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癌症研究。作者手稿；PMC 2011年5月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
癌症研究，2010年11月15日；70(22): 9413–9422.
2010年11月2日在线发布。 数字对象标识：10.1158/0008-5472.CAN-10-1454
预防性维修识别码：项目经理3079905
EMSID:英国MS32193
PMID：21045155

通过Src和FAK抑制整合素信号传导对癌细胞运动影响的定量体内成像；对E-cadherin动力学的影响

玛尔塔·卡内尔,一 阿兰·塞雷尔斯,一 德里克·米勒,b条 保罗·汀普森,b条 布莱恩·塞雷尔斯,一 玛格丽特·弗雷姆,一和瓦莱丽·布伦顿a、，1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

大多数癌症相关死亡是由于转移性疾病的发展，临床开发中的几种新的分子靶向药物具有预防疾病进展的潜力。然而，仍然很难在临床环境中评估抗转移药物的疗效，进一步了解这些药物如何在转移级联的不同阶段发挥作用对指导其临床应用很重要。我们使用光学窗口室结合光漂白、光激活和光开关来定量测量a）通过跟踪整个肿瘤中的小细胞组来测量肿瘤细胞的运动和增殖，以及b）E-cadherin分子动力学体内通过抑制黏着斑激酶（FAK）和Src干扰整合素信号。我们发现，在复杂的3D肿瘤环境中，抑制Src和FAK可抑制E-cadherin依赖的集合细胞运动，并调节细胞间粘附强度和内吞作用在体外这证明了整合素信号在调节E-cadherin内化中的一种新作用，该内化与调节癌细胞的集体运动有关。这项工作突出了荧光、直接、，体内影像学方法在化疗药物临床前评估中的应用，并表明抑制Src/FAK信号轴可能提供一种策略，通过去调节E-cadherin介导的细胞间粘附来防止肿瘤细胞扩散。

关键词：Src、FAK、集体运动、光开关、E-cadherin

介绍

在它们的生理环境中，细胞与周围的细胞外基质（ECM）和邻近的细胞接触。虽然细胞-基质粘附主要基于整合素，但细胞-细胞连接由AJ、紧密连接和桥粒介导。基于钙粘蛋白的AJ提供了细胞与细胞接触的初始手段，在上皮极性的发育和维持过程中起着关键作用(1,2). 此外，有大量证据表明E-cadherin是一种重要的肿瘤和/或侵袭抑制因子(三-5). 肿瘤细胞采用多种策略移动体内; 作为单个细胞或作为保持细胞间联系的凝聚力细胞群(6). 然而，许多肿瘤可以根据外界刺激改变其运动模式，一些证据支持整合素介导的细胞-内皮细胞相互作用和E-钙粘蛋白介导的胞间连接之间的相互作用，这可能是肿瘤细胞可塑性的关键(7,8). 尽管所涉及的机制尚不清楚，但Rho GTP酶的整合素依赖性调节和在两种粘附类型上都被束缚的肌动蛋白细胞骨架可能发挥重要作用(9). 此外，两种非受体酪氨酸激酶Src和焦黏附激酶（FAK）是整合素依赖性基质黏附的关键调节因子，与AJ的控制有关。当整合素参与时，FAK和Src酪氨酸激酶在整合素介导的粘连处的特定酪氨酸残基上自动磷酸化。Y397上的FAK自动磷酸化为Src的SH2结构域创建了一个高亲和力结合位点，导致FAK在额外酪氨酸残基上的Src依赖性磷酸化。这些作为蛋白质相互作用基序，将FAK-Src复合物与许多下游信号通路联系起来(10). Src活性增加与E-钙粘蛋白依赖性AJ的破坏有关，这与整合素信号和FAK磷酸化有关，表明Src/FAK信号轴可能在整合素依赖性粘附和E-钙黏蛋白依赖性粘附之间的串扰中起重要作用(7).

大多数癌症相关死亡是由于转移性疾病的发展，临床开发中的几种新的分子靶向药物（包括针对Src和FAK的药物）有可能阻止疾病进展(11). 然而，仍然很难在临床环境中评估抗转移药物的疗效，进一步了解这些药物如何在转移级联的不同阶段发挥作用对指导其临床应用很重要。由于肿瘤微环境在疾病进展中起着关键作用(12)越来越明显的是，使用适当的动物模型对于确定这些药物的活性至关重要。为了使细胞转移到远处，它们必须经历一些表型变化，包括细胞基质和细胞间粘附、迁移和侵袭能力的变化，但这些都很难监测体内在这里，我们描述了光学窗口室与光漂白、光活化和光切换相结合的用途，以定量测量肿瘤块内鳞状细胞癌细胞的集体肿瘤细胞运动、增殖和蛋白质动力学体内我们证明抑制Src/FAK信号轴可以阻止肿瘤细胞的集体运动在体外和体内，并确定该途径在调节E-cadherin内化、细胞间粘附强度和调节β1-整合素下游E-cadherin动力学中的新作用。综合这些数据，突出了荧光的益处体内成像方法以及光学窗口室在潜在化疗药物临床前评估中的应用，并表明靶向Src和FAK的小分子抑制剂的抗侵袭性可能部分通过其调节细胞间粘附的能力介导。

材料和方法

细胞培养

将GFP-E-钙粘蛋白转染A431细胞（LGC Promochem）(13)，pDendra2（Evrogen），核光敏绿樱桃（nGPA公司C）(14)或Y527F Src-GFP(15)使用Amaxa核转染系统（Amaxa GmbH）。稳定表达抗β1-整合素siRNA的细胞及其相应的对照细胞是Erik Sahai的恩赐(16). 对于siRNA实验，使用Amaxa核转染系统将50 nM E-cadherin或FAK siRNA smartpool或siCONTROL pool 1（Dharmacon）转染细胞。采用以下处理：β1阻断抗体，克隆mAb13(17)2μg/ml，1-3小时；dynasore（Sigma）80μM，0.5-2小时；PF-562271（辉瑞），250 nM，1-72小时；达沙替尼（百时美施贵宝）200 nM，1-72小时。

胶原蛋白侵入分析

细胞接种在含有鼠尾I型胶原（罗氏）的跨孔插入物（康宁）的底部。然后将Transwell插入物置于无血清培养基中，并将添加有10%FCS和10 ng/ml EGF的培养基置于凝胶顶部。5天后，用Calcein AM（分子探针）对细胞进行染色。使用奥林巴斯FV1000共焦显微镜，每隔10μm对凝胶进行水平z切片。使用“图像J”软件（NIH）确定每个图像中的正像素数。在所有截面的值总和上对单个截面获得的值进行标准化，然后表示为控制单元值的百分比。对于每个实验，样品一式三份，每个样品至少取四个z系列。用于显示目的的投影图像也使用“图像J”创建。

基于置换的分离分析

如前所述，测定了脱氨酶处理单层膜机械应力后的粘附强度定量(18).

光学窗口腔室的外科植入

在麻醉下将光学窗口室植入CD-1裸鼠体内。所有动物工作均按照英国内政部指南进行。光学窗口室采用铝合金定制(19). 为了安装窗背皮肤，将其缝合到c形夹模板上。取下一圈皮肤，用2mm活检冲子打出螺丝孔。然后，将窗室的框架安装到蒙皮的两侧，并用螺丝螺母固定；调整其松紧度以确保血管不被堵塞。然后将窗户缝合到皮肤上，取下c形夹钳。一小块肿瘤被放在窗户中央，并用盖玻片密封。在成像前10天，允许肿瘤在窗口下生长，此时有广泛的血管重建(图S1A、B，电影S1）。有关光学窗口室的更多详细信息，请参见补充方法.

免疫印迹分析

如前所述进行免疫印迹分析(20). 使用的主要抗体为抗GFP（Abcam）、抗E-cadherin、抗FAK（Becton Dickinson Transduction Laboratories）、抗pY397 FAK、抗pY861 FAK（Biosource）、抗pY416 Src、抗Src（Cell Signaling）、β1-整合素（Chemicon）和抗γ-微管蛋白（Sigma），所有抗体的稀释度均为1:1000。

FRAP分析

对于在体外测量细胞保持在37°C的温度控制室中，而动物在加热阶段保持在37℃体内测量值。实验使用奥林巴斯FV1000共焦显微镜和SIM扫描仪进行。对于光漂白，使用了以下设置：像素停留时间4μs/px，像素分辨率512×512，5%488nm激光功率（30%用于体内)488 nm激光功率，针孔250μm，60倍油1.35 N.A.物镜（40倍水0.8 N.A体内)和3倍变焦。使用50%（40%体内)405 nm激光功率，20μs/像素（对于体内)驻留时间和1帧（3帧用于体内)漂白时间。每5秒捕获75帧图像（100帧体内). 对于在体外实验中，大约有25个细胞在3个独立实验中成像体内实验对每种情况下的5只动物进行成像，每只动物拍摄6部电影。成像前30分钟，用PF-562271（33 mg/kg，0.5%甲基纤维素，p.o.灌胃）治疗小鼠。在Excel中平均来自漂白用感兴趣区域的荧光强度测量值，并用于绘制恢复/衰减曲线。将每个时间点的平均测量值导出到SigmaPlot（Systat Inc）中，用于指数曲线拟合。恢复半衰期（t1/2)按前面所述进行计算(21).

体内光开关

将表达Dendra2的肿瘤植入光学窗口室，并在光开关后0、6和24小时进行成像。所有图像均使用配备UMPLFLN 20×0.5 N.a.浸水物镜的Olympus FV1000共焦显微镜拍摄。使用以下设置实现了Dendra2的光开关：像素驻留时间40μs/px，28%405nm激光功率，5帧切换时间。从光切换当天开始，用PF-562271（33mg/kg在0.5%甲基纤维素中，通过灌胃BID口服）或达沙替尼（15mg/kg在80mM柠檬酸盐缓冲液中，通过灌胃qd口服）治疗小鼠。在对感兴趣的区域进行光开关后，获得了绿色和红色通道的z系列（每10μm一段）。使用ImageJ进行图像分析。使用最大z强度投影工具将每个z序列平坦成一个图像，进行阈值设置，并测量红色荧光通道所占的面积。随着时间的推移，该区域被绘制为迁移细胞所占面积的倍数增加。

E-钙粘蛋白的内吞作用

如前所述，对生物素化E-钙粘蛋白内吞进行量化(18).

更多实验细节见S1文本.

结果

FAK和Src调节A431集体细胞运动在体外和体内

我们之前已经证明A431细胞以集体方式入侵在体外这取决于E-钙粘蛋白依赖性AJ的存在(20). 用FAK抑制剂PF-562271或Src抑制剂达沙替尼处理细胞，可完全抑制细胞集体侵入胶原(图1A)在FAK激酶活性（通过Y397上的FAK自动磷酸化测定）和Src活性（通过在Y416上的Src自动磷酸化测量）分别受到抑制的浓度下(图1B). 用达沙替尼处理细胞也抑制了Y861上FAK的Src依赖性磷酸化(图1B). 实现肿瘤细胞运动的成像和量化体内用光开关探针Dendra2转染细胞，并在观察窗下建立肿瘤(图S1A)(22). 通过将Dendra2从绿色发光状态转换为红色发光状态，并在24小时内采集z切片，标记肿瘤细胞亚群(图1C)通过计算红色荧光面积的倍数增加来量化细胞运动(图1D). 在24小时内，载体治疗的动物体内肿瘤细胞广泛运动，达沙替尼和PF-562271治疗的动物中肿瘤细胞运动受到抑制(图1C、D). 在肿瘤边缘的细胞中也进行了类似的研究。虽然A431 Dendra2细胞随时间分散，但在我们的实验时间范围内，我们很少检测到任何细胞从原始肿瘤区域移向周围基质(图S2)因此，不能使用这种方法追踪A431细胞侵入周围基质的情况。

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PF-562271和达沙替尼抑制细胞集体运动在体外和体内. (A类)在PF-562271或达沙替尼存在或不存在的情况下，A431细胞侵入胶原凝胶。5天后，用钙黄绿素AM标记细胞，并每隔10μm观察一次。实验共进行了三次，并显示了通过凝胶在指定深度处的代表性z截面系列。比例尺：200μm。(B类)pY397 FAK和FAK在对照和PF-562271处理的细胞中的表达以及pY416 Src、Src、pY861 FAK和FAK在对照和达沙替尼处理的细胞中的表达的免疫印迹分析。(C)图片显示A431 Dendra2在光开关后的不同时间点控制未治疗小鼠或使用PF-562271或达沙替尼治疗的小鼠肿瘤中的表达细胞（红色）。比例尺：100μm。(D类)量化所示时间点红色荧光覆盖的区域。值是至少5个独立实验的平均值。误差条：s.e.m。

观察A431细胞行为时体内我们的结果表明细胞广泛运动，但不排除细胞增殖/存活增加对测量面积增加倍数的可能贡献。为了解决增殖和/或生存的作用，将核靶向光活化GFP融合到mCherry（nGPA公司C）(14). 肿瘤细胞亚群通过激活核靶向的可光活化GFP和在24小时内获得的共聚焦z序列来标记(图S3A). 光活化GFP标记细胞核的三维绘制和斑点检测(图S3B)用于量化每个时间点的核数，并计算核数的折叠变化(图S3C). 24小时内，细胞核数增加了1.2倍，在PF-562271治疗后保持不变。核数的增加被用于从图1D(图S3D). 因此，FAK激酶活性不影响A431细胞的增殖/存活体内此外，在本实验的时间尺度上，肿瘤细胞增殖的基础水平不足以解释光开关后测量面积的倍增。

E-cadherin调节A431细胞的集体运动在体外和体内

我们之前已经报道了细胞-细胞粘附位点E钙粘蛋白的缺失抑制A431细胞的集体侵袭在体外(20). 然而，E-cadherin的过度表达（增加2.3倍，图S4A)还抑制A431细胞侵入胶原蛋白(图2A)这表明E-cadherin表达和集体侵袭能力之间存在平衡。探讨E-cadherin过度表达是否影响肿瘤细胞运动体内，用Dendra2标记细胞，并在观察窗下建立肿瘤。与对照肿瘤相比，过度表达E-cadherin的细胞运动能力显著降低(图2B、C). 此外，对采集图像的视觉观察显示，A431细胞保持其集体迁移模式体内(图2D，（*）表示组内的单个细胞），表明这些细胞的运动也依赖于E-cadherin介导的细胞-细胞粘附体内.

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E-cadherin调节细胞集体运动在体外和体内. (A类)A431和A431 GFP-E-钙粘蛋白细胞侵入胶原凝胶。5天后，用钙黄绿素AM标记细胞，并每隔10μm观察一次。图中显示了穿过凝胶的指定深度处的代表性z截面系列。比例尺：200μm。在一系列三个代表性实验中，显示了80μm侵入的量化。数值为三口井的平均值。(B类)图像显示A431 Dendra2对照细胞或GFP-E-cadherin表达细胞在光开关后的不同时间点在肿瘤中表达（红色）。比例尺：100μm。(C)量化所示时间点红色荧光覆盖的区域。数值是来自至少5个独立实验的平均值。(A、 C类)误差线：s.e.m(D类)缩放的图像来自(B类)（左面板）和放大倍数更高的图像（中间和右面板）显示了细胞的集体运动，其中组内的单个细胞用（*）标记。比例尺：20μm（左侧和中间图像），10μm（右侧图像）。

FAK信号调节E-cadherin动力学体外和体内

我们最近已经证明，光漂白后荧光回收（FRAP）的使用使我们能够监测E-钙粘蛋白的动力学在体外和体内(21). E-cadherin分子回收率的变化与细胞迁移潜能的增加有关。例如，迁移细胞光漂白后GFP-E-钙粘蛋白的恢复速度慢于静止细胞，而抑制Src信号传导（减少细胞迁移）会增加GFP-E-cadherin的恢复速度(21). 在这里，我们开始确定在FAK激酶活性受到抑制后，是否也观察到E-cadherin动力学的变化。细胞-细胞粘附部位的GFP-E-钙粘蛋白受到光漂白(图3A、电影S2和S3）。汇总GFP-E-cadherin±PF-562271治疗的恢复动力学数据，并拟合成单指数升到最大值曲线(图S5A). R（右）2这些值反映了我们的数据与预测值的紧密拟合（Control/PF-562271，R2= 0.98). 用PF-562271处理细胞可缩短恢复的半衰期（t1/2)40%。为了证实这些作用对抑制FAK激酶活性是特异性的，我们还使用siRNA来敲低FAK的表达(图S4B). t的类似减少1/2在FAK敲除细胞中可见(图3B). 由于FAK是整合素信号的重要下游效应器，我们在表达β1整合素siRNA的细胞中进行了GFP-E-cadherin的FRAP，其中β1整合素蛋白表达受到特异性的抑制(图S4C)而且t也减少了1/2(图3B). 这些结果确定β1-整合素及其下游效应器FAK是E-cadherin动力学的关键调节器，并且抑制E-cadherin-dependent的集体运动与GFP-E-cadherins的恢复率增加相关。

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PF-562271改变E-cadherin动力学在体外和体内. (A类)未经处理（顶部面板）或用PF-562271（底部面板）处理的细胞中细胞-细胞连接处的GFP-E-钙粘蛋白的静态图像捕获了漂白前和漂白后的图像。比例尺：5μm。箭头表示漂白区域(B类)t吨1/2对照细胞或用PF-562271、FAK siRNA或β1-整合素阻断抗体处理的细胞中的GFP-E-钙粘蛋白。(C)未经治疗的肿瘤（顶部面板）或经PF-562271（底部面板）治疗的肿瘤细胞-细胞连接处的GFP-E-cadherin静态图像捕获了漂白前和漂白后的图像。箭头表示漂白区域(D类)t吨1/2GFP-E-钙粘蛋白在对照组或PF-562271治疗组小鼠肿瘤中的表达。(A、 C类)比例尺：5μm。(B、 D类)值是至少25个单元格的平均值。误差条：s.e.m。

接下来，我们询问E-钙粘蛋白动力学的变化是否也可以作为E-钙粘蛋白功能的读数体内在观察窗下建立表达GFP-E-钙粘蛋白的肿瘤，并在细胞-细胞粘附受光漂白的部位建立表达GFP-E-钙黏蛋白的肿瘤(图3C、电影S4和S5）。将载体或PF-562271治疗动物中GFP-E-钙粘蛋白的恢复动力学数据汇总，并拟合成单指数升到最大值曲线(图S5B). R（右）2这些值反映了我们的数据与预测值的紧密拟合（Control/PF-562271，R2= 0.97). 在GFP-E-钙粘蛋白的光漂白之前，用PF-562271治疗动物，可显著降低t1/2（对照组，38.3±3.2秒；PF-562271，20.4±2.5秒；图3D); 与观察到的情况类似在体外因此，PF-562271治疗后FAK激酶活性的抑制导致E-钙粘蛋白动力学改变体内与E-钙粘蛋白依赖性集体细胞运动减少相关。

FAK控制β1-整合素下游的E-cadherin内化和细胞间粘附强度

E-cadherin的过度表达和Src/FAK信号的抑制均导致侵袭抑制，Src/FAK调节E-cadherin动力学的能力在体外和体内，导致我们假设抑制Src/FAK信号轴可能通过调节E-cadherin来调节A431细胞的集体运动。以前有报道称，细胞间粘附位点的E-cadhern蛋白水平调节钙粘蛋白的粘附性(23)因此，我们假设这些部位E-cadherin表达增加可能通过增加细胞间粘附强度来抑制细胞运动。为了确定E-cadherin表达对细胞-细胞粘附强度的影响，我们用dispase处理融合培养物，导致完整单层中的细胞分离。然后，利用这些单层膜的机械应力引起的抗解聚性来测量细胞间接触的相对强度。E-cadherin的过度表达导致从细胞薄片上脱落的单个细胞数量减少，而siRNA对E-cadherin表达的抑制降低了粘附强度(图4A)表明E-cadherin在A431细胞-细胞粘附强度中起着关键作用。还观察到用PF-562271处理细胞或用siRNA敲除FAK可增加细胞间粘附强度(图4A). 此外，达沙替尼抑制Src激酶活性可增加细胞间粘附强度(图4A). 然而，这并不是通过抑制剂处理的细胞中E-cadherin表达增加来介导的(图S6).

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抑制β1-整合素下游FAK的Src-依赖性磷酸化，干扰E-cadherin内吞并加强细胞间连接。(A类)从分离酶处理的单层中分离出来的单个细胞数。值表示至少三个独立实验的平均值。(B类)在存在或不存在β1-整合素阻断抗体或达沙替尼的情况下，对照组和Y527F Src表达细胞中从分离酶处理的单层中分离出来的单个细胞数量。值表示至少三个独立实验的平均值。(C)对照细胞或FAK siRNA细胞、β1-整合素siRNA细胞和用达沙替尼或dynasoir处理的对照细胞中生物素化E-cadherin内化10分钟后的定量。(D类)t吨1/2GFP-E-钙粘蛋白在对照细胞或dynasore处理细胞中的表达。值是至少25个单元格的平均值。(A、 B、D)误差线：s.e.m。

为了探索β1整合素抑制时发生的信号事件，我们观察了表达β1整合素siRNA的细胞中FAK和Src的激活。以vinculin作为整合素粘附的标记物，在整合素粘连中检测到对照细胞中Src和FAK的激活(图S4D). 然而，在缺乏β1-整合素的细胞中，尽管FAK在整合素粘附中是活性的（通过pY397 FAK测量），但活性Src是不存在的，而且没有可检测的pY861 FAK(图S4D). 因此，缺乏β1-整合素的细胞仍然能够组装含有活性FAK的细胞基质粘附。这可能是由于细胞中β1-整合素的不完全敲除或其他β-整合素亚单位向Y397 FAK发出信号所致(16). 然而，这些粘连中没有活性Src，因此无法磷酸化FAK。因此，β1-整合素信号传导的中断可特异性地阻止整合素粘附位点Src的激活。相反，活性Src仍然存在于FAK敲除细胞的整合素粘附位点(图S4E)，而通过免疫沉淀检测到，在PF-562271存在的情况下，野生型细胞中与FAK结合的活化Src的量减少(图S4F). 因此，在FAK和β1-整合素敲除细胞中通过Src和FAK的信号分子特征突出了一个共同的事件：整合素粘附处FAK的Src依赖性磷酸化受到抑制（或者通过整合素黏附中活性Src的丢失介导（如β1-整合素敲减细胞所示）或其无法通过FAK蛋白的丢失（如FAK敲除细胞中所见）或激酶抑制（PF-562271处理细胞）与FAK结合）。结合达沙替尼阻止Y861上FAK磷酸化的能力，这表明观察到的对E-cadherin和粘附强度的影响可能通过FAK的Src-依赖性磷酸化介导。

为了证实Src和FAK调节E-cadherin依赖性AJ的能力，需要β1-整合素信号下游FAK的Src依赖性磷酸化，我们在A431细胞中表达了一个组成活性Src突变体（Y527F-Src）。Western blotting显示在表达Y527F Src的细胞中激活的Src和pY861 FAK增加(图S4G). Src的本构激活导致细胞间粘附减弱，通过机械破坏后单个细胞的增加进行测量(图4B)不会导致细胞-细胞连接完全溶解(图S4H). 用β1-整合素阻断抗体处理降低了对照培养物中的单细胞数量，但对表达活化Src的细胞没有影响(图4B). 因此，当Src具有组成活性时，β1-整合素抑制后细胞-细胞连接的加强被阻止，这表明未调节活性Src的表达否定了β1-整合素控制粘附强度的能力。此外，用达沙替尼处理细胞可阻止Y861上FAK的磷酸化并增加粘附强度（图​（图1B1B年和​和4A）4A级)表明β1整合素下游FAK的Src依赖性磷酸化调节粘附强度。

用PF-562271或达沙替尼治疗后，总E-钙粘蛋白水平没有改变(图S6)Src/FAK信号必须通过其他机制调节E-cadherin功能。E-钙粘蛋白介导的细胞-细胞连接是高度动态的结构，细胞-细胞结合处的E-钙黏蛋白浓度由内吞作用控制，而内吞作用反过来调节粘附强度。为了测量内吞作用，我们跟踪了生物素化细胞表面E-钙粘蛋白的内化过程：生物素化的细胞表面E-cadherin在对照细胞的细胞内池中逐渐富集，而在用dynasoir处理的细胞中，dynasore是一种有效的动态蛋白抑制剂，可以阻止小泡挤压细胞膜(24)，E-钙粘蛋白没有内化(图4C). β1-整合素siRNA细胞中E-cadherin内化减少(图4C). 用达沙替尼处理的细胞或FAK表达被抑制时，E-钙粘蛋白内化也出现类似的减少(图4C).

为了支持E-cadherin内化和粘附强度之间的联系，用dynasoter处理细胞也可以增加粘附强度(图4A). 此外，对dynasore处理的细胞进行的FRAP分析显示1/2抑制Src/FAK信号传导后发现GFP-E-钙粘蛋白(图4D). 因此，尽管无法测量E-钙粘蛋白介导的细胞-细胞粘附强度和E-钙黏蛋白内化体内，t中的更改1/2可能表示可以测量的E-cadherin功能的间接读数体内.

讨论

我们已经确定了Src和FAK在调节肿瘤细胞集体运动所需的E-cadherin功能中的新作用。在人类肿瘤中，E-钙粘蛋白的缺失与更具侵袭性和侵袭性的肿瘤有关。然而，现在很明显，肿瘤的集体运动依赖于细胞间连接的维持，在肿瘤的侵袭能力中也起着关键作用(6). E-cadherin的表达和集体运动之间存在着紧密的平衡，而E-cadherin在细胞-细胞连接处的动态调节在决定连接强度方面至关重要，我们之前已经将连接强度与肿瘤细胞的迁移能力联系起来在体外(21). 这里我们证明β1整合素下游的Src/FAK信号控制E-钙粘蛋白的内化和粘附强度在体外目前尚不可能对E-cadherin介导的细胞-细胞粘附强度和E-cadherin内化进行功能性测量体内因此，重要的是利用FRAP等技术来监测E-cadherin的动态，这可以间接读出E-cadherin的功能，否则是不可能的体内Src和FAK小分子抑制剂改变E-cadherin动力学的能力体内与它们增强细胞间粘附、抑制E-钙粘蛋白内化以及重要地抑制A431细胞集体运动的能力相关体内.Src和FAK可以调节细胞侵袭在体外通过其在调节细胞迁移和侵入虫部位基质金属蛋白酶活性中的作用(25-29). 这些发现确定了一种新的额外机制，通过FAK的Src依赖性磷酸化，β1-整合素信号可能通过控制E-cadherin内化来调节细胞间粘附强度，从而调节肿瘤细胞的集体运动。

以前，皮瓣的使用被用来监测肿瘤细胞的运动体内但这些研究受到了短时间内可以监测迁移以及单个细胞很少移动的限制体内在这些时间范围内。为了克服这些问题，我们使用了光学窗口腔室，再加上可恢复麻醉，使动物能够在几天内重复成像。此外，与皮瓣相比，观察窗在成像前不需要立即进行侵入性手术，因此通过最小化手术引起炎症反应和组织损伤的风险来保护局部肿瘤微环境。此外，与我们之前报道的使用皮瓣进行FRAP相比，使用该方法获得的图像显示出更好的信噪比和更高的样本稳定性(21). 获取的FRAP数据的比较体内使用皮瓣和光学窗口成像方法如图所示图S5C、D通过观测窗口获得的FRAP数据集显示R2与以前可能的值相比在体外.实现肿瘤细胞运动的成像和量化体内我们将观察窗的植入与使用光开关蛋白Dendra2对肿瘤细胞进行特异性标记相结合，与Kedrin及其同事最近报道的方式类似(22). 通过将Dendra2从绿色发光状态转换为红色发光状态，可以长期监测肿瘤细胞的行为。此外，核靶向光活化探针G的使用PA公司C类(14)使核分裂得以量化体内因此，使用光开关和光激活探针，以及使用光学窗口室的可恢复成像，可用于实施稳健和可重复的分析，以监测肿瘤细胞的运动和增殖体内并提供有关药物作用的宝贵信息，有助于剖析新疗法的作用机制。

补充材料

1

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2

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鸣谢

这项工作由英国癌症研究计划拨款C157/A9148资助

工具书类

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