跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
纤维生成组织修复。2011; 4: 4.
2011年2月1日在线发布。 数字对象标识：10.1186/1755-1536-4-4
预防性维修识别码：PMC3042008年
PMID：21284856

肝纤维化动物模型中CTGF和TGF-β的协同作用

王清健,1 威廉·乌辛格,1 布莱克·尼科尔斯,1 朱莉娅·格雷,1 徐智荣,1 托德·西利,通讯作者1 米奇·布伦纳,1 郭广杰,1 张伟华,1 诺林·奥利弗,1 艾尔·林,1和大卫·尤威尔1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景

结缔组织生长因子（CTGF）被广泛认为与转化生长因子（TGF-β）协同促进纤维化的发展；然而，其参与的大部分证据来自相关的和基于文化的研究。本研究在三种纤维化疾病小鼠模型中直接检测了CTGF在组织纤维化中的重要性：一种新的由反复腹腔注射CTGF和TGF-β2诱导的多器官纤维化模型；单侧输尿管梗阻（UUO）肾纤维化模型；气管内博莱霉素滴注肺纤维化模型。

结果

腹膜内联合应用CTGF和TGF-β2可引起严重的纤维化反应，而人类抗CTGF抗体FG-3019可抑制这种反应，FG-3019能够改善纤维化的组织学特征，并将肾脏中羟脯氨酸：脯氨酸（Hyp:Pro）比值增加25%(P（P）<0.05），30%在肝脏(P（P）<0.01）和63%在肺部(P（P）< 0.05). 此外，单独使用任何一种细胞因子都无法引起纤维化反应，因此证明CTGF在TGF-β和反之亦然为了符合纤维化中CTGF功能的这一要求，FG-3019还将UUO后肾Hyp:Pro反应降低了20%(P（P）< 0.05). 在博莱霉素损伤的动物中，观察到FG-3019治疗效果的类似趋势（总肺Hyp减少38%，P（P）= 0.056). 因此，FG-3019抗体治疗持续降低了所有模型中过度胶原沉积和纤维化的病理严重程度。

结论

CTGF和TGF-β信号传导之间的协同相互作用是引发明显的组织纤维化所必需的。这种相互依赖性和观察到的FG-3019抗纤维化作用表明，抗CTGF治疗可能对不同形式的纤维增生性疾病提供治疗益处。

背景

纤维增生性疾病，包括慢性肺、肝、肾和血管纤维化，占美国死亡人数的近一半[1,2]. 这些疾病经常影响多器官系统，使其潜在发病机制的阐明变得复杂，并阻碍了有效治疗的发展。然而，转化生长因子（TGF-β）和结缔组织生长因子（CTGF）这两种分泌因子被广泛认为是纤维化的普遍介质，尽管其协同作用的确切机制尚不清楚[三-8]. 由于TGF-β是CTGF的有效诱导剂，大多数模型都假设CTGF是TGF-？活性的下游介体，而其他研究支持TGF-[9-11].

CTGF是一种多功能肝素结合糖蛋白，通常在低水平表达，但在几乎所有纤维化条件下显著富集[8]. 基于细胞的研究表明，CTGF调节有助于纤维化形成的多个过程，包括细胞增殖、迁移、粘附、存活和细胞外基质生成；它既是TGF-β信号传导的下游介质，也是协同介质；它影响参与纤维形成过程的各种细胞类型，无论其来源于何种组织，包括间充质干细胞、肝星状细胞、肾足细胞、系膜细胞、壁和管状上皮细胞、肺II型肺泡细胞、间皮细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、，心肌细胞、周细胞和成纤维细胞[4]. 此外，对患病人体组织的相关研究表明，CTGF和TGF-β在许多纤维化疾病状态中存在重要联系，包括糖尿病肾病、特发性和非特发性肺纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化（包括瘢痕疙瘩和系统性硬化）、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、，胰腺炎与各种恶性疾病[三,8].

来自人类疾病动物模型的数据也支持CTGF及其与TGF-β在纤维化中的相互作用的重要性。例如，在三种肝纤维化模型中，小干扰（si）RNA介导的CTGF敲除被证明可以抑制纤维化反应[5,12,13]在慢性移植物肾病模型中[14]. 同样，在1型和2型糖尿病肾病模型中，CTGF的反义介导敲除被证明可以抑制纤维化或其指标[15]单侧输尿管梗阻（UUO）和次全肾切除（5/6）肾纤维化[16,17]，化学性肝纤维化[18]皮肤创伤修复后增生性瘢痕[19]以及乳房植入物周围的包膜疤痕和挛缩[20]. 值得注意的是，在六个模型中的五个模型中，在siRNA和反义介导的CTGF敲除后，TGF-β的诱导也减少了[5,12,13,15,16,18]从而表明CTGF活性以正反馈的方式直接或间接增强其自身诱导物的表达。此外，在5/6肾切除术模型中，已知TGF-β靶点的表达被反义CTGF敲除所抑制，尽管同时存在TGF-？转基因的过度表达，这表明CTGF在纤维化环境中也促进TGF-[17]. 因此，在这些和其他疾病模型中，CTGF可能影响TGF-β的水平和功能，并且与CTGF一样，TGF-β本身的靶向抑制会减弱纤维生成。然而，TFG-β的众多关键功能使其作为抗纤维化治疗的直接靶点缺乏吸引力[三].

在本文所述的工作中，根据先前的观察，即TGF-β3和CTGF同时或连续皮下联合给药可诱导新生小鼠持续性纤维化病变的形成，开发了一种新的CTGF和TGF-？协同模型，而单独使用两种细胞因子均未产生任何持续效应[21]. 在这项研究中，我们将这些发现扩展到一个模型，在该模型中，腹腔内联合注射TGF-β2和重组人CTGF可在包括肺、心脏、肾脏和肝脏在内的重要器官中产生严重的腹膜纤维化、腹部粘连和弥散性纤维化。如早期的皮下纤维化模型所示，腹腔注射模型中的纤维化也需要TGF-β和CTGF的联合应用，从而证明这两个因素在纤维化反应的发生和维持中具有强大的协同作用。此外，FG-3019是一种抗人CTGF的全人类重组单克隆抗体，在该模型和另外两种临床相关的啮齿动物纤维化模型中阻断了纤维化，这两种模型都对TGF-β/Smad靶向干预有反应[22-24]. 因此，用CTGF阻断抗体治疗可降低所有三种模型的纤维化严重程度，从而表明抗CTGF治疗可能对多种纤维增生性疾病具有临床益处。

结果

FG-3019单克隆抗体的制备与鉴定

FG-3019是一种全人类重组DNA衍生的CTGF反应单克隆IgG1/κ抗体，从表达人类免疫球蛋白转基因的基因工程小鼠（美国新泽西州普林斯顿市Medarex）中分离和克隆[25]用重组人CTGF免疫。利用工程CTGF融合蛋白和CTGF蛋白水解片段，将FG-3019结合活性映射到CTGF富含半胱氨酸的血管性血友病因子C型（VWC）结构域（图​（图1A）。1安培). 衍生自CTGF的VWC结构域序列的合成肽在竞争性CTGF ELISA中有效取代FG-3019，包括对应于CTGF氨基酸135-157的肽，表明这些序列参与FG-3019对CTGF的识别和结合。CTGF一级序列的这一段在相关CCN家族蛋白（包括NOV和CYR61）之间保守度很低，但在不同哺乳动物物种编码的CTGF蛋白中保守度很高[26]. 事实上，FG-3019与多种哺乳动物（包括啮齿动物）的CTGF结合，放射免疫分析表明，它与人类和大鼠的CTGF-结合K（K）d日值分别约为0.1和0.3 nmol/l（未显示数据）。为了证实FG-3019对CTGF的特异性，与结构相关的CCN蛋白CYR61或NOV相反，通过免疫印迹分析比较FG-3019与重组蛋白的结合；FG-3019确实与CTGF密切相关，但与CYR61或NOV无关（图​（图1B）。1B年). ELISA也证实了这一结果（数据未显示）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1755-1536-4-4-1.jpg

FG-3019结合表位与结缔组织生长因子（CTGF）的VWC结构域重叠.（A）FG-3019结合表位的区域（CTGF氨基酸142至157，用黄色表示）叠加在胶原IIa VWC结构域的结构上[50]. 通过序列同源性，预测该结构域的一般结构特征在CTGF和其他CCN（结缔组织生长因子）蛋白中保守[51]. 预测的FG-3019结合位点位于CTGF的VWC结构域内的纤维连接蛋白-1样模块之外。VWC域之间的物理交互爪蟾报道了CTGF和TGF-β家族成员TGF-α1和骨形态发生蛋白（BMP）-4[9]. 还指出了VWC结构域相对于CCN家族成员的胰岛素样生长因子结合蛋白（IGF-BP）、血小板反应蛋白-1（TSP1）和C末端半胱氨酸结（CT）同源结构域的位置。（B）使用FG-3019、抗CYR61和抗NOV抗体，通过western blot分析重组人CTGF、CYR六十一和NOV蛋白（上部显示考马斯蓝）。FG-3019特异性结合CTGF，与CYR61或NOV无交叉反应。

TGFβ2和CTGF联合给药对新生小鼠的Profibrotic效应

建立了一种新的多器官纤维化模型，包括新生小鼠反复腹腔注射TGF-β2和CTGF。虽然用载体、TGF-β2或CTGF单独治疗的对照小鼠的大体解剖结构正常，但同时用这两种细胞因子治疗的动物的腹壁和腹膜深度增厚（图2A、B). 在严重病例中，几乎所有腹部器官的表面都覆盖着增厚的纤维膜，相邻器官之间或游离组织与腹壁之间容易出现纤维粘连。通过比较组织内的Hyp:Pro比率对器官纤维化进行定量评分，Hyp:Pro比率是胶原蛋白含量相对于总器官蛋白的标准衡量标准。联合应用TGF-β2和CTGF后，肾、肝、肺和心脏的Hyp:Pro比率显著增加，而单独使用任一种细胞因子均未增加与溶媒对照组相比的Hyp:Pro比率（表​（表1），1)从而证明了该模型中CTGF和TGF-β之间的明确相互作用。通过这些测量，TGF-β2和CTGF合用后，肾脏和肝脏的Hyp:Pro变化最为显著（超过对照组分别增加65%和160%），心脏和肺的Hyp:Pro变化更为温和但显著，分别增加34%和11%(P（P）肾脏、肝脏和心脏<0.001，P（P）肺部<0.01）。由于后一组织位于腹膜腔外，其相对Hyp:Pro含量的显著增加表明，腹腔内联合应用TGF-β2和CTGF可引起全身性而非单纯的局部纤维化反应。与健康对照组（10.59±0.24 g）相比，联合应用CTGF和TGF-β2还可使最终体重减少28%（平均±SE 7.62±0.10 g），这一点非常显著(P（P）< 0.001). 此外，这些动物的严重腹内纤维化似乎与肠动力受损有关，如肠道中粪便物质积累增加所示（数据未显示）。

表1

TGF-β/CTGF协同模型中各治疗组和器官的羟脯氨酸/脯氨酸比值

器官控制治疗
-转化生长因子-β2-转化生长因子-β2转化生长因子-β2
--CTGF公司细胞生长因子CTGF公司
----FG-3019型
肾0.057 ± 0.0010.061 ± 0.0020.059 ± 0.0010.094 ± 0.00510.085 ± 0.0031,3
肝脏0.015 ± 0.0010.017 ± 0.0010.016 ± 0.0020.039 ± 0.00310.032 ± 0.0021,4
肺0.079 ± 0.0020.078 ± 0.0020.083 ± 0.0010.088 ± 0.00120.083 ± 0.002,3
心脏0.041 ± 0.0010.044 ± 0.0020.046 ± 0.0020.055 ± 0.00210.053 ± 0.0031

所示数据代表平均值±SEM，n个=6到10。

1P（P）< 0.001,2P（P）<0.01与健康对照组比较，单向方差分析，Fisher差异最小。

三P（P）< 0.05,4P（P）与转化生长因子（TGF）-β2和结缔组织生长因子（CTGF）联合用药组相比，<0.01。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1755-1536-4-4-2.jpg

转化生长因子-β/结缔组织生长因子（TGF-β/CTGF）协同模型的大体解剖.腹膜腔（A）健康对照动物，（B）动物共同服用CTGF和TGF-β2，以及（C）动物联合应用CTGF和TGF-β2，并用抗CTGF抗体FG-3019治疗。在同时接受TGF-β2和CTGF的车辆治疗小鼠中，广泛的纤维膜包围了腹腔的大多数器官。在接受TGF-β2和CTGF加FG-3019的小鼠中观察到严重纤维化病理学显著降低。

在同时接受TGF-β2和CTGF的动物中，同时使用FG-3019治疗，可显著抑制腹膜和腹腔纤维化反应（图​（图2C）。2摄氏度). 在这些动物中没有发现明显的腹腔粘连。与未接受FG-3019治疗的接受TGF-β2和CTGF的动物相比，FG-3019治疗组的总纤维化效应的这种定性降低伴随着平均最终（第21天）体重（9.32±0.32 g）改善了22%(P（P）<0.001），尽管FG-3019治疗的动物仍比健康对照组轻12%(P（P）< 0.001). FG-3019治疗也显著降低了所有检查器官中的Hyp:Pro比率。具体而言，TGF-β和CTGF联合用药引起的肺组织Hyp:Pro相对含量的增加（即纤维化反应）减少了63%(P（P）<0.05），25%在肾脏(P（P）<0.05），30%在肝脏(P（P）<0.01）和FG-3019治疗后心脏中的15%（表​（表11).

一项独立的组织学分析（Comparative Biosciences，Inc.，Sunnyvale，CA，USA）也证实了以下观察结果：单纯纤维化仅发生在TGF-β和CTGF联合给药后，而不是单独给药两种细胞因子，并且通过FG-3019抗体治疗而减弱。染色肝切片的显微镜分析显示，八只接受两种细胞因子治疗的动物中有八只的肝包膜出现多灶性纤维化（图​（图3A，3A级，表​表2）。2). 此外，在接受这两种细胞因子的三只动物中，主要在门脉周围肝区出现了多个微量或轻度实质纤维化灶。因此，TGF-β/CTGF联合用药的反应主要是囊性纤维化，偶尔也会累及实质。相比之下，仅接受CTGF或TGF-β治疗的所有动物都完全没有囊性或实质性肝纤维化的组织学证据，而在接受FG-3019治疗的八只动物中，只有两只出现无实质性纤维化的囊性纤维化的局部证据（图​（图3B）。3B公司). 因此，CTGF靶向FG-3019治疗可显著降低双细胞因子治疗后任何程度的纤维化发生率（Fisher精确检验，P（P）=0.007）和等级方差分析表明，接受TGF-β2和CTGF（中位数1.5，范围1-4）的动物的组织学肝纤维化严重程度评分（0=无纤维化，1=最小，2=最小到轻度，3=轻度，4=中度纤维化）显著高于接受载体的动物，TGF-β2或CTGF单独使用（所有分数=0；Dunn试验，P（P）<0.001），FG-3019治疗显著降低（中位数0，范围0-1，P（P）< 0.01). 同样，在接受两种细胞因子但未经FG-3019治疗的八只动物中，有三只动物观察到轻度至中度肾包膜纤维化（图​（图3C），3C公司)，而在其他任何组的任何动物中均未发现纤维化迹象，包括FG-3019治疗组（图​（图3D）。三维). 在这项研究中，没有任何动物出现肾实质纤维化，也没有任何组织出现炎症。

表2

组织学肝纤维化的发病率（按严重程度评分）

治疗肝纤维化程度（评分）
无（0）最小值（1）轻微到轻微（2）轻度（3）中等（4）
车辆90000
转化生长因子-β280000
CTGF公司60000
转化生长因子-β2+CTGF04211
TGF-β2+CTGF+FG-301962000

数值表示具有每个分类肝纤维化评分的小鼠数量。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1755-1536-4-4-3.jpg

FG-3019治疗可改善接受转化生长因子（TGF）-β和结缔组织生长因子（CTGF）的小鼠的肝肾纤维化.（A、B）肝脏和(C、 D）21日龄动物肾脏联合应用TGF-β2和CTGF；动物接受了以下两种治疗（A、C）车辆或（B、D）FG-3019。从出生后一天开始，每天给药20天。箭头表示FG-3019治疗抑制的强健包膜纤维化区域。显示了代表性图像（所有苏木精和伊红，原始放大倍数×200）。

CTGF抑制在UUO诱导的肾纤维化模型中的作用

先前的研究表明，在UUO诱导的肾纤维化模型中，CTGF水平与肾脏病理学之间存在直接相关性[16,27]. 在当前研究中，使用标准组织Hyp:Pro比率来评估纤维化反应，将车用治疗动物的结扎肾脏与相同动物的非结扎对照肾脏进行比较，以确定UUO的纤维化效应。此外，为了确定CTGF信号传导的中断是否抑制UUO诱导的纤维化反应，对使用载体或FG-3019治疗2周的动物的结扎肾脏进行了比较。

在车辆治疗的对照动物中，UUO诱导了明显的纤维化效应，结扎肾脏的平均Hyp:Pro比率比非结扎对照肾脏增加了四倍（0.175±0.011 vs.0.045±0.0005；P（P）< 0.001). 与未经处理的UUO对照小鼠相比，经10 mg/kg和30 mg/kg FG-3019处理的动物肾脏可显著防止UUO诱导的纤维化，这表明其诱导的Hyp:Pro比率分别降低了20%和15%(P（P）<0.05）（图​（图4），4)分别为。使用三色染色进行的组织学分析显示，无论采用何种治疗方法，所有梗阻肾脏中的间质纤维化、成纤维细胞增殖和胶原积累均增加，10 mg/kg FG-3019治疗组（未显示）的纤维化程度略有但主观上有所减少。三色染色增强与成纤维细胞增殖相关，并在所有梗阻肾脏的皮质间质、周围肾小球和髓质区域中都可见。无论采用何种治疗，所有梗阻肾脏的皮质也可见明显的肾积水，其特征是肾小管扩张和肾小管上皮丢失。此外，阻塞肾脏的间质中，尤其是血管周围区域，通常可见多灶性淋巴细胞浸润；然而，这也不受治疗的影响。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1755-1536-4-4-4.jpg

FG-3019抑制单侧输尿管梗阻（UUO）后肾胶原沉积UUO小鼠肾组织中的羟脯氨酸：脯氨酸（Hyp:Pro）比率表示为高于非门控对照肾脏平均Hyp:Pro比率（0.0446±0.0005，n个= 35). 10 mg/kg和30 mg/kg FG-3019治疗组（灰色条）的平均肾脏Hyp:Pro比率增加分别比车辆治疗对照组（白色条）的UUO肾脏低20%和15%*P（P）与UUO+载体相比<0.05（方差分析，Fisher最小显著性差异）。

FG-3019在博莱霉素诱导的肺纤维化模型中的作用

为了证实CTGF积极参与肺纤维化的发病机制，并且CTGF抑制可能减轻肺纤维化反应，在博莱霉素诱导的肺纤维化模型中检测了FG-3019治疗的效果[24,28]. 将博莱霉素治疗的动物与健康对照组进行比较，以确定肺博莱霉素滴注对纤维化的影响。将博莱霉素治疗2周的动物与载体或FG-3019进行进一步比较，以研究CTGF信号在肺纤维化形成中的重要性。该模型中的纤维化通过肺总Hyp的标准测量值进行评分，其中考虑了肺中可变的Pro含量，这通常与肺总胶原含量的变化无关。

在对照小鼠中，博莱霉素治疗使平均±SEM Hyp含量增加到452±18μg/肺(n个=6）与非纤维化盐水治疗对照组（285±8μg/肺；n个= 10); 每肺167μg显著增加59%(P（P）< 0.001). 与载体处理的博来霉素对照相比，FG-3019抗CTGF抗体处理导致平均诱导的肺Hyp含量持续降低；10 mg/kg FG-3019治疗组诱导的纤维化减少38%，显示出治疗效果的趋势(P（P）=0.056）（图​（图55).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为1755-1536-4-4-5.jpg

FG-3019抑制博莱霉素治疗小鼠肺部胶原沉积博莱霉素处理小鼠的肺羟脯氨酸（Hyp）含量（μg/肺）表示为健康对照肺Hyp含量的平均变化（285±8μg/肺部，平均值±SEM，n个= 10). FG-3019 3 mg/kg、10 mg/kg和30 mg/kg治疗组（灰色条）的平均Hyp含量（μg/肺）增加量分别比载体（白色条）治疗的博莱霉素小鼠低27%、38%和13%*P（P）=0.056 vs.博来霉素+载体（ANOVA，Fisher’s LSD）。

FG-3019血浆浓度

在上述研究中，通过ELISA测定循环FG-3019抗体水平，以确认在腹腔注射后FG-3019的暴露。在博莱霉素和UUO研究中，FG-3019最终剂量10 mg/kg后48小时测得的平均±SD FG-3019血浆浓度分别为184±45.6和216±71.8μg/mL。与新生儿TGF-β/CTGF协同研究中较低的每日和累积剂量一致，最终1.84 mg/kg剂量后24小时的FG-3019血浆浓度为21.8±11.5μg/mL。

讨论

纤维化是瘢痕组织的过度和持续形成，是影响肺、肾、眼睛、心脏、肝脏和皮肤的各种慢性疾病中与器官衰竭相关的发病率和死亡率的原因。CTGF在纤维化组织中强烈过度表达，并与TGF-β、VEGF、胰岛素样生长因子、血管紧张素II和其他因子的慢性纤维化作用直接相关。CTGF作为TGF-β的辅因子，诱导成纤维细胞成为肌成纤维细胞，沉积胶原蛋白，最终导致器官瘢痕形成和功能障碍，最严重的是器官衰竭和死亡。事实上，组织、血液或玻璃体液中的CTGF水平已被证明与许多疾病中纤维化的程度和严重程度相关[29]. 示例包括糖尿病肾病、肾小球硬化和IgA肾病（肾脏）、糖尿病视网膜病变和晚期黄斑变性（玻璃体液）、肝硬化、胆道闭锁和非酒精性脂肪性肝炎（血清、肝脏）、充血性心力衰竭（心肌）以及各种形式的肺和皮肤纤维化（血清、组织）[5,29-32].

在这里描述的研究中，抗CTGF抗体FG-3019在CTGF和TGF-β协同作用的新模型中，以及在先前描述的肺和肾纤维化急性炎症模型中，持续降低纤维化反应。因此，FG-3019在这些模型中的抗纤维化活性支持了CTGF在介导纤维化形成中的关键作用。事实上，FG-3019减轻了与急性博莱霉素和UUO损伤相关的纤维化，尽管这些急性损伤模型的相对严重性可能会限制可观察到的治疗益处。无法从这些模型中确定FG-3019抗纤维化作用的具体性质，还需要进行额外的研究，以确定FG-3019-作用是否通过影响纤维化的发生、发展或消退直接发挥，或间接通过对初始损伤和/或损伤早期炎症反应的影响[33]. 然而，选择UUO和博莱霉素模型是因为它们已经被广泛研究，并且TGF-β和CTGF都与它们的发展和进展有关[16,22-24,28]. 因此，在肺和肾纤维化模型中，内源性TGF-β和CTGF被诱导[28]在CTGF和TGF-β协同模型中，重组外源性TGF-。因此，每个模型都为研究CTGF/TGF-β的协同作用和抗纤维化药物的潜在临床应用提供了一个有用的方案。

先前的研究结果表明，皮下注射CTGF和TGF-β后，需要联合注射才能在皮肤中形成持续的纤维化效应[21,34-36]. 在当前的协同作用模型中，腹腔内联合应用TGF-β2和CTGF导致严重的腹部纤维化和腹膜外器官的播散性纤维化，从而表明诱导了系统性纤维化反应。值得注意的是，在该模型中诱导纤维化需要同时暴露于TGF-β和CTGF，以表明这两种细胞因子在纤维化反应中的功能协同作用。这些结果表明，在TGF-β信号增强的情况下，CTGF对启动纤维化既必要又充分，在CTGF增加的情况下TGF-？对诱导纤维化既必要也充分。由于TGF-β是内源性CTGF的有效诱导剂，因此考虑为什么需要进一步添加外源性CTGF-β才能引起明显的纤维化反应，这一点很重要。一种可能的解释是，在存在病理性纤维化的情况下，TGF-β确实是必需的，但不能单独诱导足够的内源性CTGF。这意味着CTGF调控的独立途径也是必要的。此外，它建议必须满足CTGF阈值才能启动或维持纤维化形成，如果是这样，那么即使将其活性部分抑制到低于关键阈值的水平，也可以提供抗纤维化的益处。事实上，在合作相互作用模型中，FG-3019抗CTGF治疗降低了肝、肾和肺联合应用CTGF和TGF-β后观察到的整体纤维化水平。Hyp:Pro变化的幅度受预先存在的胶原蛋白含量、受影响较小的样本区域的存在以及纤维化期间非胶原蛋白的潜在积累的影响，而组织学纤维化评分衡量组织的整体微观外观，包括可能受到不同影响的组织区域，例如包膜或实质区域。因此，这两项指标都支持定性结论，即CTGF和TGF-β协同促进组织纤维化，并且CTGF抑制可以抑制纤维生成。

虽然TGF-β/CTGF协同作用模型的特性表明与纤维化疾病有广泛相关性，但它可能与术后腹腔粘连的形成以及与透析程序相关的腹膜纤维化特别相关。TGF-β/CTGF协同作用模型中的纤维化与严重的腹膜粘连和肠梗阻症状相关，这是术后腹膜粘滞患者的常见表现[37]. 此外，在动物模型中，腹膜损伤后术后粘连中CTGF mRNA显著增加[38]以及接受腹膜透析的患者[39]. 因此，CTGF和TGF-β可能以协同和潜在的靶向方式促进腹腔粘连的形成。

总之，这些数据提供了获得和丧失功能的证据，证明CTGF在纤维化组织损伤中起着关键作用，因为在TGF-β水平升高的情况下，需要外源性CTGF来启动纤维化反应，因为用CTGF-blocking抗体治疗可以减弱三种独立的病理性纤维化模型中的纤维化反应。此外，就临床实用性而言，这些数据支持这样一个结论，即抗CTGF单克隆抗体FG-3019可能有助于控制糖尿病肾病、系统性硬化或特发性肺纤维化等疾病患者的肾、肺和肝纤维化的进展。根据在啮齿动物中使用人类抗体的要求，这些结果是在相对有限的治疗时间（14-20天）的研究中获得的，因此无法评估更长时间治疗方案的额外益处。在这些研究中，FG-3019给药的最佳剂量和方案尚未完全确定，可能因疾病而异。然而，在其他研究中，包括使用非免疫IgG组的比较中，也重现了FG-3019的抗纤维化作用[40].

CTGF具有广泛的生物活性，包括对骨骼和软骨发育的影响[41]、细胞粘附和趋化性[42]和血管生成[43]这些实验都没有涉及到这些问题。此外，纤维组织重塑也影响其他临床相关过程，包括癌症进展和器官-颗粒排斥。除了其抗纤维化作用外，此处使用的FG-3019抗CTGF抗体还被证明能够抑制胰腺癌小鼠模型中的肿瘤生长、转移和血管生成，并能够抑制CTGF过度表达胰腺癌细胞的锚定非依赖性生长[44-46]. 因此，综上所述，这些研究表明，CTGF是纤维化和其他疾病状态的临床相关靶点。

方法

动物选择和处理

小鼠（Charles River Laboratories，Inc.，Wilmington，MA，USA）按照美国国立卫生研究院指南和《动物福利法案》中规定的标准以及机构动物护理和使用委员会批准的协议进行处理。

UUO肾纤维化研究

总共有40只雄性瑞士韦氏小鼠（32-35 g）被分配到四组中的一组（10只/组）。在给药的第一天，小鼠接受腹腔注射载体或FG-3019（10或30 mg/kg），4小时后，用异氟醚麻醉小鼠，并在左肾上进行UUO[22]. 右侧（未手术的）肾脏作为对照。此后，小鼠每隔一天接受一次载体或FG-3019，共给药七次。UUO后14天，用异氟醚麻醉存活小鼠，通过腹部静脉采集血液，通过ELISA测定血浆FG-3019浓度，并采集左肾和右肾。对存活至预定终止日期的小鼠进行成功的输尿管结扎检查。五只结扎失败的小鼠（一只来自UUO和载体组，四只来自UU和10 mg/kg FG-3019组）被排除在分析之外。对每个肾脏的一半进行组织病理学分析。对每个肾脏的剩余一半进行处理，以测定Hyp和Pro水平。

博莱霉素诱导的肺纤维化研究

总共有40只雄性C57BL/6小鼠（23-26 g）被分配到四个博莱霉素治疗的纤维化组中的一个组（10只小鼠/组），并用FG-3019（3、10或30 mg/kg）或载体（对照组）治疗。在第一个给药日，小鼠接受腹腔注射载体或FG-3019，2小时后在异氟醚麻醉下接受气管内滴注博莱霉素（Bristol-Myers Squibb，Princeton，NJ，USA），剂量为0.08 U/50μL/只小鼠[24,47]. 另一个非纤维化对照组由10只小鼠组成，气管内滴注生理盐水，并用溶媒治疗。此后，小鼠每隔一天接受一次载体或FG-3019，共给药七次。在给药期间，每天观察小鼠，每周大约测量三次体重。与生理盐水非博莱霉素对照组相比，所有博莱霉素治疗组的动物体重都有所减轻，但治疗组之间的最终体重没有显著差异。类似地，博来霉素相关的死亡率在暴露于该药剂的组之间是相似的。博莱霉素滴注14天后，用异氟醚麻醉存活的小鼠。从腹部静脉采集血液，置于锂肝素管中，在4°C下旋转，然后在-70°C下冷冻血浆，以随后测定FG-3019浓度。所有解剖的肺叶迅速脱离非实质组织，灌注冰镇盐水，并在105°C的6mol/l HCl中水解22小时，然后通过高效液相色谱（HPLC）氨基酸分析测定全肺Hyp。该模型中总肺Hyp的标准测量值控制了与气管内滴注相关的博莱霉素损伤的偶尔不一致分布。由于局部博莱霉素损伤的不均匀性，未采集组织学样本。

TGF-β/CTGF协同作用研究

使用了10只怀孕的雌性Balb/c小鼠，五个实验组各分配了两只母鼠，每组提供7到10个新生儿。在每组中，新生儿接受最多两种细胞因子和载体或FG-3019治疗，如下所示：无细胞因子载体治疗对照（健康对照；n个=10名新生儿）；TGF-β2与载体(n个=7名新生儿）；CTGF和车辆(n个=7名新生儿）；TGF-β2、CTGF和载体(n个=10名新生儿）；和TGF-β2、CTGF和FG-3019(n个=8名新生儿）。

1日龄小鼠第一次腹腔注射FG-3019（1.84 mg/kg）或载体（体积均为0.05 mL），1小时后腹腔注射重组人TGF-β2（300μg/kg）和/或CTGF（300μg/kg），体积为0.05 mL。该给药方案连续20天每天一次。两只小鼠死亡：一只在CTGF组（第10天），另一只在联合使用TGF-β2和CTGF的组（第21天，计划终止前）。在最后一次服用FG-3019后的第二天，称量存活小鼠的体重，并在采血后处死小鼠，以测定血浆FG-3019浓度。采集器官进行组织病理学分析（肾脏和肝脏），并测定总Hyp和Pro（肾脏、肺、肝脏和心脏）。

Hyp和Pro测定

羟脯氨酸和脯氨酸用帕尔梅里尼法测定等. [48]，不同之处在于用L-ζ-2-羧酸（Sigma-Aldrich，St-Louis，MO，USA）代替3，4-二氢脯氨酸作为内标物。组织在105°C的6M HCl中水解22小时。样品经柱前衍生o（o）-邻苯二甲醛和4-氯-7-硝基苯并呋喃（Sigma-Aldrich）形成脯氨酸和羟脯氨酸的荧光加合物。荧光加合物通过反相高效液相色谱法分离和测定，然后进行荧光检测。

组织学分析

组织切片由授权病理学家（Comparative Biosciences，Inc.）以非盲法独立检查。在双细胞因子协同研究中，组织切片用苏木精和伊红染色，并用三色染色，如结果所示，每个被检查器官的主观但相对的纤维化严重程度评分为0-4，微量纤维化的小病灶区域构成“最小”纤维化，成纤维细胞和细胞外基质堆积的更大多灶（即非弥散性）区域构成“中度”纤维化。

试验品

从为此目的衍生的重组CHO细胞系中克隆、表达和纯化FG-3019。对于博莱霉素和UUO研究，FG-3019是在由25 mmol/l l-组氨酸和137 mmol/l氯化钠组成的载体溶液中制备的，pH值为6.0。对于TGF-β和CTGF协同研究，FG-3019是在磷酸盐缓冲盐水中制备的（PBS；Cellgro™，Mediatech，Herndon，VA，USA）。大肠杆菌-衍生TGF-β2和杆状病毒衍生重组人CTGF[49]也在PBS载体中制备。

免疫学方法

免疫印迹按照标准的western印迹方法进行。分别使用FG-3019或针对CYR61或NOV的多克隆抗血清来测定抗体制剂对杆状病毒衍生的重组人CTGF、CYR六十一和NOV的相对亲和力。兔多克隆抗NOV和抗CYR6.1抗血清是Maryvonne Laurent博士（法国巴黎圣安托万医院）慷慨捐赠的和Ruth Lupu（加州大学伯克利分校；加州伯克利，美国）。为了测定FG-3019的相对暴露，使用外显子3（VWC同源域）CTGF肽捕获FG-3019，然后用与碱性磷酸酶相关的山羊抗人IgG检测，通过夹心ELISA法测定血浆FG-3019抗体浓度。

统计分析

使用Sigma Stat程序（SPSS Science，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行统计分析。用Fisher最小显著性差异检验对连续数据进行单因素方差分析，比较各组间的差异。常规组织学纤维化评分通过非参数Kruskal-Wallis统计和Dunn多重比较事后检验进行分析。Fisher精确检验用于分析2×2的偶然数据，以确定是否存在组织纤维化。在UUO研究中，将所有组未受损对侧对照肾脏的Hyp:Pro比值与健康对照组进行汇总。P（P）<0.05被认为具有统计学意义，除非另有说明，否则组内分布表示为平均值±SEM。

竞争性利益

所有作者均为FibroGen的现任员工，或在进行研究时为Fibro Gen的员工。

作者的贡献

动物研究由QW、GG、BN和WZ设计和执行，WU、JG、MB、LX和TS提供输入、材料和支持分析。TS负责协调手稿的编写。NO、AL和DY监督研究。所有作者阅读并批准了最终手稿。

致谢

我们感谢K.Lea Sewell和Saniya Fayzullina在手稿准备方面的协助，以及Mark Sternlicht对手稿编辑和补充统计分析的关键贡献。

工具书类

  • Kochanek KD、Murphy SL、Anderson RN、Scott C.Deaths:2002年最终数据。国家生命统计代表。2004;53:1–115.[公共医学][谷歌学者]
  • Bitterman PB，Henke CA。纤维增殖性疾病。胸部。1991;99：81–84秒。doi:10.1378/chest.99.3_补充81S。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Leask A，Abraham DJ。TGF-{beta}信号转导与纤维化反应。美国财务会计准则委员会J。2004;18:816–827. doi:10.1096/fj.03-1273修订版。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • De Winter P，Leoni P，Abraham D.结缔组织生长因子：镶嵌多功能蛋白质的结构-功能关系。生长因子。2008;26:80–91. doi:10.1080/08977190802025602。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Brigstock DR。阻断结缔组织生长因子（CCN2）成纤维作用的策略：从体外药理抑制到体内靶向siRNA治疗。J单元通信信号。2009;三：5–18.doi:10.1007/s12079-009-0043-9。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Cicha I，Goppelt-Struebe M.结缔组织生长因子：环境依赖性功能和调节机制。生物因子。2009;35:200–208. doi:10.1002/biof.30。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • 结缔组织生长因子（CCN2），糖尿病肾病的致病因子。它做什么？它是如何做到的？J单元通信信号。2009;三:95–104. doi:10.1007/s12079-009-0038-6。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Shi-wen X，Leask A，Abraham D.结缔组织生长因子/CCN2在组织修复、瘢痕形成和纤维化中的调节和功能。细胞因子生长因子评论。2008;19:133–144. doi:10.1016/j.cytogfr.2008.01.002。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Abreu JG、Ketpura NI、Reversade B、De Robertis EM。结缔组织生长因子（CTGF）通过BMP和TGF-β调节细胞信号。自然细胞生物学。2002;4:599–604. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 齐伟，陈X，Twigg S，Zhang Y，Gilbert RE，Kelly DJ等。结缔组织生长因子和转化生长因子-beta1对肾小管细胞Smad7的差异调节。肾脏病学（卡尔顿）2007;12:267–274. doi:10.1111/j.1440-1797.2007.00788.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Wahab NA，Weston BS，Mason RM。CTGF/CCN2对系膜细胞TGFbeta/Smad信号通路的调节。实验细胞研究。2005;307:305–314. doi:10.1016/j.yexcr.2005.03.022。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • George J，Tsutsumi M.siRNA-介导的结缔组织生长因子敲除可预防N-亚硝基二甲胺诱导的大鼠肝纤维化。基因疗法。2007;14:790–803. doi:10.1038/sj.gt.3302929。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • 李刚，谢强，石毅，李德，张敏，江S.等。siRNA抑制结缔组织生长因子预防大鼠肝纤维化。基因医学杂志。2006;8:889–900. doi:10.1002/jgm.894。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • 罗国浩，卢永平，宋杰，杨莉，石永杰，李永平。小干扰RNA抑制结缔组织生长因子可预防慢性移植物肾病大鼠肾纤维化。移植程序。2008;40:2365–2369. doi:10.1016/j.transproceed.2008.07.100。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Guha M，Xu ZG，Tung D，Lanting L，Natarajan R。结缔组织生长因子的特异性下调可减轻1型和2型糖尿病小鼠模型的肾病进展。美国财务会计准则委员会J。2007;21:3355–3368. doi:10.1096/fj.06-6713com。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Yokoi H、Mukoyama M、Nagae T、Mori K、Suganami T、Sawai K等。通过反义治疗减少结缔组织生长因子可改善肾小管间质纤维化。《美国肾脏病杂志》。2004;15:1430–1440. doi:10.1097/01.ASN.0000130565.69170.85。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Okada H、Kikuta T、Kobayashi T、Inoue T、Kanno Y、Takigawa M等。肾小管上皮中表达的结缔组织生长因子在肾纤维化形成中起着关键作用。《美国肾脏病杂志》。2005;16:133–143. doi:10.1681/ASN.2004040339。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Uchio K，Graham M，Dean NM，Rosenbaum J，Desmouliere A.实验性肝纤维化期间结缔组织生长因子反义寡核苷酸对结缔组织增长因子和I型胶原mRNA表达的下调。伤口修复再生。2004;12:60–66. doi:10.1111/j.1067-1927.2004.01212.x-1。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Sisco M、Kryger ZB、O'Shaughnessy KD、Kim PS、Schultz GS、Ding XZ。等。结缔组织生长因子（CTGF/CCN2）mRNA的反义抑制限制了增生性瘢痕形成，而不影响体内伤口愈合。伤口修复再生。2008;16:661–673. doi:10.1111/j.1524-475X.2008.00416.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Mazaheri MK，Schultz GS，Blalock TD，Caffee HH，Chin GA。结缔组织生长因子在乳房植入弹性体囊形成中的作用。Ann Plast外科。2003;50:263–268. doi:10.1097/01.SAP.000046781.75625.69。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Mori T、Kawara S、Shinozaki M、Hayashi N、Kakinuma T、Igarashi A等。结缔组织生长因子与转化生长因子β在持续性纤维化中的作用和相互作用：小鼠纤维化模型。细胞生理学杂志。1999;181:153–159. doi:10.1002/（SICI）1097-4652（199910）181:1<153:：AID-JCP16>3.0.CO；2-K型。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Sato M、Muragaki Y、Saika S、Roberts AB、Ooshima A。靶向阻断TGF-beta1/Smad3信号通路可预防单侧输尿管梗阻引起的肾小管间质纤维化。临床投资杂志。2003;112:1486–1494. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 兰海、穆伟、富田N、黄学瑞、李建华、朱焕杰。等。在大鼠UUO模型中，使用超声微泡系统通过基因转移可诱导Smad7抑制肾纤维化。《美国肾脏病杂志》。2003;14:1535–1548. doi:10.1097/01.ASN.0000067632.04658.B8。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Cutroneo KR、White SL、Phan SH、Ehrlich HP。通过调节TGF-β1诱导的胶原基因表达治疗博莱霉素诱导的肺纤维化。细胞生理学杂志。2007;211:585–589. doi:10.1002/jcp.20972。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Fishwild DM、O'Donnell SL、Bengoechea T、Hudson DV、Harding F、Bernhard SL等。来自新型微基因座转基因小鼠株的高亲和力人IgGκ单克隆抗体。国家生物技术。1996;14:845–851. doi:10.1038/nbt0796-845。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Harding PA，Surveyor GA，Brigstock DR。猪结缔组织生长因子（CTGF）cDNA、mRNA和子宫组织蛋白的表征。DNA序列。1998;8:385–390.[公共医学][谷歌学者]
  • Higgins DF、Lappin DW、Kieran NE、Anders HJ、Watson RW、Strutz F.等。DNA寡核苷酸微阵列技术在小鼠单侧输尿管梗阻（UUO）后识别fisp-12和其他潜在的成纤维基因：上皮-间质转化过程中的调制。肾脏Int。2003;64:2079–2091. doi:10.1046/j.1523-1755.2003.00306.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Lasky JA、Ortiz LA、Tontat B、Hoyle GW、Corti M、Athas G.等。结缔组织生长因子mRNA表达在博莱霉素诱导的肺纤维化中上调。美国生理学杂志。1998;275：L365–L371。[公共医学][谷歌学者]
  • Leask A，Parapuram SK，Shi-wen X，Abraham DJ。结缔组织生长因子（CTGF，CCN2）基因调控：纤维增生性疾病的有效临床生物标志物？J单元通信信号。2009;三:89–94. doi:10.1007/s12079-009-0037-7。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Igarashi A、Nashiro K、Kikuchi K、Sato S、Ihn H、Fujimoto M等。局部硬皮病、瘢痕疙瘩和其他纤维化皮肤疾病组织切片中结缔组织生长因子基因的表达。皮肤病学投资杂志。1996;106:729–733. doi:10.1111/1523-1747.ep12345771。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Adler SG、Kang SW、Feld S、Cha DR、Barba L、Striker L.等人。人类1型糖尿病肾小球mRNAs能否用于预测正常白蛋白尿向微量白蛋白尿的转变？美国肾脏病杂志。2002;40:184–188. doi:10.1053/ajkd.2002.33928。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Paradis V，Perlemuter G，Bonvoust F，Dargere D，Parfait B，Vidaud M.等人。高糖和高胰岛素血症刺激结缔组织生长因子表达：非酒精性脂肪性肝炎纤维化进展的潜在机制。肝病学。2001;34:738–744. doi:10.1053/jhep.2001.28055。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Maher TM，Wells AU.迷失在翻译中；从肺纤维化动物模型到人类疾病。呼吸学。2009;14:915–916. doi:10.1111/j.1440-1843.2009.01618.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Ikawa Y，Ng PS，Endo K，Kondo M，Chujo S，Ishida W.等人。中和人结缔组织生长因子单克隆抗体可改善转化生长因子-β诱导的小鼠纤维化。细胞生理学杂志。2008;216:680–687. doi:10.1002/jcp.21449。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Chujo S、Shirasaki F、Kawara S、Inagaki Y、Kinbara T、Inaoki M.等。结缔组织生长因子导致小鼠纤维化模型中转化生长因子β诱导的持续原α2（I）胶原基因表达。细胞生理学杂志。2005;203:447–456. doi:10.1002/jcp.20251。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • 齐伟，Twigg S，Chen X，Polhill TS，Poronnik P，Gilbert RE等.转化生长因子的综合作用-{测试}1结缔组织生长因子在肾纤维化中的作用。美国生理学杂志肾生理学。2005;288：F800–F809。doi:10.1152/ajprenal.00179.2004。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Duron JJ、Silva NJ、du Montcel ST、Berger A、Muscari F、Hennet H等。粘连性术后小肠梗阻：手术治疗后复发的发生率和危险因素：一项多中心前瞻性研究。安·苏格。2006;244:750–757. doi:10.1097/01.sla.0000225097.60142.68。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Thaler K、Mack JA、Zhao RH、Berho M、Grotendorst GR、Duncan MR等。腹腔粘连中结缔组织生长因子的表达。直肠结肠疾病。2002;45:1510–1519. doi:10.1007/s10350-004-6459-7。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Zarinkalam KH，Stanley JM，Gray J，Oliver N，Faull RJ。腹膜透析患者腹膜腔中的结缔组织生长因子及其调节。肾脏Int。2003;64:331–338. doi:10.1046/j.1523-1755.2003.00069.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Booth AJ、Csencsits-Smith K、Wood SC、Lu G、Lipson KE、Bishop DK。结缔组织生长因子促进慢性心脏移植排斥反应中TGF-beta和IL-6下游的纤维化。《美国移植杂志》。2010;10:220–230. doi:10.1111/j.1600-6143.2009.02826.x。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Ivkovic S、Yoon BS、Popoff SN、Safadi FF、Libuda DE、Stephenson RC。等。结缔组织生长因子在骨骼发育过程中协调软骨生成和血管生成。发展。2003;130:2779–2791. doi:10.1242/dev.00505。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Chen CC，Chen N，Lau LF。血管生成因子Cyr61和结缔组织生长因子在原代人皮肤成纤维细胞中诱导粘附信号传导。生物化学杂志。2001;276:10443–10452. doi:10.1074/jbc。M008087200。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Shimo T、Nakanishi T、Nishida T、Asano M、Kanyama M、Kuboki T等。结缔组织生长因子在体外诱导血管内皮细胞的增殖、迁移和管状形成，在体内诱导血管生成。生物化学杂志（东京）1999;126:137–145.[公共医学][谷歌学者]
  • Aikawa T，Gunn J，Spong SM，Klaus SJ，Korc M.结缔组织生长因子特异性抗体在胰腺癌原位小鼠模型中抑制肿瘤生长、转移和血管生成。摩尔癌症治疗。2006;5:1108–1116. doi:10.1158/1535-7163.MCT-05-0516。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Dornhofer N，Spong S，Bennewith K，Salim A，Klaus S，Kambham N.等人。结缔组织生长因子特异性单克隆抗体治疗抑制胰腺癌生长和转移。癌症研究。2006;66:5816–5827. doi:10.1158/008-5472.CAN-06-0081。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Bennewith KL、Huang X、Ham CM、Graves EE、Erler JT、Kambham N.等人。肿瘤细胞衍生结缔组织生长因子（CTGF/CCN2）在胰腺肿瘤生长中的作用。癌症研究。2009;69:775–784. doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-0987。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Wang Q，Wang Y，Hyde DM，Gotwals PJ，Lobb RR，Ryan ST等。整合素α4抗体对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响。生物化学药理学。2000;60:1949–1958. doi:10.1016/S0006-2952（00）00491-3。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Palmerini CA、Fini C、Floridi A、Morelli H、Vedovelli A。血浆中游离羟脯氨酸和脯氨酸以及尿液中游离和肽结合羟脯氨酸的高效液相色谱分析。J色谱法。1985;339:285–292. doi:10.1016/S0378-4347（00）84655-1。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Segarini公关、Nesbitt JE、Li D、Hays LG、Yates JR III、Carmichael DF。低密度脂蛋白受体相关蛋白/α2-巨球蛋白受体是结缔组织生长因子的受体。生物化学杂志。2001;276:40659–40667. doi:10.1074/jbc。M105180200。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • O'Leary JM、Hamilton JM、Deane CM、Valeyev NV、Sandell LJ、Downing AK。胶原蛋白IIA中原型类脉络膜富含半胱氨酸重复序列（血管性血友病因子C型模块）的溶液结构和动力学。生物化学杂志。2004;279:53857–53866.[公共医学][谷歌学者]
  • Perbal B.NOV（肾母细胞瘤过度表达）和CCN基因家族：结构和功能问题。摩尔病理学。2001;54:57–79. doi:10.1136/mp.54.2.57。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
文章来自纤维生成与组织修复由以下人员提供BMC公司