膜封闭剂泊洛沙姆P188对肌营养不良小鼠异丙肾上腺素诱导的心肌病的保护作用

摘要

背景

由于心肌病是杜氏肌营养不良症（DMD）患者发病率和死亡率不断增加的原因，在小鼠身上进行临床前药物试验是研究DMD心肌病潜在治疗途径的重要初始步骤[1]. 然而，先前对mdx小鼠的研究表明，心肌病发展缓慢，仅在9个月大左右通过无创超声心动图检查才明显可见[2，三]. 从心脏角度来看，Mdx小鼠在这个年龄段是无症状的，并且在其一生中没有出现心力衰竭的迹象。这种轻微的表型使得临床前药物研究很难测量重要的心脏终点，并且需要6到12个月的治疗时间，这使得这些试验非常昂贵、耗时且繁琐[4].

为了加速这种表型，许多研究人员使用有创性心脏应激模型的短期治疗疗程，包括用多巴酚丁胺或异丙肾上腺素输注心脏插管和主动脉结扎[5-10]. 这些研究证实，由于心肌中缺乏肌营养不良蛋白，未经治疗的mdx小鼠不能正常耐受心脏应激。这种无法应对压力的现象被认为与肌营养不良蛋白丢失导致的膜不稳定有关。Yasuda等人（2005年）的实验表明，完整、孤立的肌营养不良蛋白缺乏心肌细胞降低了顺应性，增加了对拉伸介导的钙超载的敏感性，导致细胞挛缩和死亡[9].

改善膜稳定性是DMD潜在的治疗途径之一。泊洛沙姆188（P188）可稳定镰状细胞病患者的红细胞膜[11]. P188是一种非离子三嵌段共聚物，聚环氧乙烷₈₀-聚环氧丙烷₂₇-聚环氧乙烷₈₀被证明可以插入人工脂质单层并修复受损的生物膜。基于这些特性，Yasuda等人（2005年）使用开胸方案，在左心室中放置导管，研究了肌营养不良蛋白缺乏的mdx小鼠心脏中的P188。该模型表明，在多巴酚丁胺输注期间服用P188可预防急性心力衰竭的发生[9].

在本研究中，我们使用了P188的慢性间歇给药，以及持续、低剂量异丙肾上腺素心脏应激模型和无创性心脏功能评估。与野生型小鼠相比，Mdx小鼠仅能耐受显著降低的异丙肾上腺素浓度，并在4周内出现缩短分数下降和心肌纤维化增加。与未经治疗的mdx小鼠相比，用P188治疗可以防止异丙肾上腺素暴露期间缩短分数的降低。

目前对DMD心肌病的治疗是非特异性的，但P188直接靶向膜不稳定，这是肌营养不良蛋白缺陷细胞的主要病理缺陷之一。这些实验表明，长期间歇给药P188可能为Duchenne型肌营养不良症的心肌病提供潜在的直接治疗。

方法

结果

收缩功能

在基线、2周或4周时，对照BL10和对照mdx小鼠的缩短分数（SF）或射血分数（EF）没有显著差异。与菌株匹配的未经治疗的对照小鼠相比，暴露于异丙肾上腺素后2周（p<0.001）和4周（p=0.02）通过SF测定的BL10小鼠的收缩功能显著增加。与未经治疗的Mdx对照组相比，暴露于异丙肾上腺素的Mdx小鼠在2周时的SF显著增加（p=0.03）。（图​（图1）1)与未经治疗的、暴露于异丙肾上腺素的mdx小鼠相比，P188治疗在4周时显著改善了SF（p=0.007）。（图​（图2）2)2周时，P188治疗、异丙肾上腺素暴露的mdx小鼠与异丙肾上腺素接触的mdx鼠相比，EF的独立二维测量值显著增加（p<0.001）。4周时，EF符合SF测量值，并且在对照组和异丙肾上腺素治疗的mdx小鼠之间没有差异。

在单独的窗口中打开

图1

治疗2周后，与未经治疗的mdx对照组相比，P188治疗组、异丙肾上腺素暴露组和异丙肾上腺素接触组mdx小鼠的缩短百分比（%SF）显著增加.

在单独的窗口中打开

图2

经过4周的治疗后，P188治疗的、接触异丙肾上腺素的mdx小鼠与接触异丙二醇的mdx鼠和未经治疗的对照组相比，缩短百分比（%SF）显著增加.

心脏胶原蛋白含量百分比

BL10心脏中未发现明显的胶原含量/纤维化。仅暴露于异丙肾上腺素2周的Mdx心脏显示1.4±1.1%的纤维化，暴露于异丙基肾上腺素和P188治疗的心脏显示1.3±1.1%纤维化。在异丙肾上腺素暴露4周后，mdx心脏显示3.0±2.8%，而那些暴露于异丙肾上腺素并接受P188治疗的心脏显示2.9±2.1%纤维化（图​（图3）。三). 4周后，Mdx对照小鼠表现为1.1±0.4%，因此，暴露和治疗4周的Mdx组的心脏纤维化显著增加（p<0.05）。

在单独的窗口中打开

图3

用苦味酸红染色的心脏代表性横断组织切片显示，未经治疗的mdx心脏的纤维化程度最低（平均1%胶原蛋白；A组），而暴露于0.5 mg/kg/天异丙肾上腺素4周的mdx心的纤维化程度显著增加（平均3.0%胶原蛋白；B组）以及暴露于0.5 mg/kg/天异丙肾上腺素并用P188治疗4周的mdx心脏（平均2.9%胶原蛋白；C组）染色与老年mdx小鼠的斑片状纤维化模式一致

讨论

这项研究表明，在肌营养不良蛋白缺乏型心脏的皮下低剂量异丙肾上腺素应激模型中，慢性、间歇性P188可能在4周内有效保护心脏功能。与未经治疗的异丙肾上腺素暴露的Mdx小鼠相比，在暴露于异丙肾上腺素期间用P188治疗的Mdx小鼠能够维持增加的收缩功能（46±6 vs.35±6 SF%；p<0.01），这表明慢性、间歇性腹膜内注射P188可以稳定心肌细胞膜体内这些结果也为2个月大的mdx小鼠在4周内发生轻度心肌病和心脏纤维化提供了模型，并允许更快地筛选针对心脏功能和纤维化的潜在药物。

我们还发现，mdx小鼠对体内β受体激动剂给药引起的心脏应激。与BL10对照小鼠相比，所有mdx小鼠在30、15、10、5和1 mg/kg/天的剂量下24小时内死亡，并且只能耐受异丙肾上腺素剂量减少6倍（0.5 mg/kg/日）。即使在该剂量下，mdx小鼠在24小时时的缩短率为42±6%，在2周时降至38±5%，在4周时降至35±6%。P188治疗在较高水平的异丙肾上腺素下并没有提高生存率。这一数据表明，P188对慢性腹腔注射的疗效有限，无法稳定心肌细胞以及急性静脉注射。

之前在肌营养不良蛋白缺乏动物模型中研究过P188，并证明其可以预防多巴酚丁胺诱导的mdx小鼠心脏应激后的急性心力衰竭。这些研究采用急性静脉给药[9]. 使用慢性间歇给药，我们的非侵入性体内皮下注射异丙肾上腺素的心脏应激模型和超声心动图心脏评估显示出类似的结果。Yasuda等人（2005年）得出结论，P188的主要作用是急性恢复心肌细胞顺应性并改善舒张末期容积。虽然我们没有测量这些参数，但与BL10小鼠相同的收缩功能增强表明其耐受心脏应激的能力增强，并且可能与心肌细胞顺应性的改善有关。P188还可以通过稳定红细胞膜降低血液粘度；减少红细胞粘附；改善微血管血流[19，20]. 这些变化可以降低有效后负荷，并且是可以改善P188治疗小鼠的心率和心脏收缩功能的潜在生理机制。

Townsend等人（2010年）最近报告称，在金毛猎犬肌营养不良症（GRMD）犬体内慢性输注P188（60 mg/kg/h）8周后，心脏纤维化显著降低，心室扩张得以阻止[21]. 我们的研究没有显示P188治疗小鼠的心脏纤维化显著降低（3.0%对2.9%）。这可能与我们的单一每日给药方案有关，该方案提供了足够的P188，以部分稳定某些心肌细胞并改善心脏功能，但不足以防止显著的心肌细胞丢失和纤维化。GRMD模型还显示出一种更严重的自然发生的心肌病，即使在异丙肾上腺素暴露的情况下，也很难在小鼠模型中复制。因此，与mdx小鼠相比，GRMD模型中的纤维化信号通路增加，P188治疗显示出更显著的调节作用。mdx小鼠对异丙肾上腺素应激非常敏感，因此我们无法测试更高剂量的P188抗纤维化效果，因为更高剂量可能会增加纤维化，而不会导致死亡。

我们的研究也没有显示心室扩张，而是显示左心室内径减小。这是继发于左心室壁厚度和重量增加，P188治疗组和未治疗组小鼠的心脏负荷增加。先前的研究表明mdx小鼠存在扩张型和非扩张型心肌病[2，三]. 在存在异丙肾上腺素的情况下，未经治疗的mdx小鼠能够表现出与BL10小鼠相似的心肌肥大，这可能与3个月大的小鼠中仍然存在的代偿机制有关，代偿机制随着年龄的增长而减少。

我们意外地发现P188治疗的mdx心脏中Evan蓝染色（EBD）阳性纤维显著增加。Quilan等人（2006年）还发现，对运动mdx小鼠骨骼肌的研究也出现了类似的意外结果，即P188处理的股直肌中EBD穿透率相同或增加[22]. 然而，尽管我们发现EBD阳性纤维增多，但这些心脏与未经治疗的心脏相比，收缩功能增强。基于这些发现，我们认为P188可以稳定轻度受损的细胞，尤其是在较低的有效剂量下。这些细胞保持功能，但在组织学上呈EBD阳性。此外，P188有可能促进EBD进入细胞而不损害功能。

我们发现，与对照组相比，基线时mdx小鼠的血压显著降低。此前曾在9个月大的mdx小鼠中报告过这种情况[三]. Townsend等人（2010年）的研究也表明，P188治疗对血压水平没有影响[21]. 目前尚不清楚血压下降的机制，可能与心脏或血管功能障碍有关，或两者兼而有之[23]. 先前的研究表明，使用P188治疗后，心肌可以产生更多的力[9，21]. 这项研究还表明P188治疗后心脏功能得到改善。然而，我们没有看到血压的相应影响。因此，可能仍有一种未确定的血管成分可以降低小鼠的收缩压，但在这种心脏功能改善的水平上，这种血管成分没有得到补偿。这支持了先前的文献，即mdx小鼠具有异常的血管内皮反应和血压调节[24，25].

这项研究没有显示使用体外测量骨骼肌比力的改善。Ng等人（2008年）发现，肌肉沐浴液中添加P188可以减少孤立的整个腰肌的力量不足[26]. 先前的研究也表明，P188恢复了对溶液中分离心肌细胞的依从性，但这些研究使用了急性给予P188。当在P188洗脱期后使用心肌细胞时，性能恢复到未经处理的动物[9，21]. 我们没有测量P188血清水平，也无法估计接触的峰值水平。虽然在心脏功能方面有益处，但在本研究中，由于慢性间歇给药方案，骨骼肌功能或心脏纤维化没有明显改善。因此，越来越多的证据表明，P188在心肌和骨骼肌急性给药期间最有效。

结论

本研究报告了重要的临床前数据，即对皮下注射异丙肾上腺素的mdx小鼠慢性腹腔注射P188可以潜在地改善心脏收缩功能。先前的研究支持P188在应激性肌营养不良蛋白缺乏动物模型中的急性治疗作用[9，21]. 这些结果支持对DMD患者每日P188治疗的进一步研究。P188还可以预防急性应激时的心脏损伤，包括骨科手术、呼吸衰竭和持续静脉输注失代偿性心力衰竭。随着杜氏肌营养不良骨骼肌病理学治疗的不断进步，同样重要的是开发心肌疗法，以使杜氏肌疾病患者不会越来越多地死于心力衰竭[27]. 基于这些发现，P188急性和慢性治疗可能为Duchenne肌营养不良患者提供益处，并鼓励进一步研究。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

CFS参与了研究构思和设计、数据采集、数据分析和解释，并起草了手稿。ADG负责数据采集和数据分析/解释。QY负责数据采集和数据分析/解释。AS负责数据采集和数据分析/解释。JHV负责数据采集和数据分析/解释。EPH负责研究概念和设计，并起草手稿。KN负责研究概念和设计、数据分析/解释并起草手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。

发布前历史记录

本论文的出版前历史可从以下网址获取：

http://www.biomedcentral.com/1471-2261/11/20/prepub

补充材料

参考文献