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基因发育。2001年12月1日；15(23): 3118–3129.
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PMID：11731476

芽殖酵母蛋白激酶Ipl1/Aurora允许不存在张力来激活纺锤体检查点

苏·比金斯1,2,4和安德鲁·默里2,三
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摘要

纺锤体检查点阻止有丝分裂纺锤体缺陷细胞的细胞周期进展。虽然几个主轴缺陷激活了主轴检查点，但主信号的确切性质尚不清楚。我们发现，Aurora蛋白激酶家族的芽殖酵母成员Ipl1p需要维持纺锤体检查点阻滞的子集。Ipl1p是维持蛋白激酶Mps1过度表达诱导的纺锤体检查点所必需的。Ipl1p失活可使过表达Mps1p的细胞逃避有丝分裂并正常分离染色体。因此，主轴检查点对Ipl1p的要求不是动粒和/或主轴缺陷的结果。对Ipl1p的要求区分了纺锤体检查点的两种不同激活物：Ipl1p功能是由动粒不受张力的染色体触发的延迟所必需的，但对于纺锤体解聚诱导的阻滞则不需要。在有丝分裂期间，Ipl1p定位于动粒或其附近，我们认为Ipl1p是监测动粒张力所必需的。

关键词：Ipl1/Aurora蛋白激酶、纺锤检查点、芽殖酵母、Mps1蛋白激酶、动粒、张力

遗传信息的准确传播依赖于忠实的染色体分离。准确的染色体分离取决于染色体周期中事件的精确协调。当染色体在S期复制时，姐妹染色单体之间的连锁（凝聚力）建立，并且必须在染色体在有丝分裂纺锤体上凝聚和排列时保持。染色体通过动粒附着在有丝分裂纺锤体上，动粒是组装在着丝粒DNA序列上的特殊蛋白质结构。一旦所有染色体在有丝分裂纺锤体上正确排列，姐妹染色单体的凝聚力必须在后期迅速溶解，以使姐妹染色单体能迅速分离到有丝分裂的纺锤体的相反两极。这些步骤中的任何一个缺陷都可能导致非整倍体，这是肿瘤细胞的标志，也可能导致一些先天缺陷(Lengauer等人，1997年,1998).

纺锤体检查点阻止细胞分离姐妹染色单体，直到染色体对齐完成。检查点的保守成分包括Mad（Mad1–Mad3）蛋白、Bub1和Bub3、Mps1（蛋白激酶）和Cdc55(Hoyt等人，1991年；Li和Murray 1991年；Minshul等人，1996年；Weiss and Winey 1996年；王和伯克1997). 一个单独的控制，即Bub2依赖性检查点，监测染色体分离的第二个方面，即DNA或纺锤极体进入子细胞的传递(Alexandru等人，1999年；Fesquet等人，1999年；Fraschini等人，1999年；李1999). 纺锤体检查点缺陷与遗传不稳定有关，一些人类癌症含有突变的纺锤体检查点基因(Cahill等人，1998年；Takahashi等人，1999年)

纺锤体检查点监测动粒和微管之间的相互作用。纺锤体检查点蛋白定位于动粒(Chen等人，1996；Taylor和McKeon 1997年；Bernard等人，1998年)激活检查点的所有已知动粒和纺锤缺陷都会影响动粒和微管之间的相互作用(王和伯克1995；Pangilinan和Spencer，1996年；Wells and Murray 1996年；Hardwick等人，2000年). 检查站如何监测动粒排列？一些实验表明，它能感知微管相关力对动粒施加的张力(李和尼克拉斯1995)而其他人则认为它能感应微管与动粒的连接(Rieder等人，1995年；Waters等人，1998年). 然而，因为张力影响微管与动粒的连接(金和尼克拉斯2000)紧张与依恋在检查点信号中的作用不易区分。在芽殖酵母中，纺锤检查点可以检测到减数分裂中张力的缺陷(Shonn等人，2000年)和有丝分裂(斯特恩和穆雷2001).

纺锤体检查点通过抑制姐妹染色单体的分离来阻止细胞周期，从而导致后期，即染色体分离和纺锤体伸长的结合。后期的调节步骤是泛素介导的securin蛋白水解，securin是一种分离酶抑制剂，是一种裂解Scc1/Mcd1p的蛋白酶，Scc1/Mcd1p是凝聚蛋白复合体的组成部分，将姐妹结合在一起(Cohen-Fix等人，1996年；Funabiki等人，1996年；Uhlmann等人，1999年,2000)和纺锤体中区蛋白Slk19(Sullivan等人，2001年). Securin（Pds1p）被Cdc20p激活的后发复合体（APC）泛素化(Visintin等人，1997年). 主轴检查点抑制Pds1破坏的能力取决于Mad2p与Cdc20p的结合(Hwang等人，1998年；Kim等人，1998年).

酵母Ipl1和果蝇属Aurora A蛋白是保守的丝氨酸/苏氨酸激酶家族（Ipl1/Aurora）的创始成员，其成员是染色体分离和胞质分裂的关键调节器(Chan和Botstein 1993；Glover等人，1995年). 芽殖和分裂酵母含有一个Ipl1p/Aurora同源物，而多细胞真核生物有多个同源物。人类极光1和极光2基因是在许多结直肠癌和乳腺癌细胞系中扩增的癌基因，表明激酶对维持基因组稳定性至关重要(Sen等人，1997年；Bischoff等人，1998年；Tanaka等人，1999年). Aurora激酶包含保守的C末端催化结构域和发散的N末端结构域，分为三个家族，A、B和C（有关综述，请参阅Nigg 2001年). 极光B激酶与保守的内着丝粒蛋白（INCENP）相互作用(Kim等人，1999年；Adams等人，2000年,2001；Kaitna等人，2000年). INCENP定位缺陷扰乱了极光B的定位，表明相互作用的至少一个功能可能是将极光B定位于有丝分裂结构(Adams等人，2000年). 尽管极光激酶的精确定位模式不同，但它们通常与有丝分裂结构有关，如纺锤体、纺锤体中区、中心体和动粒。Ipl1p功能缺陷导致严重的染色体分离缺陷，许多对姐妹染色单体移向单极而不是分离到相反的极(Chan和Botstein 1993年；Biggins等人，1999年；Kim等人，1999年). 体外实验表明，这种表型是由于微管与动粒结合改变所致国际石油公司1突变体细胞，提示Ipl1p在动粒中起作用(Biggins等人，1999年).

这里我们表明，Ipl1p是不受张力影响的动粒所必需的，可以延迟细胞有丝分裂，这表明Ipl1p可能在监测动粒的作用力方面发挥特殊作用。

结果

ipl1突变细胞不激活纺锤体检查点

我们之前分离了IPL1级筛选出姐妹染色单体分离或分离缺陷突变体的基因，并确定国际石油公司1突变细胞在调节微管与动粒结合方面有缺陷(Biggins等人，1999年,2001). 虽然动粒功能需要Ipl1p(Biggins等人，1999年)，国际石油公司1突变细胞不会停止有丝分裂，这表明它们不会激活纺锤体检查点(Chan和Botstein 1993年；Biggins等人，2001年). 为了证实这一建议，我们分析了Pds1p的水平。由于主轴检查点禁止APC激活，因此当主轴检查点激活时，Pds1p水平稳定。野生型和ipl1-321号机组含有表位标记的Pds1-myc18蛋白的温度敏感性突变细胞在G1使用α因子，然后在没有α因子的情况下释放到非允许温度（37°C）。Pds1p水平的循环类似于ipl1-321号机组和野生型细胞（图。​（图1A），1A） ，而如果主轴检查点被激活，则Pds1p应该已经稳定。植物的出芽和细胞分裂ipl1-321号机组细胞也类似于野生型细胞：两个菌株都以相似的动力学经历出芽和胞质分裂（图。​（图1B）。1B） ●●●●。我们分析了野生型和ipl1-321号机组在相同的实验中进行应变，以确保国际石油公司1突变等位基因失活。通过将GFP-乳糖阻遏物（GFP-lacI）与整合在TRP1号机组距着丝粒12kb的位点(Straight等人，1996年). 然而，在野生型细胞中，第四染色体姊妹染色单体总是分离到相反的两极，而只有15%的第四染色体姐妹染色单体分离到相反两极ipl1-321号机组单元格，如我们之前所示（图。​（图1C；1C类；Biggins等人，1999年). 因此，ipl1-321号机组尽管动粒行为存在缺陷，导致严重的染色体分离缺陷，但细胞并没有激活纺锤体检查点。

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国际石油公司1尽管存在染色体分离缺陷，但突变体并没有激活纺锤体检查点。野生型（SBY818）和ipl1-321号机组含有Pds1-myc18的细胞（SBY819）在G1在允许温度（23°C）下使用α因子，并释放到非允许温度（37°C）。当小芽形成时，α-因子被添加回来，以阻止细胞进入下一个细胞周期。(A类)在指定的时间点制备裂解液，并用抗myc抗体进行免疫印迹，以分析Pds1-myc蛋白水平。Pds1p水平在野生型细胞和ipl1标准突变细胞，表明纺锤体检查点未被激活。根据Ponceau S染色判断，所有通道中的蛋白质浓度相等（数据未显示）。(B)在同一实验中，用显微镜定量了出芽细胞的百分比，并显示野生型（填充正方形）和ipl1-321号机组细胞（开口方块）以类似的动力学经历出芽和胞质分裂。(C)在同一个实验中，IV号染色体分离百分比被监测为将IV号染色体的两个GFP标记拷贝分离到纺锤体相反两极的细胞分数。虽然IV号染色体在野生型细胞（填满的方块）中分离，但在ipl1-321号机组单元格（开放正方形）。

Mps1过度表达诱导的检查站阻滞需要Ipl1p

以下故障有两种可能的解释国际石油公司1突变细胞激活纺锤体检查点：（1）纺锤体检测点需要Ipl1p功能，或（2）国际石油公司1动粒缺陷不会激活检查点。为了观察Ipl1p是否是纺锤体检查点的一部分，我们测试了Ipl1p是否是由Mps1p过度表达诱导的阻滞所必需的，Mps1p的过度表达构成了纺锤体检测点的激活，用双极纺锤体阻止中期细胞(Hardwick等人，1996年). 我们被捕了ipl1-321号机组有丝分裂细胞中Mps1p的过表达加仑1启动子在允许温度下启动，然后将其转移到35°C以使Ipl1p失活。我们通过分析Pds1p水平和胞质分裂监测中期停搏。Pds1p水平在年开始下降GAL-MPS1管道1-321细胞在非允许温度下20分钟后，而Pds1p在GAL-MPS1型电池至少1小时（图。​（图2A）。2A） ●●●●。几个GAL-MPS1型由于半乳糖诱导在高温下不起作用，细胞退出检查点阻滞。然而GAL-MPS1管道1-321细胞更快地退出检查点阻滞，表明Ipl1p在维持由Mps1p过度表达引起的检查点依赖性阻滞中发挥作用。我们在同一个实验中监测了胞质分裂，发现了类似的结果：在非允许温度下40分钟后GAL-MPS1型细胞有胞质分裂，而40%的细胞GAL-MPS1管道1-321单元格（数据未显示）。

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需要Ipl1p来维护加仑-英里/平方英寸1检查站逮捕。GAL-MPS1型（SBY679）和GAL-MPS1管道1-321将（SBY680）细胞在半乳糖中滞留3.5 h，然后释放到非允许温度（35°C）进行灭活国际石油公司1. (A类)用抗myc抗体免疫印迹法监测Pds1-myc蛋白水平。Pds1水平在GAL-MPS1管道1-321单元格与GAL-MPS1型电池，表示需要Ipl1p来全面维护GAL-MPS1型检查站逮捕。(B)在同一实验中，用抗myc抗体免疫印迹法监测Mps1水平。这两种菌株的Mps1蛋白水平都下降，但在ipl1-321号机组细胞。根据Ponceau S染色判断，所有通道中的蛋白质浓度相等（数据未显示）。(C)通过GFP标记的IV号染色体的显微镜监测IV号染色体分离。该染色体正常分离为GAL-MPS1型单元格（填充正方形）和GAL-MPS1管道1-321牢房（开放广场）离开了检查站。

为了确定菌株是否表达不同水平的Mps1蛋白，我们通过免疫印迹分析了Mps1–myc蛋白水平（图。​（图2B）。2B） ●●●●。两个菌株的Mps1蛋白水平在至少30分钟内相似，然后两个菌株中的水平开始下降。因为GAL-MPS1管道1-321菌株的Mps1p水平没有维持在GAL-MPS1型我们考虑了Ipl1p可能影响Mps1p稳定性的可能性。为了测试这一点，我们分析了野生型和ipl1-321号机组使用诺卡唑将细胞阻滞在中期，发现菌株之间的Mps1p稳定性没有差异（数据未显示）。因此，Ipl1p并不调节Mps1p的稳定性。相反，当细胞退出有丝分裂时，Mps1蛋白可能变得不稳定；G细胞阻滞1与中期阻滞细胞相比，α-因子的Mps1p要少得多（数据未显示）。综上所述，这些数据表明需要Ipl1p来全面维护加仑-英里/平方英寸1检查点停止，随着细胞有丝分裂的退出，Mps1蛋白水平下降。

完全废除动粒功能的突变破坏了纺锤体检查点(Gardner等人，2001年). 我们排除了以下可能性ipl1-321号机组在上述实验中，通过监测GFP标记的第四染色体的分离，产生了这样的效果。第四号染色体的两个拷贝分离到相反的两极，作为GAL-MPS1型细胞在35°C时从检查点依赖性阻滞中逃脱。在非允许温度下30分钟后GAL-MPS1型和66%的GAL-MPS1管道1-321细胞将第四染色体分离到相反的两极（图。​（图2C）。2C） ●●●●。事实上，第四号染色体在ipl1-321号机组我们的结论是，一旦双极纺锤体建立，Ipl1p功能就不需要维持动粒的功能，但需要维持检查点相关的阻滞。因此，本实验确定了Ipl1p在纺锤体检查点维持中的功能，该功能与它在染色体分离中的功能暂时分离。

诺康唑引起的纺锤检查点阻滞不需要Ipl1p

接下来，我们测试了诺卡唑和苯诺明诱导的纺锤体检查点阻滞是否需要Ipl1p，诺卡唑与苯诺明可以解聚组成纺锤体的微管。我们逮捕了野生型，ipl1-321号机组、和mad2ΔG中的突变细胞1使用α-因子，然后在非允许温度（35°C）下将其释放到诺卡唑和苯诺明的混合物中灭活国际石油公司1。我们监测了Pds1p水平，发现野生型和ipl1-321号机组细胞激活纺锤体检查点，并在诺卡唑和高Pds1p水平的苯诺明中滞留（图。​（图3A）。三A） ●●●●。相反，mad2Δ细胞没有维持高Pds1p水平，因为纺锤体检查点没有激活。因此，IPL1级其表现与已知的纺锤体检查点基因不同，因为它是完全维持GAL-MPS1型-诱导的阻滞，但对于诺可达唑诱导的阻滞不是必需的。此外，由于需要功能性动粒来激活检查点以响应纺锤体解聚(Gardner等人，2001年)，这个实验表明国际石油公司1突变细胞能够在没有纺锤体的情况下激活检查点。

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(A类)诺卡唑引起的检查站逮捕不需要Ipl1p。野生型（SBY818），ipl1-321号机组（SBY819），mad2Δ（SBY920），以及bub2Δ含有Pds1-myc18的（SBY934）细胞在G1允许温度（23°C）下的α系数。在非允许温度（37°C）下，将其释放到诺卡唑和苯诺明中，并在出现小芽时添加α-因子，以阻止细胞进入下一个细胞周期。通过免疫印迹分析Pds1p水平，显示野生型，ipl1-321号机组、和bub2Δ突变细胞激活纺锤体检查点，因为它们保持高Pds1水平。Pds1p水平循环mad2Δ突变细胞，缺乏纺锤体检查点。根据Ponceau S染色判断，所有通道中的蛋白质浓度相等（数据未显示）。(B)IPL1级在中不起作用业务单元2-依赖性检查点通路。野生型（SBY214），ipl1-321号机组（SBY322），以及bub2Δ在非允许温度下，将（SBY432）突变细胞释放到诺卡唑和苯诺明中。监测大芽细胞的百分比，显示野生型（填充方块）和ipl1-321号机组细胞（阴影正方形）以大芽细胞的形式停滞，而bub2Δ细胞（灰色方块）重新构建，表明Ipl1p与Bub2p不在同一途径中。

诺康唑的加入可以通过激活纺锤体检查点或业务单元2-监测纺锤极体向子细胞的递送的依赖性途径。尽管主轴检查点使Pds1p稳定业务单元2-依赖性途径不(Alexandru等人，1999年). 我们通过分析bub2Δ从G释放的细胞1在上述实验中，在非允许温度下转化为诺卡唑（图。​（图3A）。三A） ●●●●。因为国际石油公司1变种人表现得像bub2型在诺卡唑存在下维持Pds1p水平的突变细胞，我们测试Ipl1p是否是Bub2依赖性通路的组成部分，而不是纺锤体检查点。野生型，ipl1-321号机组、和bub2Δ在非允许温度（35°C）下，将双突变细胞释放到诺卡唑和苯诺明中，并监测4小时内大芽细胞的百分比（图。​（图3B）。三B） ●●●●。尽管是野生型和ipl1-321号机组细胞被捕获为大的芽细胞bub2Δ细胞并没有维持大的芽细胞阻滞。最近的研究表明，只有当纺锤体检查点和业务单元2-相关检查点有缺陷(Alexandru等人，1999年；Fesquet等人，1999年). 然而，我们在bub2Δ细胞，可能是因为诺康唑在高温下不起作用。虽然bub2Δ细胞重建，我们在第1-321页突变细胞，表明它们的行为与bub2Δ细胞。因此，Ipl1p可能在与Bub2p不同的途径中发挥作用，因为ipl1-321号机组诺可达唑在高温下的停药，这种情况允许bub2Δ细胞在短暂延迟后离开有丝分裂。

动粒张力缺陷引起的纺锤检查点延迟需要Ipl1p

在多细胞真核生物中，检查点似乎可以监测微管与动粒的连接以及动粒产生的张力(李和尼克拉斯1995；Rieder等人，1995年). 我们考虑了Ipl1p监测动粒张力但不监测芽殖酵母中附着的可能性，并在微管附着发生但未产生张力的实验中验证了这一假设。由于姐妹染色单体彼此相连，试图将姐妹动粒拉向相反的两极会对动粒及其之间的联系产生张力。在没有DNA复制的情况下，由于动粒缺乏姐妹，所以不能产生紧张。DNA复制可以通过抑制CDC6型启动复制所需的基因(Piatti等人，1996年)不影响微管和动粒之间的相互作用(Piatti等人，1995年). 在这些单元格中，Pds1p以与主轴检查点相关的方式稳定(斯特恩和穆雷2001).

我们使用这个操作来询问是否需要Ipl1p来感知动粒张力的缺失。我们将野生型细胞与三种在含葡萄糖培养基上生长时无法复制DNA的菌株进行了比较：具有完整纺锤体检查点的细胞(镀锌-CDC6); 缺少Mad1p（已知的纺锤检查点组件）的细胞(GAL-CDC6 mad1Δ); 和Ipl1p突变的细胞(GAL-CDC6第1-321页). 缺乏Cdc6蛋白的细胞在G中被阻止1α-因子释放到灭活Ipl1p（37°C）并抑制CDC6型（含葡萄糖培养基）和Pds1p水平在细胞周期中通过免疫印迹进行监测（详见材料和方法）。尽管Pds1p水平随着野生型细胞进入后期而下降，但在含有未复制DNA的Cdc6缺失细胞中，Pds1p水平至少稳定1小时（图。​（图4A）。4A） ●●●●。Pds1p的稳定需要主轴检查点，因为它在GAL-CDC6 mad1Δ细胞。我们发现Pds1p水平在GAL-CDC6第1-321页细胞，表明纺锤体检查点需要Ipl1p来延迟动粒不受张力的细胞。

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Ipl1p是由动粒张力缺陷引起的检查点阻滞所必需的。(A类)耗尽Cdc6蛋白的细胞在允许温度（23°C）下生长，并在G1具有α因子。然后从G中释放细胞1在葡萄糖中保持非允许温度（37°C）镀锌-CDC6压抑；免疫印迹法分析Pds1p水平。Pds1p水平在野生型细胞（SBY818）中循环，但在镀锌-CDC6细胞在抑制培养基（SBY772）中生长。Pds1p水平在GAL-CDC6 mad1Δ（SBY762）和GAL-CDC6第1-321页（SBY771）突变细胞，表明检查点未激活。(B)mcd1-1型（SBY870）和mcd1-1 ipl1-321细胞（SBY871）在G中被捕1允许温度下的α因子。在不含α-因子的情况下，将其释放至非允许温度（37°C），并通过免疫印迹法监测Pds1-myc18蛋白水平。Pds1p在mcd1/scc1突变细胞在mcd1-1 ipl1-321细胞，表明Ipl1p是姐妹染色单体内聚缺陷诱导的纺锤体检查点所必需的。根据Ponceau S染色判断，所有通道中的蛋白质浓度相等（数据未显示）。

我们通过观察一种通过不同机制破坏动粒张力的突变体，证实了Ipl1p的作用。Mcd1p/Scc1p是连接姐妹染色单体的凝集素复合体的一个成分(Guacci等人，1997年；Michaelis等人，1997年). 如果没有它，动粒仍然可以附着在微管上(Tanaka等人，2000年)但因为姐妹染色单体之间没有联系；这些附件没有张力。我们被捕了mcd1-1和mcd1-1 ipl1-321G中的突变细胞1在允许温度下用α-因子，然后将其释放到非允许温度（37°C）以灭活突变等位基因。Pds1p在mcd1-1型单元格，表示检查点被激活（图。​（图4B）。4B） ●●●●。此延迟在mcd1-1 ipl1-321双突变体细胞，表明纺锤体检查点需要Ipl1p来延迟细胞的动粒被不同的机制放松。

Ipl1p在中期定位于动粒

由于大多数已知的纺锤体检查点蛋白定位于动粒，我们分析了有或无纺锤体检测点激活的中期阻滞细胞中的Ipl1p定位。酵母细胞核很小，所以用标准的免疫荧光技术不可能看到单个动粒。因此，我们检测了染色体扩散，即酵母球状体中不溶于洗涤剂的残留物(Loidl等人，1998年). 我们使用一个表位标签来查看Cse4p或Ndc10p，这是两个已知的动粒组分，另一个用于查看Ipl1p。为了获得中期阻滞细胞，我们在川东北2637°C下APC活性所需的基因(黄和穆雷1997).cdc26Δ将含有表位标记的Cse4p和Ipl1p的突变细胞移到非允许温度下3小时，以阻止细胞进入中期。对染色体扩散进行免疫荧光检测，发现Ipl1p与动粒蛋白Cse4p共定位（图。​（图5A）。5A） ●●●●。当我们分析SPB组件Spc42p（数据未显示）时，Ipl1p未与纺锤极体（SPB）共存。此外，Ipl1p定位依赖于功能性动粒，因为它消失在ndc10-1型废除所有动粒功能的突变体（数据未显示）。我们还分析了在纺锤体检查点激活的中期细胞中Ipl1p的定位。将细胞释放到诺卡唑中3 h，染色体扩散上的免疫荧光显示Ipl1p与另一个动粒成分Ndc10p共定位（图。​（图5B）。5B） ●●●●。由于染色体扩散的分辨率有限，我们无法区分Ipl1p是定位于动粒本身还是定位于相邻的动粒依赖结构。

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Ipl1p在中期定位于动粒。(A类)Ipl1p在中期停搏期间定位于动粒。Cdc26Δ将含有Cse4p–myc13和Ipl1p–HA3（SBY961）的细胞移到非允许温度（37°C）下3小时，使其在中期停滞。进行染色体扩散并用DAPI染色以识别DNA(左边面板），并用抗myc和抗HA抗体分别识别Cse4p和Ipl1p(中间的面板）。合并后的图像(正确的面板）显示Ipl1p和Cse4p在中期停搏期间共定位。(B)Ipl1p在检查站逮捕期间定位到动粒。将含有Ndc10p–HA3和Ipl1p–myc12（SBY596）的细胞在23°C下在诺可达唑中阻滞3小时。进行染色体扩散并用DAPI染色以识别DNA(左边面板），并使用抗HA和抗myc抗体分别识别Ndc10p和Ipl1p(中间的面板）。合并的图像(正确的Ndc10p和Ipl1p图像的面板）显示，在检查点逮捕期间，Ipl1p+Ndc10p+kinetochores共定位。

讨论

我们发现，Ipl1/Aurora蛋白激酶在芽殖酵母的纺锤体检查点中起作用，与纺锤体上染色体排列的早期作用暂时分离。Ipl1p区分了附着在微管上的动粒缺乏张力和没有束缚微管的动粒。我们建议，Ipl1p是监测动粒张力缺陷所必需的。

Ipl1/Aurora激酶家族的功能

Aurora蛋白激酶家族成员在染色体分离、凝聚和胞质分裂中具有功能（有关综述，请参阅比肖夫和犁手1999). 染色体分离缺陷国际石油公司1突变体导致成对的姐妹染色单体移向单个纺锤极而不是相反的纺锤极，从而导致严重的非整倍性(Chan和Botstein 1993年；Biggins等人，1999年；Kim等人，1999年). 在果蝇属，通过培养的双链RNA干扰耗尽极光B果蝇属细胞导致多倍体，这是一种与芽殖酵母相似的表型国际石油公司1突变表型(Adams等人，2001年；Giet和Glover 2001). 在秀丽隐杆线虫，当Aurora B同源物AIR-2被RNA干扰耗尽时，观察到类似的染色体分离缺陷(Kaitna等人，2000年). Aurora B在染色体分离中的确切作用尚不清楚。在芽殖酵母中，它似乎控制着动粒行为，因为从国际石油公司1突变细胞与动粒在体外产生异常调节的微管相互作用(Biggins等人，1999年). 在果蝇属，Aurora B是正常中期染色体对齐、后期动粒分离所必需的(Adams等人，2001年)正常的染色体凝集和Barren凝聚蛋白向染色体的募集(Giet和Glover 2001年). Aurora B磷酸化出芽酵母和秀丽线虫，一个与染色体浓缩相关的事件(Hsu等人，2000年). 然而，在酵母中，没有与缺乏H3磷酸化相关的表型，这表明Ipl1p必须有额外的靶点。

在出芽酵母中，Ipl1p需要感知不受张力的动粒，这揭示了该蛋白激酶家族的另一种功能。尽管染色体分离存在缺陷，但极光B中的突变不会导致任何生物体内的细胞周期停滞，这表明该激酶可能在纺锤体检查点中发挥作用。我们通过暂时分离Ipl1p在染色体比对和纺锤体检查点中的作用来证实这种可能性。过表达Mps1p激活检查点，以明显正常的双极纺锤体阻止中期细胞(Hardwick等人，1996年)尽管Mps1过度表达时动粒张力的状态尚不清楚。什么时候？ipl1-321号机组过表达Mps1p的细胞被转移到非允许温度以使Ipl1p失活，大多数细胞退出细胞周期并正常分离染色体。因此，Ipl1p是维持纺锤体检查点阻滞所必需的，并且该功能在时间上独立于早期染色体分离的重要作用。此外，本实验表明，Ipl1p在染色体分离中的重要作用必须发生在纺锤体组装之前或期间。其他生物体中与极光B缺陷相关的细胞周期阻滞的缺乏可能是由于类似缺陷的纺锤体检查点。

中期Ipl1p定位于动粒

中期停搏期间，Ipl1p激酶定位于动粒或动粒附近。我们以前没有用免疫荧光技术在固定的全细胞上检测到Ipl1p的动粒定位(Biggins等人，1999年). 然而，通过对不溶核物质的染色体扩散进行免疫荧光，我们能够在中期检测到Ipl1p的动粒定位，表明Ipl1p属于Aurora B家族。我们的本地化结果与最近发布的结果类似(He等人，2001年). 在动粒上发现Ipl1p与它在纺锤体检查点中的作用是一致的。一些检查点成分，如Mad2p，存在于缺乏微管但中期染色体上缺失的动粒中(Chen等人，1996年). 这与Mad2p被招募来阻止已经检测到其动粒缺陷的细胞是一致的。其他检查点蛋白质，如Bub1p、Bub3p(霍夫曼等人，2001年)无论检查点是否激活，和Ipl1p都存在于动粒，这表明它们可以监测动粒-微管相互作用的状态。

Ipl1/Aurora监测张力

Ipl1p似乎在主轴检查点中具有特定作用。它需要对不处于紧张状态的动粒作出反应，但对于检测那些没有附着在微管上的动粒来说是不必要的。我们使用了两种操作来减少动粒处的张力，并且不应影响对微管的附着：阻止DNA复制或姐妹染色单体的内聚。Ipl1p对于这两种检查点诱导的阻滞都是必需的，但对于心轴完全解聚诱导的阻滞则不是必需的。对HeLa细胞的一项研究也表明，检查点的不同分支监测张力和附着(Skoufias等人，2001年).

监测动粒的张力和附着有什么好处？一种可能性是，监测张力是细胞区分一对姐妹染色单体的唯一方法，它们的动粒附着在同一个极（单向）上，而另一对姐妹染色体的动粒则附着在相反的极（生物定向；图。​图6）。两者都有6).两对姐妹的动粒都附着在微管上，但单向的动粒会导致非整倍体后代，除非细胞能够检测到这种缺陷并延迟后期直到其纠正。在芽殖酵母中，纠正很困难，因为每个动粒结合一个微管。为了纠正单向定向，其中一个姐妹动粒必须释放其微管，然后附着在源自相反纺锤极的微管上（图。​（图6）。6). 30多年前，尼克拉斯和科赫（Nicklas and Koch）表明，染色体的重新定向依赖于动粒张力：动粒-微管连接的张力是稳定的；那些不稳定的(尼克拉斯和科赫1969). 一种可能性是Ipl1p有助于使微管附着在不受张力的动粒上的不稳定。为了支持这个模型，我们之前发现国际石油公司1突变体提取物在体外ATP依赖性微管释放方面存在缺陷，这种缺陷可以通过添加重组Ipl1蛋白来修复(Biggins等人，1999年). 最近，田中和纳斯迈思发现国际石油公司1突变体似乎无法重新定位未处于张力下的染色体（T.Tanaka和K.Nasmysy，pers.comm.）。这些数据表明，体外动粒-微管相互作用的ATP依赖性丢失可能模拟了体内不受张力的动粒微管的Ipl1p依赖性微管释放。

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Ipl1p在主轴装配期间监测张力的作用模型。为了简单地说明动粒取向，显示了端粒染色体。在有丝分裂早期，动粒既不附着在微管上，也不处于张力下（充满黑色的动粒）。将两个姐妹染色单体连接到同一个极（单向）产生的动粒不受张力，但与微管结合（灰色填充的动粒）。一旦建立了生物定向纺锤，动粒上就会产生张力（开放动粒）。主轴检查点必须监控连接和张力中的缺陷，以确保双极主轴组件。我们的实验表明，Ipl1p在监测紧张状态方面具有特殊作用，但在监测依恋方面没有作用。

Ipl1p可以通过两种方式让微管结合的动粒细胞不紧张地激活纺锤体检查点。第一种是通过破坏微管附着的稳定性，从而产生裸露的动粒，它会招募Mad2等蛋白质来激活检查点。第二种方法是激活仍附着在微管上的动粒检查点。我们认为这两种机制都存在。第二个证据是ipl1-321号机组克服Mps1p过度表达引起的阻滞，再加上观察到，在缺乏功能性动粒细胞的情况下，Mps1p过度表达可以激活检查点（B.Stern和A.W.Murray，未解释）。如果Ipl1p在检查点的唯一功能是产生裸露的动粒，那么这种蛋白的缺失不应影响不依赖于动粒存在的阻滞。如果Ipl1p监测张力，则可能是在不受张力的动粒中产生磷酸特异性3F3/2表位的激酶(坎贝尔和戈尔布斯基1994；Nicklas等人，1995年).

无论是直接还是间接激活检查点，Ipl1p似乎在其他已知检查点组件的上游运行。Mad1和Mad2蛋白需要对动粒处缺乏张力或缺乏结合微管作出反应。其他检查点蛋白在张力反应中的作用尚未测试，但所有这些蛋白（Mps1p、Bub1p、Bub 3p和Cdc55p）都需要对未附着在微管上的动粒作出反应。因为Ipl1p不需要对这个缺陷作出反应，所以它必须在其他已知检查点蛋白的上游发挥作用，至少如果检查点是一个简单的线性途径（见图。​图6）。6). 对能力的最简单解释第1-321页为了克服Mps1p过度表达引起的阻滞，Mps1可以被两种或两种以上的蛋白激酶激活：Ipl1p对张力的缺乏作出反应，另一种激酶，可能是Bub1，对裸露的动粒作出反应。如果Ipl1p的组成性、基础活性足以使过表达的Mps1阻止具有正常纺锤体的细胞，那么使Ipl1p失活将缓解这种阻滞。尽管我们没有通过免疫印迹在国际石油公司1突变细胞，Mps1的激酶活性国际石油公司1需要分析突变细胞。另一种可能性是，Ipl1p以类似于Mad2检查点蛋白的方式抑制Cdc20p功能，以应对张力缺陷而不是附着缺陷。在爪蟾鸡蛋提取物，Aurora A直接与Cdc20p相互作用，Cdc20p是纺锤体检查点抑制的APC的激活剂(Farruggio等人，1999年).

对于Ipl1p仅用于检测某些动粒缺陷的解释，另一个重要的替代方法是ipl1-321号机组是定量的而非定性的：突变体仍然可以对强缺陷作出反应，但不能对弱缺陷作出反应。这种解释意味着缺乏张力会为检查点产生微弱信号，而缺乏张力和微管附着的结合会产生强烈信号。因为IPL1级是一个必需基因，不可能知道空表型是否会有更强的表型。其他等位基因的分离IPL1级可能有助于测试这些假设。

几项研究表明，人类极光基因是致癌基因。这个极光2基因在许多结直肠癌和乳腺癌细胞系中扩增(Sen等人，1997年；Bischoff等人，1998年；Tanaka等人，1999年)、和极光2映射到20q13扩增子，该扩增子在许多人类恶性肿瘤中常见，并且与不良预后相关(Tanner等人，1995年；Sen等人，1997年). 此外，激活的Aurora2的表达可以在体外转化Rat1成纤维细胞和NIH3T3细胞，并在裸鼠中引起肿瘤(Bischoff等人，1998年). 这些数据表明，Ipl1/Aurora激酶的调节缺陷可能导致基因组不稳定。虽然我们的研究涉及Ipl1功能的丧失，但Aurora激酶的过度表达可能导致类似的表型。因为检查点基因的缺陷与肿瘤发生有关，所以确定细胞在其动粒不紧张时是否需要人类Aurora B激酶来延迟将是一件有趣的事情。如果是这样，那么了解与激酶缺陷相关的基因组不稳定性是否是由染色体排列缺陷、纺锤体检查点缺陷或两者兼而有之引起将是很重要的。

材料和方法

微生物技术和酵母菌株构建

培养基、遗传和微生物技术基本上如所述(Sherman等人，1974年；Rose等人，1990年). 从G细胞中释放细胞的所有实验1通过在允许温度（23°C）下添加1μg/mLα-因子3 h，在无α-因子培养基中洗涤细胞两次，然后在预热培养基中重新悬浮，从而实现细胞的阻滞。在所有研究同步细胞周期的实验中，在细胞出芽后将α-因子添加回1μg/mL，以防止细胞进入下一个细胞周期。所有实验重复至少两次，结果相似，每个时间点至少计数100个细胞。在所有实验中，半乳糖的最终浓度为4%。由于半乳糖诱导对温度有点敏感，因此所有半乳糖实验都是在35°C而不是37°C下进行的。抑制剂储备溶液在二甲基亚砜中制备，并储存在−20°下：30 mg/mL苯甲酸（杜邦）、10 mg/mL诺卡唑（西格玛）、10毫克/毫升α-因子（生物合成）。对于苯诺明+诺卡唑实验，细胞在35°C下释放到30μg/mL苯诺明和15μg/mL诺卡唑中，因为这些药物在高温下不起作用。为了观察姐妹染色单体，将最终浓度为0.25 mM的硫酸铜添加到培养基中，诱导由铜启动子控制的GFP–lacI融合蛋白。

这个镀锌-CDC6按照以下步骤进行实验，以生成同步G1缺乏Cdc6蛋白的细胞群。首先，生长在半乳糖中的细胞在G1允许温度（23°C）下的α系数。然后将其释放到半乳糖培养基中20分钟，然后冲洗一次到葡萄糖中以抑制CDC6型基因；在下一个细胞周期中，当小芽形成时加入α-因子以重新支撑细胞。去激活ipl1-321号机组，在非允许温度（37°C）和葡萄糖存在下释放细胞，以保持CDC6型在此细胞周期中，监测Pds1水平。

表中列出了酵母菌株​表11并通过标准遗传技术构建。二倍体在23℃的选择性培养基上分离，随后在23℃下产孢。所有菌株均含有PDS1-myc18:LEU2型是由K.Nasmith馈赠的质粒整合而成的(Shirayama等人，1998年).

表1

本研究中使用的酵母菌株

应变
基因型
SBY214型材料一ura3-1 leu2,3-112 his3-11:pCUP1-GFP12-lacI12:his3 trp1-1:lacO:trp1 ade2-1可以1-100 bar1Δlys2Δ
SBY322型材料一ura3-1 leu2,3-112 his3-11:pCUP1-GFP12-lacI12:his3 trp1-1:lacO:trp1 ade2-1 can1-100 bar1Δlys2Δipl1-321
SBY432型材料一ura3-1 leu2,3-112 his3-11:pCUP1-GFP12-lacI12:his3 trp1-1:lacO:trp1 ade2-1 can1-100 bar1Δlys2Δbub2Δleu2
SBY596型材料一ura3-1:IPL1-myc12:ura3 leu2,3-112 his3-11 trp1-1 ade2-1可以1-100 bar1ΔNDC10:HA3:KAN
第679页材料一ura3-1:pGAL-MPS1-myc:ura3 leu2,3-112 ade2-1可以1-100 bar1Δlys2Δhis3-11:pCUP1-GFP12-lacI12:his3 trp1-1:lacO:trp1 PDS1-myc18:leu2
SBY680型材料一ura3-1:pGAL-MPS1-myc:ura3 leu2,3-112 ade2-1可以1-100 bar1Δlys2Δhis3-11:pCUP1-GFP12-lacI12:his3 trp1-1:lacO:trp1 PDS1-myc18:leu2 ipl1-321
SBY762型材料一ura3-1 leu2,3-112 his3-11 trp1-1 ade2-1可以1-100 bar1ΔmadlΔhis3 cdc6:pGAL-UBI-R-cdc6:ura3 PDS1-myc18:leu2
SBY771型材料一ura3-1 leu2,3-112 his3-11:pCUP1-GFP12-lacI12:his3 trp1-1:lacO:trp1 ade2-1 lys2Δcan1-100 bar1Δcdc6:pGAL-UBI-R-cdc6:ura3 PDS1-myc18:leu2 ipl1-321
SBY772型材料一ura3-1 leu2,3-112 his3-11:pCUP1-GFP12-lacI12:his3 trp1-1:lacO:trp1 ade2-1 can1-100 bar1Δcdc6:pGAL-UBI-R-cdc6:ura3 PDS1-myc18:leu2
SBY818型材料一ura3-1 leu2,3-112 his3-11:pCUP1-GFP12-lacI12:his3 trp1-1:lacO:trp1 ade2-1 can1-100 bar1Δlys2ΔPDS1-myc18:leu2
SBY819型材料一ura3-1 leu2,3-112 his3-11:pCUP1-GFP12-lacI12:his3 trp1-1:lacO:trp1 ade2-1 can1-100 bar1Δlys2ΔPDS1-myc18:leu2 ipl1-321
SBY870型材料一ura3-1 leu2,3-112 his3-11:pCUP1-GFP12-lacI12:his3 trp1-1:lacO:trp1 ade2-1 can1-100 bar1Δlys2Δmcd1-1 PDS1-myc18:leu2
SBY871型材料一ura3-1 leu2,3-112 his3-11:pCUP1-GFP12-lacI12:his3 trp1-1:lacO:trp1 ade2-1 can1-100 bar1Δlys2Δmcd1-1 PDS1-myc18:leu2 ipl1-321
SBY920型材料一ura3-1 leu2,3-112 his3-11:pCUP1-GFP12-lacI12:his3 trp1-1:lacO:trp1 ade2-1 can1-100 bar1Δlys2ΔPDS1-myc18:leu2 mad2Δura3
SBY934型材料一ura3-1 leu2,3-112 his3-11:pCUP1-GFP12-lacI12:his3 trp1-1:lacO:trp1 ade2-1 can1-100 bar1Δlys2ΔPDS1-myc18:leu2 bub2ΔKAN
SBY961型材料一ura3-1 leu2,3-112 his3-11 trp1-1 ade2-1可以1-100 bar1ΔIPL1-HA3:his3 cdc26ΔKAN CSE4:CSE4-myc13:ura3

所有菌株均为W303背景的等基因菌株。 

蛋白质和免疫学技术

制备蛋白质提取物并按说明进行免疫印迹(Minshul等人，1996年). 9E10抗体从Covance中获得，并以1:10000的稀释度使用。对于所有时间进程实验，在实验开始和结束时测量每个培养物的光密度，并在样品缓冲液中相应地对样品进行归一化。根据Ponceau S染色判断，所有通道中的蛋白质浓度相等（数据未显示）。

显微镜

按照描述进行显微镜分析姐妹染色单体(Biggins等人，1999年). 按照描述进行间接免疫荧光(Rose等人，1990年). DAPI从Molecular Probes获得，并以1μg/mL的最终浓度使用。如前所述进行染色体扩散(Loidl等人，1991年；Michaelis等人1997). Lipsol来自Lip有限公司（英国希普利）。识别HA标签的12CA5抗体以1:1000的稀释度使用，并从Covance获得。使用1:1000稀释度的A-14 c-myc兔抗体（圣克鲁斯生物技术公司）识别myc标签。Cy3二级抗体从Jackson Immunoresearch获得，并以1:2000稀释度使用。FITC二级抗体从Jackson Immunoresearch获得，并以1:500的稀释度使用。

致谢

我们特别感谢博多·斯特恩（Bodo Stern），他在检查站的工作和慷慨大方使这项工作在很大程度上成为可能。我们感谢田中富美和金·纳斯迈思在出版之前共享数据。我们感谢Stéphanie Buvelot、Rachel Howard-Till、Shelly Jones、Ben Pinsky、Marion Shonn、Bodo Stern、Sean Tatsutani和Mark Winey对手稿的批判性阅读和讨论。我们感谢加州大学旧金山分校莫里和摩根实验室过去和现在的成员，他们鼓励了我们的对话和建议，特别是玛丽恩·肖恩、亚当·鲁德纳、苏·贾斯珀森、希罗·福纳比基和尼迪·巴拉。我们感谢以下人员提供菌株和质粒：博多·斯特恩、亚当·鲁德纳和金·纳斯迈思。这项工作得到了Jane Coffin Childs和美国癌症学会博士后奖学金、Sidney Kimmel研究学者对S.B.的资助以及美国国立卫生研究院和人类前沿科学项目对a.W.M.的资助。

 这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，根据《美国法典》第18卷第1734节，本篇文章必须标记为“广告”，以表明这一事实。

脚注

电子邮件gro.crchf@sniggibs公司; 传真：（206）667-6526。

文章和出版物位于http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.934801。

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文章来自基因与发育由提供冷泉港实验室出版社