人类干细胞研究的仿生平台

干细胞是开发组织再生新治疗方案和构建生物研究可控模型的核心。将微环境控制与组织特异性运输和信号传递相结合的生物工程细胞培养环境是我们在预测人体体内环境条件下研究组织发育、再生和疾病的关键工具。我们认为，在生物、工程和医学科学的界面上进行实验对于充分发挥干细胞的潜力至关重要。在这里，我们专注于在体外总结与组织发育、疾病和再生相关的环境的平台。

使用某种形式的细胞治疗来再生磨损和患病的组织变得越来越可行。这种需要是显而易见的。医学的进步延长了我们器官的功能寿命，使我们能够活得更长更好。据估计，大约五分之一的65岁老人将在其一生中受益于某种组织替代疗法(Lysaght和Reyes，2001年). 此时，由于手术切除或先天性畸形而无法修复或缺失的组织正在被移植所取代，这是一项最终措施，但由于缺乏匹配的供器官而受到限制。干细胞生物学和组织工程的最新进展使我们能够“指导”多能干细胞——最终的“组织工程师”——在正确的地点和时间分化成正确的表型，以便组装功能性组织结构。这是生物学和工程学的真正结合，使设计“仿生”环境成为可能，使细胞受到已知的引导组织发育和再生的因素的组合体内.

我们刚刚开始充分认识到细胞微环境的整个背景的重要性，包括其他细胞的存在、三维基质以及分子和物理形态的序列。设计仿生模型的前提是要充分发挥干细胞的潜能，至少在动力学的某些方面体内在使用的实验系统中需要重建环境在体外有人认为，我们现在需要新一代3D培养系统，在标准皮氏培养皿的裸骨培养方法和活体生物模型（如老鼠）之间提供一个中间地带(鲁托夫，2009;Burdick和Vunjak-Novakovic，2009年). 先进的培养系统结合了高度的生物保真度和对细胞环境的严格控制，正在积极发展，并已开始在努力观察预测其行为的干细胞反应方面占据中心地位体内根据定义，仿生环境的发展取决于根据现有的有关体内靶器官或组织中存在的状态。然而，也可以根据从体内设置，而不是旨在完全重述这些条件。事实上，通过超越纯仿生环境，创造一系列条件，在无需外部操作的情况下促进器官和组织再生，从而生成工程组织的可能性越来越大，有时甚至是必要的。

总的来说，干细胞科学和组织工程之间的界面研究目前正在推动功能性组织结构再生的重要进展。生物学家和工程师这两个群体已经分离了很长一段时间，但现在开始有效沟通，以建立一个全新的跨学科干细胞生物工程领域。事实上，通过将干细胞科学与生物工程方法的应用相结合，再生医学最近取得了一些最令人兴奋的突破（Peterson等人，2010；Ott等人，2010年;格雷森等人，2009年; Macchiarini等人，2009年；维吾恩等，2010;Zimmermann等人，2006年). 与此同时，生物工程研究正集中于传统细胞培养板无法解决的基本生物学问题(Altman等人，2002年;Au等人，2007年;Connelly等人，2010年;Discher等人，2009年;Freytes等人，2009年;Gilbert等人，2010年;Hui和Bhatia 2007;Lucchetta等人，2005年;鲁托夫等人，2009年;鲁托夫，2009;Nelson等人，2005年;Park等人，2009年;Skelley等人，2009年;Terraciano等人，2007年). 生物工程干细胞“生态位”（由多种细胞类型、细胞外基质、细胞因子和物理因子组成）已成为干细胞研究的新范式，以最有效的方式将这两个群体结合在一起。

这种合作方法的影响尚待观察，但可能会超越目前使用新生物工程工具解决复杂生物学问题的目标，衍生出全新的、尚未预见的概念，这些概念将影响再生医学的未来发展。在这篇Perspective文章中，我们重点关注仿生平台的开发和使用，该平台提供了生物问题和工程工具之间的接口(我)对干细胞环境调控的新见解(ii（ii）)疾病研究，以及(三)开发再生医学的新治疗模式(图1).

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图1

生物工程平台

干细胞科学和生物工程之间的接口工作目前正在产生高生物保真度的可控模型，推动三个主要领域的进展：(我)再生医学的新治疗模式(ii（ii）)发育和疾病研究，以及(三)基础生物学研究。

细胞

从历史上看，用于生物工程的细胞数量和发育潜力都是有限的。然而，两个平行的事态发展表明，这个问题可能变得不那么成问题了。在理解由特定组织组成的细胞层次结构方面取得了许多进展。组织的组织结构通常是这样的，成熟细胞被生成，并被分化程度较低的祖细胞的增殖池所取代，而这些祖细胞又来自一组相对较小的干细胞储备。过去，人们假设存在组织特异性干/祖细胞，但这些细胞的表型往往没有很好的定义，这使得分离它们具有挑战性。在过去的十年中，在多个体细胞组织中鉴定干/祖细胞的数量激增，因此现在可以精确地定义骨骼、肌肉、大脑、肠道、皮肤和血液中的一些关键干/祖(Barker等人，2007年;Cotsarelis等人，1990年;Frederiksen等人，1988年;Sacchetti等人，2007年;Sherwood等人，2004年;Snippert等人，2010年;Kiel等人，2005年;Osawa等人，1996年;Rietze等人，2001年). 其中许多进展都是通过动物模型实现的，而人类的相关研究仍在探索中。尽管如此，这项工作仍在进行中，可能会富有成效。

鉴定成人多能干/祖细胞作为谱系成熟细胞的来源，可能有助于构建工程化组织构建物，至少在前体细胞池既可获得又可强劲生长的情况下。分离和扩增间充质干细胞可能最好地证明了这一概念，可以培养间充质细胞，以产生足够数量的能够产生多个间充质谱系的细胞。这些成熟、长寿的后代可以被纳入工程结构中(Pereira等人，1995年;Jaiswal等人，1997年)甚至进入一些组织。然而，对于某些组织，成人干细胞池的存在仍在争论中（例如在胰岛、(Dor等人，2004年;Smukler等人，2011年)或者组织特异性干细胞可能位于相对难以接近的位置，例如大脑中，这使得它们要么不可能分离，要么至少难以分离用于体外扩增。对于这些组织，多能干细胞仍是最佳选择。

获得多能干细胞是对生物工程应用日益增长的潜力产生重大影响的第二个最新发展。多能干细胞（能够制造任何胚胎内细胞类型）现在不仅可以作为胚胎干细胞（ESCs）从囊胚中获得，还可以在成人体细胞重新编程后以诱导多能干电池（iPSC）的形式获得。将成熟皮肤成纤维细胞或血细胞转化为多能干细胞的能力代表了一项非凡的成就，为从生物工程构建物的预期受体个体中生成细胞开辟了可能性(Takahashi等人，2007年). 重新编程的多能干细胞似乎不再受“Hayflick极限”的限制(海弗利克，1979年). 也就是说，重新编程的细胞不会像更成熟的细胞群那样受到衰老的限制，它们的最终数量基本上是无限的。因此，可以生成大量用于工程结构的细胞。这些细胞现在可以从患者体内生成，这样就可以构建疾病的工程模型或降低免疫排斥风险的工程治疗药物(Saha和Jaenisch，2009年).

充分利用iPSC固有潜力的能力取决于两个重要问题。首先，为了降低肿瘤形成的风险，必须开发不会导致最终细胞永久性遗传改变的重编程方法。最近使用基于RNA的策略的研究使该领域明显更接近这一目标(Warren等人，2010年). 其次，有必要实现高保真度手段，以引导iPSC分化为组织特异性干细胞/祖细胞和成熟细胞。在单个细胞系成熟过程中绘制其分子特征图是一个正在进行的研究领域，它将为选择目标细胞群的期望特征提供更好的指导(Guenther等人，2010年;Bernstein等人，2010年;Novershtern等人，2010年). 通过将谱系层次中各种细胞状态的分子特征与更大规模的筛选策略相结合，可以定义分化方法，甚至重新编程到特定的细胞状态，从而提供潜在的治疗应用(袁等，2011;Borowiak和Melton，2009年).

脚手架

体内细胞被细胞外基质（ECM）包围，ECM负责高度组织化组织的多维和远程排序，并与局部细胞群及其分泌因子相互作用。疾病过程的特点通常是不适当的细胞介导重塑，导致ECM的不平衡周转，并对局部细胞功能产生负面影响。3D支架提供了一种工程化的，在体外替代天然细胞外基质，用于培养细胞的扩张和组织。支架可以被视为细胞和形成组织的结构和“细胞-结构”模板(Burdick和Vunjak-Novakovic，2009年). 支架材料——在大多数情况下是可生物降解的，并且是为模仿特定组织的基质而定制的——可以加工成一系列适合细胞播种和培养的3D结构（Dawson等人，2007；Nair和Laurencin，2007年).

对于任何给定应用，生物材料的具体选择取决于恢复细胞-基质相互作用、直接细胞排列和迁移以及应用物理信号（如流致剪切、机械拉伸或电起搏）的需要。Discher实验室证明，干细胞指定谱系，并致力于对基质弹性极为敏感的表型(Engler等人，2006年)例如，模拟大脑的软基质是神经原性的，模拟肌肉的硬基质是肌原性的；模拟骨骼的最硬基质是成骨性的。他们的研究结果大大提高了我们对物理因素如何影响干细胞分化的理解。

目前正在开发先进的支架设计，以实现模式化、配体结合、细胞因子持续释放以及特定组织（如心肌或骨骼）固有的结构和机械各向异性(Engelmayr等人，2008年;Kloxin等人，2009年;Zhao等人，2011年). “仿生”支架将模拟天然组织的特性，通过生成和传输生物物理信号与细胞动态交互，并逐渐被新合成的组织基质取代。

生物反应器

在皮氏培养皿中，细胞培养环境由细胞周围的氧气、营养物质和代谢物的浓度决定，这些物质在介质溶液与另一介质溶液的交换或刷新之间都会发生变化。在3D组织培养中，由于组织厚度的扩散梯度，这些浓度也会在空间上发生变化。特别是，对于心脏或骨骼等致密组织，氧气渗透深度可以低至100μm。为了克服静态培养板的这些局限性，可以开发生物反应器来控制细胞环境（通过增强细胞之间的物质传递）和物理信号（水动力、机械、电气），并能够洞察细胞行为（通过成像和在线测量）。组织工程生物反应器的设计应通过与自然细胞环境中存在的机制类似的机制，理想地支持细胞存活和3D组织(格里菲斯和斯沃茨，2006年). 在设计生物反应器时，我们的目标是模仿体内细胞生态位（Burdick和Vunjak-Novakovic，2010）。实际上，生物反应器只提供了一个机会来操纵和控制特定生态位的某些方面，但也允许对细胞与其环境的相互作用进行定量研究。

生物合成活性细胞是我们种植组织移植物、构建疾病模型或开发在体外治疗性筛选平台。为了充分发挥其生物潜力，支架生物反应器系统应作为在体外模拟正在研究的发育、再生或疾病的环境。这种受生物启发的方法是设计高度专业化、严格控制的培养系统的基础，这些培养系统正在取代传统的“一刀切”的培养皿。这些新技术能够产生调节信号的空间梯度，使细胞适应其环境的动态变化，并实时了解细胞的反应，为干细胞研究的全新方法奠定了基础。下面的例子说明了生物与工程之间接口的一些最新工作。

仿生范式

在发育和再生过程中，组织从干细胞更新、特化和组装的协调序列中涌现出来，这些都是由级联的环境因素精心安排的。体外和体内干细胞的命运和功能是由细胞的内在遗传（和表观遗传）程序和细胞微环境（也称为“生态位”）共同调节的。细胞与环境的整个环境相互作用，而不是与一个主导因素相互作用(图2). 四组主要的关键因素：（i）调节分子（氧气、营养素、细胞因子），（ii）其他细胞（3D环境、细胞间接触、自分泌和旁分泌信号），（iii）细胞外基质（固定和释放因子、结构、拓扑、刚度），以及（iv）物理因素（流动剪切、压缩、拉伸、电信号）协同作用，产生协同和竞争效应。

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图2

仿生范式

干细胞的命运和功能由细胞微环境（生态位）的整个环境通过细胞与分子、结构和物理等多种因素级联的动态相互作用进行调节。通过综合使用支架（为细胞分化和功能组装提供结构和逻辑模板）和生物反应器（提供环境控制、分子和物理信号），可以构建天然（仿生）细胞环境。

调控信号的动态特性进一步增加了细胞调控的整体复杂性，这些信号在空间和时间上都会发生变化，而且其变化方式还不完全为人所知。此外，细胞与环境之间的相互作用是双向的。细胞通过合成或降解细胞外基质、分泌细胞因子以及通过分子和物理信号与其他细胞和基质进行通信，从而对其环境的特性作出反应并积极地进行修改。“动态互惠”(Nelson和Bissell，2005年)细胞-细胞和细胞-基质的信号传递发生在多个层次上&从细胞膜分子的尺度到组织和整个器官。在每个级别上，都有特定的读数，从一个级别到另一个级别，从一种细胞或组织类型到另一种。

通过对信号类型和幅度的精确时空控制，研究调控信号的单个和组合效应并非易事，使用传统的井板肯定无法实现。细胞培养技术的最新发展提供了从其他系统信号中挑出一个感兴趣的因素，并将该因素与其他定义明确的信号叠加的机会。显然，在体外系统不可能捕捉到实际调控途径的复杂性，但生物工程“生态位”允许对调控发育过程的多种因素进行复杂和可控的研究。建立了一种构建工程组织的仿生方法，通过已知的调节细胞命运和功能的因子，指导干细胞的分化和功能组装。组织工程系统的两个组成部分——支架和生物反应器——协同作用，为培养细胞提供了一个可控的环境，其中包括多种细胞因子（扩散或固定）和物理因素（流体动力剪切、机械拉伸、电梯度）(图2).

两者都有体内（在开发和再生过程中）和在体外（对于组织工程），向细胞提供的线索是其表型的主要决定因素。因此，细胞培养、细胞输送和组织工程系统的设计必然受到生物学（发育中或成年生物体）的启发。互补工程原理有助于重述特定组织或器官自然环境中的参数组合，以便协调“细胞集合”到特定组织表型的转换。

微生物反应器

微技术已被开发用于精确操纵细胞微环境并实时定量研究细胞反应。如此小的规模允许在一个大的实验空间内进行高通量研究，同时使用最少的细胞和材料。在最近的一组研究中(Figallo等人，2007年;Cimetta等人，2009年)通过将微流体平台与一系列培养井耦合，开发了一种简单实用的装置，以实现人类胚胎干细胞培养中质量传输和流体动力剪切的系统精确变化。该微阵列生物反应器在标准显微镜载玻片格式上具有12个培养孔，设计用于容纳附着在2D基质上的干细胞和封装在3D水凝胶中的细胞。这两种培养形式都允许控制培养基的灌注，并严格控制培养基成分和流体动力剪切。利用该微流控平台，对人胚胎干细胞的心血管分化潜能进行了系统研究。细胞分化与水动力剪切水平、氧和生长因子的运输速率相关(Cimetta等人，2009年). 由于该技术符合标准成像格式，因此可以借助定量图像处理来研究差异模式(Figallo等人，2007年).

开发了另一种微流控设备，能够在一定流速范围内培养粘附的小鼠ESC，并在培养空间内施加浓度梯度。培养基的组成是通过单个分子物种与细胞之间的质量传递来精确控制的。mESCs首次在连续对数标度灌注中培养4天，整个阵列的流速变化超过3000倍(Kamei等人，2009年). 显示相关的流体动力学剪切可确定细胞集落的大小。随后，开发了另一个微流控平台，用于半自动培养人胚胎干细胞，该平台允许使用大参数矩阵对细胞自我更新和分化进行并行研究。

微流体平台

“微型技术”的另一个应用是操纵培养中的单个细胞。细胞融合是胚胎发育过程中的一个关键事件，该过程被用于研究体细胞向多能干细胞的表观遗传重编程。细胞融合作为一种研究工具的使用正迅速从非哺乳动物模型生物（例如果蝇属)转化为人类干细胞。细胞融合研究的一个主要挑战是细胞配对的低效率和特异性。随机的细胞聚集和融合导致细胞聚集的异质性，进而转化为由此产生的细胞反应的异质性。微流体装置的最新设计可以克服这个问题，方法是实现高达70%的细胞配对效率，只对两个细胞进行配对，并以高通量的方式进行细胞配对(Skelley等人，2009年). 该设计非常简单，它是基于细胞通过操纵流而被捕获到小“壁龛”中。这种方法对于通过融合进行细胞重编程的系统研究具有很大的潜力。

微流体技术应用的一个典型早期示例是对果蝇属胚胎对温度的动态扰动（Luchetta等人，2005年）。胚胎培养在一个Y形的腔室中，该腔室由两个在不同温度下保持的流体流操作，并允许对流体流和胚胎进行在线成像。这样，胚胎的前半部分和后半部分被迫在两个不同的温度下发育，导致发育速度不同。这项研究举例说明了微流体技术如何实现涉及复杂生物现象的可控“扰动和观察”实验。

微流体技术的应用现在扩展到在干细胞培养物中产生细胞因子浓度梯度。众所周知，扩散信号分子的空间梯度决定了细胞在发育过程中的迁移、谱系规范和成熟，对人类干细胞研究工作至关重要。设计了这种微流控平台，使培养的细胞在稳定的浓度梯度下暴露一周以上，只需最少的操作，无需外部电源(Park等人，2009年). 这种梯度是通过渗透作用和毛细管作用的结合来维持的。为了证明该系统的实用性，将hESC衍生的神经前体细胞培养8天，暴露于Shh、FGF8和BMP4梯度。神经祖细胞成功分化为神经元，形成复杂的神经网络。神经元胞体簇和轴突束的平均数量与Shh浓度成正比。

细胞生态位生物工程

组织的活力和功能取决于通过细胞增殖、分化和结构组织对分化细胞的调节性补充。协调这些过程发生在多个层面，但必须从干/祖细胞开始。如果没有这些细胞的保存以及它们的自我补充与成熟细胞的产生之间的平衡，组织的完整性就无法维持。干细胞的调节与干细胞生态位有关。所有细胞都与其他细胞和细胞外环境相结合，但对干/祖细胞来说，细胞命运的调节可能是最精细的。因此，细胞生态位通常集中在干细胞生态位上，这是一个解剖学上可定义的组织部位，在那里干细胞的自我更新和分化受到调节(Voog和Jones，2010年).

对干细胞生态位的组成和生理学的详细了解仍然十分有限。一些组织已经取得进展(Hsu等人，2011年;Sato等人，2011年)但对于骨髓造血来说，生态位输入的复杂性仍然是最好的定义。现在很清楚，多种细胞类型和细胞外成分参与改变干细胞的数量、增殖活性和定位。同样显而易见的是，将生态位视为单个细胞类型或单个基质成分的想法过于简单，生理调节依赖于多种且往往是相互抵消的影响。其中包括来自多个间充质群体（从未分化细胞到骨谱系再到脂肪细胞）、造血后代（如破骨细胞、巨噬细胞和交感神经元）的线索。(Calvi等人，2003年;Zhang等人，2003年;Kollet等人，2006年;Naveiras等人，2009年;Omatsu等人，2010年;Winkler等人，2010年;Katayama等人，2006年). 此外，细胞外基质糖蛋白（如骨桥蛋白）、信号分子和小分子（如离子钙和氧）似乎都起作用(Adams等人，2006年;Nilsson等人，2005年;Parmar等人，2007年;Stier等人，2005年). 概述此系统在体外非常具有挑战性。然而，使用降低复杂性的结构正在取得进展。

长期以来，造血干细胞（HSC）的保存和分化可以发生在粘附的“气孔”饲养层上。基于内源性细胞生态位的知识对这些方法进行了改进，现在可以实现相对稳定的共培养系统，用于中间产物的化学筛选。此外，Helen Blau实验室还开发了极具前景的工程化二维和三维生态位模型(鲁托夫等人，2009年). 使用含有生长因子的不同性质的微凝胶，可以调节造血细胞和肌肉干细胞的功能。在后一种情况下，改变水凝胶基质的弹性，以更接近所发现的条件体内导致肌肉干细胞自我更新体外因此，它们是移植后肌肉的有效来源(Gilbert等人，2010年). 这些结果强烈支持以下观点：体内生态位可以有效地用于增加干细胞数量，并为后续生物工程设备的移植或参与提供有用的细胞群。模拟体系结构关系的微图案体内也被证明可以导致组织形态发生体外这可能是复杂组织重建的基础(Nelson等人，2006年).

定向干细胞分化

脚手架-生物反应器系统

在一项开创性的生物工程研究中，在促进类胚体（EB）形成和随后的血管分化的条件下，使用流体动力学活性生物反应器在多孔海藻酸支架中培养人胚胎干细胞（Gerecht等人，2004年）。支架孔的封闭环境导致在支架孔中形成大小均匀的小EB(图3 a、b). 一旦引入分化因子，这些相同的EB就会发生血管分化。事实证明，控制EB大小（例如通过微模式化和悬浮培养）有助于将细胞分化扩大到大细胞数量(Niebruegge等人，2009年).

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图3

人类干细胞支架生物反应系统

使用旋转生物反应器在多孔藻酸盐支架中培养人胚胎干细胞(一)在支架孔内形成空间限定的EB(b条)符合人体颞下颌关节髁状突精确大小和形状的解剖正确的骨移植（经Gerecht等人2004年许可复制）。(c（c）)已通过使用解剖形状的脱细胞骨支架进行设计(d日)用人间充质干细胞接种并用培养基灌注培养(e（电子）)在“解剖”生物反应器中（面板c、d、e经许可复制Grayson等人，2009年)

在过去的十年中，人们开发了各种类型的水凝胶，用于hESCs的增殖和早期分化。这些研究的重要性在于，动物饲养层被细胞友好的大分子（如透明质酸、，Gerecht等人，2007年)通过光聚合封装活细胞，具有量身定做的结构和机械性能，并且可以结合功能基团或控制释放微载体(Ferreira等人，2007年). 对细胞-基质相互作用动力学的深入了解有助于导出细胞培养支架的设计要求（Engler等人。，2006&2008,Guilak等人，2009年;Discher等人，2009年).

新技术的出现与这些新水凝胶的使用相结合，以在高通量环境中实现环境因素的精确和系统变化(Underhill和Bhatia，2007年;Flaim等人，2005年;Figallo等人，2007年). 总的来说，水凝胶生物反应器平台为研究干细胞作为修复介质的作用提供了独特的方法。最有趣的是，我们可以如何有效地翻译这些在体外模型到体内组织修复平台。

生长组织和器官

总结和未来挑战

新型生物工程培养平台可以提供严格的环境控制以及生理运输和信号传递，从而能够在预测人类疾病的条件下研究发育、再生和疾病体内上下文。体外人类干/祖细胞的研究大多是在缺乏天然组织的结构和信号规范、分子和物理调节因子的时空序列以及血液循环提供的动力和系统因子的系统中进行的。在整个动物模型中，人类细胞是在一个不一定代表其本土生物的环境中进行研究的，并且对细胞反应的控制和洞察力有限。因此，在体外人类细胞/组织的研究往往无法预测转化动物模型和人类临床研究的结果，从而增加了时间和成本，降低了任何治疗策略的有效性。

几乎可以肯定，前进的道路将需要更深入地了解组织是如何在体内形成的。小鼠的血统追踪模型提供了细胞类型在发育和应激条件下如何相互关联的信息。动物模型能够在特定时间点对特定细胞类型进行持久荧光标记体内，担任体内相当于脉冲相位实验。因此，他们可以被用来理解比血统关系更多的东西。例如，将这些模型与体内成像技术可以精确定义器官发育和修复多个方面的3D结构关系。此外，这些新方法允许分析特定位置或特定条件下的细胞。因此，它们可以成为组织重建所需类型的高密度数据集的来源体外.

生物系统对生物工程环境的充分利用需要生物学家和工程师以尚未实现的方式进行互动。这些学科中的分析方法，甚至个人的语言，造成了文化鸿沟，仍然限制着这一领域。历史告诉我们，以前在其他环境中也存在这样的差距，并已成功跨越。进入任何一个基因组学实验室，计算机科学和分子生物学世界之间的碰撞都是显而易见的。当高通量测序技术使解开复杂遗传信息的潜力成为现实时，不同学科中有远见的个体在机遇的驱动下走到了一起。目前再生医学领域也发生了类似的变化。越来越多的工具可用于精确研究组织的复杂生物学。包括细胞在内的材料现在具有足够的可塑性，可以重新创造复杂的环境体内具有显著精度的环境。该领域的领导者和受训者正积极推动跨学科方法研究干细胞及其在再生医学中的应用。

总之，为了定义关键问题并设计解决这些问题的方法，我们需要克服的障碍包括生物工程师对生物要求的更深刻理解，以及生物学家对先进技术的能力和局限性。跨学科研究正在推动这一领域的发展，工程学和生物学之间的差距首次得到控制。

致谢

脚注

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