中的细微变化铂族剂量决定癌症易感性

摘要

历史上，癌症的易感性被归因于遗传基因的改变。三十年前，癌症遗传学的先驱阿尔弗雷德·克努森提出了一个开创性的肿瘤发生模型，表明癌症的生长是由单个TSG的两个基因改变引起的^1,5,6Knudson设想肿瘤抑制是一种隐性特征，即出生时出现的失活突变伴随着肿瘤的第二次体细胞丢失。由于这一富有远见的工作模式，我们发现了一些经历双等位基因突变或截断点突变的TSG¹.

在小鼠模型中，在没有杂合性丢失（LOH）的情况下，主要TSG的单等位基因丢失足以触发肿瘤发生，从而完善了努森假说，引入了单倍体不足和复合单倍体充足的概念^5,7–9.

我们和其他人之前已经证明铂族（编码10号染色体上缺失的蛋白磷酸酶和紧张素同源物）是真正的单倍性TSG^10–12，而随后的研究表明，进一步降低Pten剂量到杂合性以下会加速侵袭性癌的进展².

随着功能基因组学的出现，一般人群中经常检测到的TSG表达水平的细微变化被认为决定了癌症的易感性^三然而，该假设缺乏确凿的实验证据。

在这里，我们通过生成和表征铂族^{hy（希）/+}小鼠模型中铂族表达足以促进小鼠的癌症易感性。

要降低铂族在纯合性以下，我们针对的是铂族用新霉素(新)盒在巨细胞病毒（CMV）启动子的控制下，导致转录干扰（如^{参考文献。13}和¹⁴;补充图1a).铂族^{hy（希）/+}小鼠与铂族^+/−小鼠产生Pten表达水平下降的低形态小鼠队列(铂族^重量>铂族^{hy（希）/+}>铂族^+/−>铂族^氢/−). 为了保持恒定的129/C57BL/6混合遗传背景，我们杂交铂族^{hy（希）/+}带有铂族^+/−在分析之前，对小鼠进行八代或更多代的研究。正如预期，铂族^{hy（希）/+}小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的Pten水平低于铂族^重量和以上铂族^+/−老鼠(补充图1b; 在中量化补充图1c). 分析铂族通过定量RT-PCR在MEFs中的基因表达也显示，患有铂族^{hy（希）/+}单元格(补充图1d).

我们首先评估了铂族低形态系列小鼠。减少铂族小鼠的剂量导致存活率下降(图1a–c). 平均生存期为12±1.8个月（平均±s.d.）铂族^+/−小鼠和8.5±1.48个月铂族^氢/−老鼠。意外地，铂族^{hy（希）/+}小鼠的存活率也显著下降(图1a–c). 类似铂族^+/−突变体¹⁵,铂族^{hy（希）/+}小鼠有自身免疫性疾病。铂族^{hy（希）/+}小鼠出现淋巴结病和脾肿大(补充图2a–c); 然而，这种自身免疫性疾病的发病在Pten延迟^{hy（希）/+}老鼠(补充图2a)这解释了铂族^+/−和铂族^{hy（希）/+}人口。类似于铂族^+/−老鼠¹⁵脾脏和淋巴结的组织学铂族^{hy（希）/+}小鼠出现自身免疫性淋巴结病(补充图2d)和多器官炎症浸润(补充图2e). 可与铂族^+/−老鼠¹⁵,铂族^{hy（希）/+}男性出现较轻的自身免疫性疾病，这解释了他们与女性相比生存率的差异铂族^{hy（希）/+}小鼠（比较图1b和1c).

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图1

Pten剂量的微小减少决定了铂族^{hy（希）/+}并引发乳腺肿瘤发生。(一–c（c）)一般人群总体生存率的Kaplan-Meier图(一)在男性体内(b条)和女性(c（c）)人口。hy/+，老鼠有铂族低形态和野生型等位基因；hy/−，小鼠有铂族低形态和空等位基因；+/-，老鼠有铂族wt和空等位基因。OS，总体生存率；n个，所分析的小鼠数量；P（P），统计显著性。(d日)女性群体中乳腺肿瘤小鼠的百分比（按年龄）；n个，分析的动物数量；P（P），统计显著性。插图是一个典型的乳腺肿瘤图像铂族^{hy（希）/+}老鼠。(e（电子）)顶部，H&E染色（×20）铂族^重量正常乳腺和铂族^{hy（希）/+}和铂族^+/−乳腺肿瘤。底部、平均大小和Ki-67增殖指数铂族^重量乳腺和铂族^{hy（希）/+}和铂族^+/−乳腺肿瘤。(（f）)Pten和pAkt的免疫组织化学分析铂族^{hy（希）/+}和铂族^+/−乳腺肿瘤（分析每个基因型的四个肿瘤）。中的插图铂族^{hy（希）/+}显示对照乳腺中Pten和pAkt染色的代表性图像（×40）。(克)Pten和pAkt蛋白水平的蛋白质印迹分析铂族^重量,铂族^{hy（希）/+}和铂族^+/−显示Pten蛋白和相应pAkt水平存在的乳腺肿瘤。底部，乳腺肿瘤中Pten蛋白水平的定量铂族^重量,铂族^{hy（希）/+}和铂族^+/−老鼠。三个独立实验的误差条。星号表示从小鼠组织中提取蛋白质时观察到的非特异性带。印迹左边的数字代表以kDa表示的分子量标记；低于Pten印迹的蛋白表明密度定量蛋白质水平已归一化为β-肌动蛋白。裁剪图像的呈现符合Nature Publishing Group的政策。

尤其是，铂族^希/+突变小鼠对癌症的敏感性增加。特别地，铂族^{hy（希）/+}女性对上皮癌的易感性增加(表1)癌症发病较晚铂族^+/−女性(图1d). 值得注意的是，67%的铂族^{hy（希）/+}14个月后的女性发生乳腺癌，28%的女性子宫内膜不典型复合体增生(补充图3a和表1)通常被认为是子宫内膜肿瘤的前兆。肿瘤大小和增殖随着铂剂量的减少而增加(图1e). 男性和女性铂族^{hy（希）/+}小鼠还发生了低外显率的多灶原发性肺癌和肠息肉，发病率和发病率相当(补充图3b和表1). 此外铂族^{hy（希）/+}乳腺肿瘤表现为分化型浸润性导管癌，而铂族^+/−肿瘤分化程度较低，间质成分突出(图1e，顶部）。免疫组织化学分析(图1f)以及Pten蛋白印迹检测(图1g)，确认两者铂族^{hy（希）/+}和铂族^+/−肿瘤根据其基因型保留了Pten蛋白的表达，并且随着Pten水平的降低，Akt蛋白的活化增加（如Ser473的磷酸化所示），这强烈表明这些肿瘤不是由表达较低TSG水平的细胞亚群引起的。此外，磷酸化Akt（pAkt）在铂族^{hy（希）/+}小鼠间接暗示铂族这些肿瘤具有功能活性，缺乏突变或杂合性缺失（LOH），突变分析证实了这一点（0/4个肿瘤的9个外显子中有任何一个突变铂族)通过DNA印迹进行LOH分析(补充图4). 总之，这些数据表明，在长时间延迟后，铂族^{hy（希）/+}在没有检测到的情况下，小鼠发生乳腺肿瘤的频率很高铂族突变或LOH。虽然甲基化可能发生在肿瘤的一个子集中，但在我们的模型中不太可能发生这种情况，因为通过蛋白印迹和免疫组织化学检测到Pten蛋白在肿瘤中的高水平表达铂族^{hy（希）/+}肿瘤。

接下来，我们检查了铂类药物剂量的微小减少是否会对癌前乳腺组织产生功能性和细胞自主性影响。首先，我们分析了2个月龄处女对照组和铂族^{hy（希）/+}雌性小鼠，我们观察到Ki-67染色在铂族^{hy（希）/+}乳腺(图2a). 特别是肝脏、小肠、胰腺、肾上腺和前列腺组织（数据未显示^{参考文献2})在增殖指数方面没有任何差异(图2a，底部）。接下来，我们分析了癌前乳腺中Pten和磷酸化Akt（pAkt-Ser473）的水平，并证实了Pten表达的保留(补充图5a、b)，pAkt水平略有升高(补充图5a).

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图2

的微妙变化铂族基因表达以组织特异的方式促进过度增殖。(一)2个月大婴儿乳腺组织的代表性图像（上图）和组织中Ki-67染色的定量（下图）铂族^重量和铂族^{hy（希）/+}同窝老鼠。P（P），统计显著性；误差条，s.d(b条)增长曲线分析铂族^重量和铂族^{hy（希）/+}小鼠乳腺上皮细胞。误差线，s.d(c（c）)细胞活力分析（在指定的时间点）铂族^重量和铂族^希/+紫外线照射后的小鼠乳腺上皮细胞（60 J/m²). (d日)Pten、pAkt和Cyclin D1蛋白水平的蛋白质印迹分析铂族^重量和铂族^{hy（希）/+}MMEC。星号表示存在残余的Pten信号，因为在pAkt印迹之前未剥离膜。印迹右边的数字代表以kDa表示的分子量标记；印迹下方的数字表示Pten（归一化为β-actin）和pAkt（归一化为总Akt）的密度定量蛋白质水平。裁剪图像的呈现符合Nature Publishing Group的政策。

最后，我们评估了在体外乳腺上皮细胞（MMEC）的存活和增殖优势铂族^{hy（希）/+}小鼠以细胞自主方式发生。分析铂族^重量和铂族^{hy（希）/+}MMEC显示铂族^{hy（希）/+}MMEC公司(图2b)紫外线照射后细胞抗凋亡能力增强(图2c). 蛋白质印迹分析证实铂族^{hy（希）/+}MMEC降低了Pten水平，增加了pAkt和cyclin D1水平(图2d).

值得注意的是，我们通过短干扰（si）RNA介导的Pten下调验证了我们在3个月龄纯C57BL/6基因背景的同窝小鼠MMEC中的发现(补充图6). 使用这种方法，我们减少了铂族表达量约为对照细胞的80%。增殖分析证实，Pten水平的轻微降低可促进C57BL/6 MMEC的过度增殖(补充图6).

因此，我们的数据显示铂族可以影响细胞增殖，表明小鼠乳腺是对这种变异最敏感的组织。这个在体外分析也支持乳腺癌表型的细胞自主起源。这些发现总结于图3乳腺组织中Pten水平的轻微下降与不同组织中观察到的癌症发病率平行。

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图3

Pten剂量（显示正常水平的百分比）、Akt信号强度和所示表型的相应观察发病率之间的相关性的图形表示。

然后我们使用基因表达谱分析铂族^{hy（希）/+}MEF评估铂族会影响肿瘤发生的途径。通过质量控制过滤器的基因使用Bioconductor RankProd软件包根据其差异表达按信噪比进行排名¹⁶为了确定相关的通路或基因集，根据基因集富集分析（GSEA）分析排名基因。我们发现了一个显著的上调(P（P）<0.01），其中三个涉及细胞周期调控(图4a). 这些基因包括细胞周期控制和染色体稳定性基因，如编码细胞周期蛋白B2、细胞周期蛋白D1、Mcm4和Bub1的基因。我们在中验证了这些数据铂族^{hy（希）/+}定量RT-PCR法测定MMEC(图4b和数据未显示）。分层铂族^{hy（希）/+}上调基因(P（P）根据基因本体生物过程（GO-BP）数据库的分类，发现细胞增殖和M期调节显著(P（P）<0.01）上调铂族^{hy（希）/+}MEF（参见图4c对于GO类别，由P（P）与全基因组背景相比，每个GO的值和倍数富集因子铂族^{hy（希）/+}与相比铂族^+/+MEF）。这些基因的上调可能有助于Pten水平的细微下降所诱导的肿瘤发生，正如在铂族^{hy（希）/+}MMEC和小鼠。该分析表明铂族MMEC中的表达促使编码细胞增殖相关蛋白的基因上调，如细胞周期蛋白B2。此外，一些与有丝分裂染色体相关的转录物也被上调，包括着丝粒蛋白Cenpe和Bub1以及凝集素复合物转录物Smc2l1，它们在这些细胞中增加循环期间促进染色体分离(图4b). 因此，Pten水平的小幅度降低可以改变肿瘤形成和进展所必需的途径的基因表达谱，从而有助于癌症的易感性。

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图4

基因表达谱铂族^希/+MEF、MMEC和PTEN水平降低的人类乳腺癌样本。(一)Pten水平的轻微降低显著调节了细胞周期的三个基因表达特征（GNF2_CSK1B、GNF2_CDC2和GNF2_CDC 20）铂族^{hy（希）/+}MEF公司。基因是根据它们在铂族^{hy（希）/+}中小企业和控制。谱系特异性基因集中的基因用竖线标记，富集分数以绿色显示。(b条)定量RT-PCR分析铂族^重量和铂族^{hy（希）/+}指示基因的MMEC。P（P），统计显著性。四只独立小鼠的误差条，s.e.m.（每个MMEC培养物和小鼠两到四个样品）。(c（c）)基因数据集的分层在铂族^{hy（希）/+}根据GO-BP的MEF。

尽管PTEN蛋白水平经常下降，但PTEN在乳腺癌患者的基因组水平上很少丢失或突变^17,18，我们检查了人类乳腺肿瘤中是否也存在类似的基因表达特征¹⁹侵袭性乳腺癌的比例很高(n个=40），PTEN表达在mRNA水平显著下调(n个= 7) (补充图7a). 与正常乳腺组织中PTEN的平均表达水平相比，分析的20%样本中PTEN mRNA水平高于正常水平的65%(补充图7a、b). PTEN mRNA水平轻微下降的个体的蛋白质水平与正常组织（即基质或正常乳腺上皮）相似(补充图7c). 此外，在PTEN轻微下降的患者中，我们模型中上调的所有七个基因组都显著丰富（参见补充图7a基因表达谱和补充图8对于每个GSEA图谱），表明这种富集的特征也存在于人类乳腺癌活检中(补充图7a、b). 总之，我们的数据表明，Pten的轻微减少会导致乳腺上皮的明显生物学结果，尽管，体内，非细胞自主效应也可能有助于此的“全身”性质铂族突变体系列。值得注意的是，尽管PTEN剂量的减少与人类前列腺癌的进展密切相关²,铂族^{hy（希）/+}雄性小鼠没有发生前列腺上皮内瘤变。这可能是由于存在更高的磷脂酰肌醇-3-羟基激酶（PI3K）信号阈值，因为特定组织可能对该信号通路的输出具有不同的敏感性，并且对引起小鼠肿瘤的额外遗传事件的需求（例如转录因子的ETS家族）具有不同的敏感性²⁰.

我们的发现得出了一些有意义的结论。例如，我们发现TSG的微小减少可以促进癌症的发生，而不需要在该位点上进行额外的基因打击。虽然我们不能排除其他致癌和抑癌基因座的额外基因点击，但我们已经证明了铂族以下疾病引起的癌症中的LOH或突变铂族^{hy（希）/+}老鼠。有人提出，特定TSG基因表达的细微变化可能会促进癌症易感性^三然而，据我们所知，这是迄今为止第一个支持这一假设的实验证据。此外，据我们所知，从未有报道称，在野生型TSG等位基因LOH缺失的情况下，由TSG的轻微下调引发的肿瘤可以进展^三.

我们在这里展示铂族^{hy（希）/+}MEF和癌前组织铂族基因表达可以触发增殖，与促增殖信号的激活直接相关。这表明，表观遗传和环境压力导致TSG的轻微减少，而不改变基因的结构，可能会促进肿瘤抑制因子“准不足”，并增加对癌症的易感性(图5a).

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图5

TSG水平轻微降低对肿瘤发生的影响。(一)癌症易感性的“无命中”模型。矩形绿色框表示给定TSG的功能等位基因。矩形的红色方框代表一个非功能性等位基因，被突变或缺失等位基因灭活。矩形的绿色、黄色和红色方框代表TSG的一个等位基因，其表达降低到正常水平以下。黑色矩形代表基因命中。请注意，所示模型并不排除其他基因座上存在额外点击。(b条)癌症发生和发展的连续模型（左）对-á-对跳跃模型（右）。注意，在连续体模型中，即使TSG剂量的微小减少也可以以组织特异性的方式启动肿瘤发生。表型1、2和3表明，随着TSG剂量的减少，肿瘤表型会以组织特异性的方式发生变化，从而增加疾病的发病率和侵袭性。在跳跃模型中，癌症是由逐步遗传突变驱动的等位基因丢失引起的。

在此基础上，我们提出了TSG丢失驱动肿瘤发生的新模型(图5b，左）。我们的模型重新审视并进一步完善了经典的跳跃模型（即通过逐步遗传突变驱动的等位基因丢失而导致肿瘤发生；图5b，右）。我们提出了一个连续工作模型，其中TSG表达的细微变化可能对肿瘤易感性和进展产生深远影响。因此，需要高度定量的组合方法来整合基因组和蛋白质组信息，以及高通量的突变分析方法，以精确确定任何给定组织中的癌症易感性，并确定肿瘤进展的详细机制；这项工作对癌症化学预防和治疗的靶向性和个体化方法的发展具有重要意义。

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脚注

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