射学资料中的体素和组织类型标签之间建立了直接对应关系。该标记用于提取每个组织类型对应的HU值，并对是否存在显著差异进行统计评估。

组织类型图被分割成一系列二进制掩模，每个掩模对应一种组织类型。使用Lanczos重采样对每个二进制掩模进行重采样，以匹配micro-CT、孤立结节MDCT数据集和固定瓣MDCT数据集中的分辨率。作为体内MDCT数据集是在不同的MDCT系统上使用不同的扫描协议获得的，并使用不同的重建核以低分辨率重建，这些数据无法合并。

二元掩模用于从放射学数据中分离特定于组织类型的像素。找到每种组织类型的HU直方图，并收集直方图统计数据，包括平均值、中位数、标准偏差、偏度和峰度。将每个组织学切片的90个值制成表格（3种成像模式的6种组织病理学组织类型提供5个直方图统计），图4.

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图4

摘要图说明了获取每个组织切片的直方图统计测量值的方法。对于每个组织切片，都会生成相应的组织类型图，其中每种颜色代表一种特定的组织类型；癌细胞固体分组（黑色）、非固体支气管肺泡癌模式下的癌细胞（紫色）、坏死细胞（灰色）、活性成纤维细胞基质（绿色）、透明纤维化（蓝色）、正常气道壁细胞（黄色）和红细胞分组（红色）。每个组织类型图被分割成一系列二进制掩模，每个组织类型对应一个掩模。使用Lanczos重采样对每个二进制掩模进行重采样，以匹配micro-CT、孤立结节MDCT数据集和固定叶MDCT数据集中的分辨率，并用于从放射学数据中分离特定于组织类型的像素。找到每种组织类型的HU直方图，并收集直方图统计数据，包括平均值、中位数、标准偏差、偏度和峰度。

仅对腺癌病例进行基于组织病理学组织类型的HU值统计分离评估。由于只获得了一个完整的鳞状细胞数据集和一个神经内分泌癌数据集，这些数据集不足以计算这些癌症类型的方差。

线性混合模型分析用于比较组织学组织类型之间的平均直方图参数。接下来是Tukey的组织类型平均值配对比较测试。对每种成像方法（显微CT、孤立结节MDCT和固定叶MDCT）分别进行分析。

结果

在所有腺癌病例中，实体癌和活动性纤维化组织类型的区域数最多，分别为2299和2260。然而，这些区域的平均大小与平均区域大小为1.7 mm的实体癌肿瘤大不相同²而活动性纤维化的平均区域大小为0.17mm²坏死、非活性纤维化、癌性肿瘤（非固体BAC）和红细胞的区域数分别为509、448、216和193。图5显示了组织类型区域的平均面积。

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图5

每种组织类型区域平均面积（±SD）的图形表示。红细胞、坏死和活性成纤维细胞间质的区域最小，而支气管肺泡癌结构（非实体BAC）后的癌区域面积最大。

所有数据集中每种组织类型的欧拉数平均范围图如所示图6图中清楚地显示，非活动性纤维化组织类型是最具包容性的，坏死和血液区域仅以岛屿形式存在（如全球最小欧拉数所示）。实体癌肿瘤也表现为比活动性纤维化和非实体BAC癌肿瘤更全面。图7显示了所有结节数据集中每种组织类型的平均致密度。从这些数据来看，坏死区域和红细胞群具有最简单、最紧密的边界，平均紧密度值分别为0.68和0.81。平均而言，非活性纤维化区域包含最复杂的边界，整体致密度值最低，为0.45。癌区（固体和非固体BAC）和活动性纤维化的紧密度值相当，分别为0.55、0.49和0.53。

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图6

所有结节数据集中每种组织类型的欧拉数平均值（±SEM）范围。还绘制了整体最小欧拉数。该图揭示了一种趋势，即非活动性（透明）纤维化和癌性肿瘤组织类型趋向于包络，而其他组织类型趋向包络。

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图7

所有结节数据集中每种组织类型的平均（±SD）致密度值。红细胞和坏死区域边界最紧密，而非活动（透明）纤维化区域最复杂。

讨论

如上所述，肺癌结节是一种复杂的生物量。生物量内组织病理学组织类型的静态组织对于扩展当前对癌症生物学的理解是有信息的。

形状描述符特征用于评估结节的区域结构。观察组织类型中区域的数量和大小，发现活动性纤维化区域较小，但数量众多。非活动性纤维化区域的平均大小与实体癌区域相似，然而，在结节体积中存在更多的癌区域。在所有组织类型中，非固态BAC癌性肿瘤的区域面积最大。红细胞类别仅反映肿瘤内较大的血管，而不是难以分割的小毛细血管，因此结节中的血液比例(图2)并不表示结节内有完整的血液供应。

使用欧拉数，发现非活动性纤维化是最常见的组织类型。实体癌肿瘤的欧拉数范围也很大，是全球第二低的最小值。一种可能的解释是，纤维化是对癌区的反应，随着肿瘤生物量的发展，纤维化取代了癌症。坏死区域欧拉数的小范围和零全局最小值表明该组织类型不包括其他组织类型区域。这可能是导致坏死发生的机制的指示。如果坏死区域仅由癌组织的细胞死亡形成，我们预计坏死的欧拉数与实体癌区域的欧拉值变化程度相同。然而，坏死的欧拉数接近零，范围很小，这表明坏死区域可能是由于结节某一区域缺乏足够的血液供应，导致该区域所有组织类型的细胞死亡。

正如预期的那样，红细胞群强烈地呈现为被包围的岛屿区域。这表明血液包含在血管壁内，并与其他组织类型分离。红细胞区域也被发现在组织类型外具有最紧密的边界。同样，考虑到相对圆柱形血管的封闭性，这是直观的。

非活动性纤维化组织类型的平均致密度值最低，表明存在复杂区域边界，这得到了该组织类型的欧拉数结果的支持。非实体BAC癌性肿瘤区域的致密度值也相对较低，这反映了这些区域的边界遵循复杂的肺泡结构。实体癌区域的致密度值接近中点（0.5），这可能表示癌细胞的随机非定向扩张，其中一些非常复杂，而另一些非常致密。

这些数据集为通过了解混合组织学组织类型之间的关系来深入了解肺癌的复杂生长模式提供了宝贵的机会。通过对组织学内容的深入分析，可以量化组织类型的相对比例，这在检查组织学比例与患者预后之间的联系方面具有未来的潜力。这可以深入了解生长速度、治疗反应和生存时间的变化。

据我们所知，这是第一项在MDCT HU异质性和组织学组织类型之间呈现直接、统计显著相关性的工作。由于开发了一个复杂的组织采集和图像处理模型，可以在组织学和MDCT数据之间进行准确的配准，因此这些相关性是可能的。

由于数据集中的噪声程度较高，micro-CT数据集在HU中包含最大的标准误差。这是因为micro-CT的分辨率更高，而且没有与西门子Somatom Sensation 64 MDCT系统内置的相同的校正，在该系统上采集了孤立结节和固定叶MDCT数据。使用空气和水模型将原始显微CT数据转换为HU，以确定灰度值的线性校正。这导致micro-CT和MDCT图像集之间的HU校准不同。

当前研究的局限性在于MDCT数据仅限于体外数据集。在这项检查中，我们建立了创建交叉注册多模式数据集的方法，我们还为MDCT中的组织可分性建立了一个有价值的基线。使用孤立结节MDCT数据集中的平均HU获得了放射数据集中组织学组织类型之间的最大可分性。我们相信，这为进一步研究组织学数据注册到高分辨率、体内MDCT和灌注MDCT数据集提供了良好的动机，以及一种经过测试的方法，这是我们未来的目标。总之，我们对肺癌结节的细胞成分进行了深入分析。该分析包括对实体和非实体癌区域以及非癌组织（坏死组织、纤维化组织和血管组织）的详细分割。利用这些分割，我们能够在个案基础上定量地探索每种组织类型的比例。我们还评估了完整的腺癌数据集，以确定组织特异性区域的特征及其相互关系。使用与相应的计算机断层扫描数据配准的分割组织学数据，我们已经确定，对于至少一些组织学类型，使用放射学HU统计可以实现统计学上显著的可分离性。

补充材料

致谢

脚注

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