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EMBO J。2000年9月1日；19(17): 4577–4588.
数字对象标识：10.1093/emboj/19.17.4577
预防性维修识别码：项目经理302054
PMID：10970851

磷脂酰肌醇3-磷酸在酵母和哺乳动物细胞中的定位

大卫·J·吉利,1 伊莎贝尔·C·莫罗,2,三 玛格丽特·林泽,2,三 罗伯特·古尔德,三 尼亚·布莱恩特,2 珍妮·米歇尔·高利尔,1 罗伯特·G·帕顿,2,三，4,一和哈拉尔德·斯坦马克1,4,一
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）调节几个重要的细胞过程，包括信号转导和膜转运。为了研究PI3K产物磷脂酰肌醇3-磷酸[PI（3）P]的细胞内定位，我们构建了一个由两个PI（3）P-结合FYVE结构域组成的探针。发现该探针与PI（3）P特异性结合，并具有高亲和力在体外和体内当在成纤维细胞中表达时，荧光显微镜检测到的标记探针定位于内体。未转染成纤维细胞的电子显微镜显示，PI（3）P在早期内体和多泡内体的内囊泡中高度富集。而缺乏PI3K活性的酵母细胞(第15版和第34版突变株）未标记，PI（3）P在野生型酵母的内胚体和液泡的腔内囊泡上发现。vps27Δ酵母细胞破坏了内体到液泡的转运，表现出液泡标记减少而内体标记增加。因此，PI（3）P遵循保守的管腔内降解途径，其产生、可及性和周转可能在确定早期内体和随后导致多泡内体形成的步骤中发挥关键作用。

关键词：电子显微镜/膜交通/多泡体/磷脂酰肌醇/PI 3-激酶

介绍

复杂细胞过程（如信号转导和膜转运）的时间和空间调控依赖于蛋白质向限制性细胞膜的可逆募集。磷脂酰肌醇（PI）的磷酸化衍生物，称为磷酸肌醇，通过结合（有时激活）特定蛋白质在这种招募中发挥关键作用(Corvera等人，1999年). 由于磷酸肌醇的功能是将蛋白质募集到特定的膜上，因此确定其细胞内定位显然是非常令人感兴趣的。到目前为止，这主要是通过表达绿色荧光蛋白（GFP）与显示磷脂酰肌醇选择性结合特征的pleckstrin同源结构域融合来实现的在体外以这种方式，磷脂酶Cδ1的PH结构域（PLC-δ1）被用作PI（4,5）P的探针2和ARNO或Bruton酪氨酸激酶的PH结构域被用于检测PI（3,4,5）P三(Stauffer等人，1998年;瓦尔奈和巴拉，1998年;Venkateswalu等人，1998年;Hirose等人，1999年;Várnai等人，1999年). 虽然这些研究表明PI（4,5）P的存在2和PI（3,4,5）P三在质膜上，他们的解释因几个问题而变得复杂。首先，有人认为，除了磷脂酰肌醇外，PH结构域对膜的补充可能取决于与其他决定因素的结合。例如，虽然PLC-δ1 PH结构域靶向质膜，但氧甾醇结合蛋白的PH结构区对PI（4,5）P具有相似的亲和力和特异性2 在体外，针对高尔基体(莱文和蒙罗，1998年). 其次，通过荧光显微镜检测GFP–PH融合蛋白所需的高水平表达可能会影响磷脂酰肌醇的分布。第三，光镜下的分辨率不足以精确定位任何磷脂酰肌醇。第四，荧光显微镜无法定量评估磷脂酰肌醇水平。

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）的产物因其在信号转导、膜转运、细胞骨架调节和凋亡中的重要性而受到特别关注(利弗斯等., 1999;Rameh和Cantley，1999年). PI（3,4,5）P三在哺乳动物细胞的激动剂刺激下产生，并与许多含有PH域的蛋白质相互作用(Rameh和Cantley，1999年). 相反，PI（3）P是在酵母和哺乳动物细胞中组成性产生的，并与含有FYVE指状结构域的蛋白质结合(Stenmark和Aasland，1999年). 为了了解FYVE指蛋白的功能，其中一些已被证明在生理学和细胞生物学中发挥关键作用(斯坦马克和阿斯兰，1999年)，必须在细胞内定位PI（3）P。荧光显微镜显示早期内吞体自身抗原EEA1的C末端部分(亩等., 1995)包含FYVE指状结构域，靶向早期内体(斯滕马克等., 1996;Burd和Emr，1998年;戈利耶等., 1998;帕奇等., 1998). 然而，由于这种靶向性还需要一个与早期内体GTPase Rab5结合的邻近结构域(斯滕马克等., 1996;西蒙森等1998年;劳厄等., 2000)这只提供了早期内体上存在PI（3）P的间接证据，而没有关于其他膜上是否存在PI（3P的信息。在这里，我们使用生物化学和形态分析来表征对PI（3）P具有独特特异性的新探针。我们使用该探针来确定PI（3”P在哺乳动物和酵母细胞中的定位。我们现在发现，PI（3）P存在于早期内胚体的限制膜上，此外，也存在于多泡内胚体和酵母液泡的内囊泡上。

结果

双FYVE手指与PI（3）P具有高亲和力和特异性

我们考虑了使用FYVE手指衍生结构作为PI（3）P探针的可能性。EEA1的分离FYVE-手指显然不适合作为PI（3P探针(Stenmark等人，1996年;Lawe等人，2000年)可能是因为它结合亲和力过低的PI（3）P。因此，我们研究了受体酪氨酸激酶底物Hrs的FYVE指(Komada和Kitamura，1995年)可以用于此目的。然而，与EEA1 FYVE指一样，Hrs的FYVE-指在细胞中表达时主要是细胞溶质的（数据未显示）。因此，我们构建了一个Hrs（2×FYVE）的双FYVE-指，其原理是这应该与PI（3）P有更大的亲和力在体外实验中，由GST和2×FYVE组成的融合蛋白与含PI（3）P的脂质体紧密结合，最大结合率为～0.5%（图1A） ●●●●。即使在极低的PI（3）P浓度（0.05%）下，也可以检测到2×FYVE的显著结合，而不是单个FYVE-手指。我们还发现2×FYVE不与含有任何其他磷脂酰肌醇的脂质体结合（图1B） 和一个点突变（C215S）(Gaullier等人，1998年)将其引入FYVE的两个组成手指中，完全消除了PI（3）P结合（图1C） ●●●●。为了比较GST–FYVE和GST–2×FYVEs的结合动力学，我们使用表面等离子体共振研究了它们与PI（3）P的结合。传感器表面涂有含有2%PI（3）P的混合磷脂，并在添加GST融合蛋白后记录传感器图像。尽管Hrs的FYVE指被提议作为二聚体与PI（3）P相互作用(Mao等人，2000年)，GST–FYVE与PI（3）P的相互作用表现出1:1结合的Langmuir缔合和解离动力学特征K（K）D类38±19 nM（图1D） ●●●●。相比之下，GST–2×FYVE表现出更复杂的结合/解离动力学，可适用于二价结合模型（图1E） ●●●●。由于GST-2×FYVE的复杂动力学，很难在两种探针之间进行直接比较，但很明显，GST-2 x FYVEs的解离动力学较慢于GST-FYVE。因此，一个GST–2×FYVE分子与两个PI（3）P分子相互作用的能力可能解释了其与GST–FYVEs相比具有更高的PI（3P结合能力。

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图1。2×FYVE与PI（3）P.（A–C）高亲和力特异结合(戈利耶等., 1998)固定在谷胱甘肽-Sepharose珠上，然后在三H标记脂质体含有：(A类)PI（3）P的0.05–2.0%(B类)以下所示肌醇脂质的0.2%或(C类)0.2%PI（3）P。所有数值均为一式三份的多次实验的平均值±SEM。1，π；2，PI（4）P；3、PI（5）P；4，PI（3）P；5，PI（3,4）P2; 6，PI（3,5）P2; 7，PI（4,5）P2; 8，PI（3,4,5）P三. (D类)GST–FYVE或(E类)将GST–2×FYVE注入装有含有2%PI（3）P的脂质体的传感器芯片中。显示了GST融合蛋白指示浓度（µM）下的传感器图谱。

转染2×FYVE作为PI（3）P的特异性探针

为了确定2×FYVE能否作为PI（3）P的探针，我们检测了其在瞬时转染BHK细胞中的分布(西蒙森等.，1998年a)共聚焦免疫荧光显微镜。当myc表位标记的2×FYVE与来自PLCδ1的GFP标记的PH结构域共同表达时，2×FYVE定位于细胞内的囊泡结构，而GFP–PLC-δ1–PH主要定位于质膜(斯塔弗等., 1998)（图2A） ●●●●。来自EEA1的2×FYVE构建物也获得了类似的结果，尽管囊泡染色有些模糊（数据未显示）。通过双杂交分析和共表达实验，我们检测到2×FYVE结构体与其天然蛋白（即EEA1和Hrs）没有结合（数据未显示）。用沃特曼素（一种公认的PI3K抑制剂）培养细胞，消除了2×FYVE在细胞内囊泡结构上的定位（图2，比较C和B）。同样，干扰PI（3）P结合的点突变(戈利耶等., 1998)当引入2×FYVE时，取消了膜定位（图2D） 或两者兼而有之（图2E） 其组成FYVE手指。这些结果表明，由于与PI（3）P结合，2×FYVE构建体与囊泡膜相关。

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图2。表达2×FYVE细胞的共焦荧光显微镜。用2×FYVE构建物转染BHK细胞，然后用皂苷渗透并固定共焦显微镜。(A类)myc-2×FYVE（红色）和GFP-PLCδ1（绿色）。（B和C）myc-2×FYVE（红色）(B类)和存在(C类)100纳米的沃特曼宁作用30分钟。（D和E）myc-2×FYVE（红色），带单个(D类)或双倍(E类)C215S突变。(F类)myc-2×FYVE（红色）和内源性甘露糖6-磷酸受体（绿色）。(G公司和H（H）)×FYVE（红色）和内源性EEA1（绿色）。(J型)GFP-2×FYVE（绿色）和内源性LBPA（红色）。(K（K）和L（左）)myc-2×FYVE（红色）和内源性EEA1（绿色）。在合并图像（A、F、I和J）中，黄色表示2×FYVE和细胞器标记分子之间的共定位。（K）和（L）中的箭头指向一个膨胀的液泡结构，其中含有高水平的2×FYVE和低水平的EEA1。棒材，5µm。细胞核用“n”表示。

然后将2×FYVE的定位与各种细胞器标记的定位进行比较。myc-或GFP-标记的2×FYVE与内源性EEA1广泛共定位(Mu等人，1995年)是早期内体的一个特征明确的标记（图2G–I）。然而，2×FYVE没有与被测膜室的任何其他标记（包括高尔基标记、甘露糖苷酶II（未显示）、反式-高尔基网络/晚期内体标记，甘露糖-6-磷酸受体（图2F） 、晚期内体/溶酶体标记LAMP-1（未显示）和晚期内体标记溶血磷脂酸（LBPA）(小林等，1998年)（图2J） ●●●●。

为了研究2×FYVE是否能与内源性FYVE-指蛋白竞争PI（3）P结合，我们检测了EEA1在高水平表达2×FYVE的细胞中的定位。而内源性EEA1在低表达时与2×FYVE共定位（图2K和L，右细胞），EEA1似乎部分从高水平表达2×FYVE的细胞膜上移位（图2K和L，左侧单元格）。共焦图像的量化支持了这一点，这表明2×FYVE信号相对增加约2.5倍，EEA1信号减少约3倍（未显示）。此外，2×FYVE强阳性的结构比正常的内体大得多，并且具有空泡状外观（图2五十、 插图）。它们可以被标记为内吞Alexa–transferrin（未显示），表明它们是内吞来源。这种效果让人想起沃特曼宁治疗，它从膜中释放FYVE指状蛋白，并导致内涵体空泡化(帕奇等., 1997;费尔南德斯·博尔贾等., 1999;Komada和Soriano，1999年). 随着转染时间的延长，2×FYVE阳性内体的大小增加，EEA1标记减少（未显示），我们也可以在高表达细胞中检测到核标记（图中左侧细胞2五十） ●●●●。下面讨论了这种标签的可能相关性。

2×FYVE探针可用于检测未转染细胞中的PI（3）P

高水平的2×FYVE表达导致内体形态的改变，这一发现强调了与使用转染的磷酸肌醇探针相关的潜在注意事项。因此，我们研究了2×FYVE探针是否可以用于检测未转染细胞中的PI（3）P。为此，我们在固定前通过冷冻-解冻使BHK细胞渗透，并用生物素化GST–2×FYVE和Cy3–链霉亲和素对细胞进行染色。如图所示三A、 检测到囊泡结构的强烈标记，而未渗透细胞没有标记（图三D） ●●●●。GST–2×FYVE标签与EEA1标签广泛重叠（图三B和C），表明该探针可用于直接检测内体上的PI（3）P。与此一致的是，在细胞固定前用100 nM沃特曼蛋白孵育30分钟，标记显著减少（未显示）。然而，我们不能排除2×FYVE可能只在特定的细胞环境中识别PI（3）P的可能性，例如与内体蛋白相关。为了研究这一点，我们研究了用含PI（3）P的脂质体预先培养的未渗透细胞的标记，以便将PI（3。当这些细胞用2×FYVE探针染色时，可以观察到强烈的质膜标记（图三E） ●●●●。相反，仅用缓冲液培养的细胞中未检测到标记（图三D） 或含有PI（3,4）P的脂质体2（图三F） 或PI（3,4,5）P三（图三G） ●●●●。这表明2×FYVE探针检测细胞相关的PI（3）P，而不是与内体特异性分子结合。这些数据也证实了2×FYVE探针对PI（3）P的高度特异性。

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图3。以GST–2×FYVE为探针对未转染BHK细胞进行共焦荧光显微镜观察。盖玻片上的BHK细胞通过冷冻-解冻渗透(A类——C类)或保持不渗透(D类——G公司). 将未经渗透的细胞在37°C下，在单独的缓冲液（D）或含有10%PI（3）P（E）、PI（3,4）P的脂质体存在下培养10分钟2（F） 或PI（3,4,5）P三（G） ●●●●。固定前对细胞进行广泛清洗。盖玻片分别用生物素化GST–2×FYVE（A和D–G）或抗EEA1（B）染色，然后用Cy3–链霉亲和素或FITC–抗IgG染色。合并图像中的黄色（C）表示共同定位。棒材，5µm。细胞核用“n”表示。

2×FYVE电子显微镜显示早期内胚体和腔内小泡上的PI（3）P

为了研究PI（3）P在超微结构水平上的分布，我们试图开发一种包埋后，就地定位这种脂质的标记方法。这种方法避免了细胞渗透和与预包埋标记相关的其他可能的伪影，是定位蛋白质和脂质的首选方法。重要的是，它还允许定量估计蛋白质或脂质的分布，假设在不同的隔室中具有相似的标记效率。然而，迄今为止，由于特定脂质探针的可用性和脂质滞留的困难，脂质定位受到了限制。将超薄冰冻切片（～60 nm）与多聚甲醛（PFA）或PFA/戊二醛固定BHK细胞或原代人成纤维细胞的冷冻替代低温包埋低分子切片进行比较。用GST–2×FYVE探针培养切片，清洗并固定。用抗GST抗体检测GST-2×FYVE，然后检测蛋白A-金。GST–2×FYVE探针标记的两种冷冻的离散内吞膜（图​（图44和​和5）5)和lowicryl切片（结果未显示）。由于冰冻切片提供了更具体的标签，因此在所有进一步的研究中都使用了这些标签。为了测试标记的特异性，用相同浓度的特异性探针GST–2×FYVE和以下对照探针对切片进行平行标记：单独使用GST和2×FYVEc215秒。控制探针的标记可以忽略不计（未显示结果）。含有PI（3）P或PI（3,4,5）P的脂质体冷冻微丸超薄切片的标记三也显示了PI（3）P标记的特异性（数据未显示）。

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图4。以GST–2×FYVE为探针对PI（3）P进行电镜定位。将PFA/戊二醛固定BHK细胞的超薄冰冻切片解冻并与GST–2×FYVE孵育。清洗和固定后，用GST抗体培养切片，然后用10nm蛋白A-金培养。(A类)低功耗概述，证明FYVE标签的特异性。特异性标记与多泡内体和细胞核的离散区域有关（箭头所示）。低或可忽略的标记与高尔基复合体（G）、围绕细胞核（N）和线粒体（M）的核膜有关。（D–G）显示早期内体特异标记的高倍显微照片(D类; 可通过形态和清晰的细胞质外衣、箭头和多泡内体识别(B类和C类，箭头；和E类——G公司). 请注意，高尔基复合体（G）和质膜（PM）的标记可以忽略不计。多泡内体显示标记集中在内膜上（E和F中的箭头），限制膜标记较低。条形（A）、（C）和（G），500 nm；（B） 、（D）、（E）和（F），200 nm。

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图5。如图图例所示，使用2×FYVE探针标记PI（3）P的早期和晚期内体定位4或带有EEA1抗体（C，插图）。固定前，将（A–E）中的BHK细胞与5 nm BSA–金在37°C下孵育30分钟(格里菲斯等., 1989). (A类——D类)用2×FYVE探针标记的早期内体的代表性例子（大金；所有面板中的小箭头表示）和内化的5 nm BSA–金。典型的管状囊泡内体和环状早期内体，中央区域（星号）透光，周围有双层膜池。标记与多泡区（B和C）、池区的细胞质面（C和D，插图）和内池膜有关（见C中指示内膜的箭头）。标记也与BSA-金标记的小管有关（见D；大箭头表示外周BSA-金标记的小管）。注意，多泡内体（假定的内体载体囊泡）不含内化金，该内化金用2×FYVE探针（A，大箭头）严重标记。EEA1标记（C，插图，箭头）主要与BSA的细胞质表面相关，即金标记的早期内体。（E和F）晚期内体。(E类)一个BSA–金色标记的晚期内体，显示整个多泡结构的标记。一个标签很重的小泡也很明显（大箭头）。(F类)对照BHK细胞切片用LBPA特异性抗体（10 nm金）和2×FYVE探针（15 nm金）标记。LBPA的标记集中在大型晚期内体的电子透射区。相反，2×FYVE标记（箭头）集中在LBPA标记较低且膜轮廓更明显的区域。棒材，主面板，200 nm；插图，100 nm。

鉴于探针的高度特异性，我们继续检测PI（3）P的亚细胞分布。质膜（图4C和G），高尔基复合体（图4A和B），核膜（图4A和G）、线粒体和其他内膜显示PI（3）P标记较低（表我). 相比之下，早期的内胚体，通过其管状软骨形态识别（图4D） ，EEA1标签（图5C、 插入）和内化标记（图5A–D），显示2×FYVE探针的特异性标记（与线粒体相比，每体积约11倍富集或每膜面积5倍富集；见表我). 评估2×FYVE标记相对于早期内胚体系统不同膜（小管、环形池和多泡区）的分布；参见格里菲斯等., 1989)，牛血清白蛋白（BSA）-金在37°C下内化10分钟（未显示）或30分钟。后者是填充早期内吞体系统所必需的，但也会引起后期内吞体的标记，这些标记可以从形态学上进行区分。2×FYVE探针标记了早期内体的细胞质表面（约为早期内体金标记的50%），即环形池的“内层”膜（见图中的箭头）5C以及图4D） 和早期内体的多泡区（图​（图4D4D和​和5C）。5C） ●●●●。相反，EEA1标记仅在早期内体的细胞质表面上观察到（例如图5C类；并查看威尔逊等., 2000).

表一。

BHK细胞超薄冰冻切片上2×FYVE金标记的定量分析
功能%与特征相关的黄金（±SEM）每卷相对标签一每个膜面积的相对标签b条
核65 (± 8)2.5——
核外壳0.9 (± 0.3)——0.52
线粒体2.9 (± 0.2)11
早期内体c（c）   
 全部的5.9 (± 4.1)11.44.7
 限制膜3.2 (± 2.1)  
 内膜2.7 (± 2.0)  
多泡内体d日   
 全部的22（±8）15.33.6
 限制膜1.7 (± 1.9)  
 内膜20 (± 6)  
高尔基复合体0.8 (± 0.3)——0.55
质膜2.5 (± 0.9)——1.1

对40个完整细胞剖面上的金分布进行了量化。

一黄金标签与点数定义的隔间体积有关。金/体积与线粒体标记密度相关。

b条金标签与总膜（限制膜和内膜）相关，与交叉计数定义的隔间相关。与线粒体膜标记密度相关的金/膜面积。

c（c）由BSA定义的形态学——金标记和管状/囊泡状/环状形态学（见图​图4D4D和​和55A–D）。

d日包括所有多囊泡内体，包括假定的载体囊泡、晚期内体等（见图​图4A–C，4A–C，4E–G和​和55E–F）。

然而，最引人注目的标记与直径400–500 nm的球形多泡体（MVB）有关（图​（图44和​和5A）。5A） ●●●●。这些MVB中每个膜面积的金标记定量受到膜内紧密堆积的阻碍（见图4)但是，与线粒体相比，MVB中的标记密度显示出每体积浓缩15倍或每膜面积浓缩4倍（见表我). 定量分析表明，在定量范围内，早期内体和MVB膜内PI（3）P的密度相似。具有最高2×FYVE探针标签的MVB（例如，见图​图4A–C4A–C和E–G，以及​和5A）5A） 与多泡晚期内体相比，晚期内体标记物的标记较低（图5F） 在形态学上可分为内胚体载体囊泡（ECV），它是早期和晚期内胚体的中间产物(格伦伯格和麦克斯菲尔德，1995年). 值得注意的是，～90%的标记与MVB的内膜有关（表我). 这与细胞浆定向的PI（3）P向ECV内部募集一致（图4). 有趣的是，晚期内体显示溶酶体糖蛋白（未显示）和LBPA（图5F） ，通常显示较低的PI（3）P标记（图5E和F）而不是推定的ECV。PI（3）P标记出现在LBPA低水平的不同区域，在这些区域内内膜清晰可见（图5F） ●●●●。这表明晚期内体中可能存在两类不同的内膜，含有LBPA的内囊泡对溶酶体降解具有相对抗性(小林寺等., 1998).

除了用2×FYVE标记细胞质外，我们还注意到BHK细胞和人成纤维细胞的核仁内标记较高（图4A、 表我). 与细胞质标记一样，这种标记在单独使用GST或GST–2×FYVE孵育的切片中不存在C215S型探针（结果未显示），核标记对致密纤维成分具有高度特异性，而不是分散在整个细胞核中。这个观察结果与细胞核含有PI 3-激酶活性的事实一致(卢等., 1998)并提出了这种可能性，如PI（4,5）P2(博罗内科夫等., 1998)PI（3）P可能在核过程中发挥作用。如前所述，PI（4,5）P2，我们发现PI（3）P标记与核膜无关联。磷脂酰肌醇核库的生成、代谢和功能显然值得进一步研究(马拉尔地等., 1999).

PI（3）P在野生型和vps突变酵母中的定位

当液泡蛋白分选所需的基因产物在细胞膜转运中被证实时，PI（3）P参与了细胞膜转运酿酒酵母,视频处理34，被鉴定为产生PI（3）P的PI3K(Schu等人，1993年). 为了研究PI（3）P在酵母和哺乳动物之间的运输是否保守，我们标记了野生型的冰冻切片面包酵母用2×FYVE探针进行电子显微镜检查。液泡内有明显的高特异性标记，在某些情况下与内囊泡有关（图6B、 插图和C）。此外，标记与细胞质小泡有关，可能代表内质体中间产物（图6C） ●●●●。与哺乳动物细胞相比，在酵母细胞核内未观察到明显的标记，其他细胞器（例如线粒体或核膜）也显示出可忽略的标记。这表明，酵母中的PI（3）P与哺乳动物细胞中的一样，被内化到管腔内小泡中，正如Wurmser和Emr（1998）.

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图6。PI（3）P在野生型和突变酵母细胞中的电子显微镜定位。酿酒酵母将菌株固定并进行冷冻切片处理。图中显示了野生型（WT）细胞的典型示例(A类——C类),vps27Δ(D类和E类),第34版(F类)和第15版(G公司). 切片解冻并用GST–2×FYVE孵育。清洗和固定后，用GST抗体培养切片，然后用10nm蛋白A-金培养。（A和B）显示2×FYVE标记的特异性的概述。特异性标记与液泡（V）有关。低或可忽略的标记与质膜和其他细胞器有关。插图和（C）显示了液泡的高倍视图，其中一些标记与小的内囊泡（箭头）有关。标记也与细胞质小泡有关，其中一些小泡呈多泡状（C，箭头）。与野生型酵母相比第34版和第15版菌株用2×FYVE探针（F和G）标记很低，显示了探针的特异性。与野生型菌株相比，vps27Δ细胞在细胞质小泡（D和E，箭头所示）中显示出明显的标记积累，平均而言，空泡标记减少（见表我用于定量）。请注意，野生型细胞（A和B）的细胞轮廓之间有一些标记，这在第34版和第15版菌株，因此可能是由细胞破碎或脂质扩散引起的。N、 核心。棒材（A）和（D），200 nm；（B） ，（C）和（E–G），500 nm。

明确评估超薄切片切片标记的特异性体内我们检测了PI3K活性缺陷细胞的2×FYVE标记[第34版缺乏PI3K酶，以及第15版缺乏PI3K活化所需的Vps15p蛋白激酶(Stack等人，1995年)]. 与野生型菌株相比，在第34版突变体和第15版突变细胞（图6F和G，表二). 这证实了2×FYVE探针的特异性。

表二：。

酵母菌株电子显微镜2×FYVE标记的定量分析
相对于野生型酵母的FYVE总标签一
黄金分布；%相对于野生型酵母一（每个菌株占总菌落数的百分比b条)
应变黄金总量真空管Cyt Ves公司Cyt其他
野生型100%82.3 (82.3)9.2 (9.2)8.5（8.5）
vps27Δ76.5%50.0 (65.4)18.7 (24.4)7.9（10.3）
第34版10.9%4.5 (41.3)2.1 (19.3)4.2 (38.5)
第15版10.6%5.0 (47.2)1.6 (15.1)3.9 (36.8)

指示菌株蜡样葡萄球菌科固定在多聚甲醛中，然后进行冷冻切片。每个菌株的颗粒切片用2×FYVE–GST标记，然后用10 nm蛋白质A–金标记。通过随机选择细胞轮廓并测定空泡、细胞质小泡（Cyt-Ves）（包括多泡体和假定的电子透明内体）中的金含量进行定量，见图6)细胞质的其他区域（Cyt其他）。

一计数与相同数量野生型细胞中的总金相关（每个菌株20个细胞轮廓）。

b条括号中的数字显示与每个隔间相关的黄金数量，表示为与每个菌株相关的总黄金的分数。

为了进一步了解PI（3）P阳性细胞质小泡的性质及其推测的内体起源，我们还检测了PI（3vps27Δ单元格（图6D和E）。这些细胞具有经典的E类虚拟专用交换机由于到液泡的交通堵塞，缺陷积累了液泡前的内胚体中间产物(Raymond等人，1992年;Piper等人，1995年). 有趣的是，这些细胞的空泡标记显著减少，细胞质小泡标记增加（图6D和E，表二). 这与PI（3）P阳性细胞质小泡代表胞内中间产物的观点一致。野生型和虚拟专用交换机突变酵母细胞将此探针确立为一种高度通用的内吞标记，可用于多种生物体，并强调了PI（3）P在酵母到哺乳动物的内吞运输中的保守作用。

讨论

在这里，我们使用2×FYVE作为PI（3）P的特异探针，并且我们首次在酵母和哺乳动物细胞中显示了PI3K产物的超微结构定位。我们对2×FYVE作为探针的有效性进行了严格测试，结果表明，它可以用于PI（3）P的特异性检测：（i）如生化和电子显微镜所检测到的那样，它与PI（3P）膜具有高亲和力和特异性；（ii）阻止与PI（3）P结合的点突变抑制2×FYVE标记细胞；（iii）用PI3K抑制剂沃特曼（wortmannin）处理哺乳动物细胞，废除2×FYVE标记；（iv）用2×FYVE标记用PI（3）P而非其他PI3K产品预培养的细胞的质膜；和（v）野生型酵母细胞，但不是缺乏功能性PI3K的酵母细胞，被2×FYVE标记。

我们对PI（3）P的电子显微镜检测表明，在确定磷脂酰肌醇的定位时需要电子显微镜：从标记的2×FYVE转染细胞的荧光显微镜来看，基于与EEA1的高度共定位，我们可以得出PI（3。然而，为了揭示PI（3）P在MVB内囊泡的额外定位，需要进行电子显微镜检查。细胞细胞质内的转染探针可能无法接触MVB的内膜，特别是当内囊泡与MVB的限制膜分离时(米勒等., 1986;奥多里齐等., 1998). 另一方面，转染探针可能与内源性蛋白质有效竞争PI（3）P结合，而用于电子显微镜的GST–2×FYVE探针可能只检测到非门控PI（3。

通过检测早期内胚体和多泡内胚体管腔内小泡上的PI（3）P，我们可以提出PI（37). PI（3）P通过Rab5:GTP招募PI3K hvps34在早期内体或进入的内吞囊泡上生成(基督教等., 1999). 这通过与Rab5:GTP和PI（3）P的结合促进EEA1与早期内体的限制膜的结合(西蒙森等.，1998年b). 早期内体液泡区的限制膜向内萌芽，从细胞质表面去除PI（3）P，同时生成多泡区。这可能在物理上阻止细胞质蛋白与PI（3）P的结合。与此假设一致，我们在早期内体和内囊泡的细胞质表面上都检测到PI（3(亩等., 1995;威尔逊等., 2000; 本研究，图5). Rab5 GTP水解可能导致EEA1从膜上分离(西蒙森等.，1998年b)（可能由其他FYVE蛋白促进），这可能触发向内内陷。LBPA阳性晚期内体中PI（3）P的相对耗竭表明，含有PI（3。该模型与酵母的研究结果一致，表明液泡水解酶和PI（3）P 5-激酶活性参与了PI（3(加里等., 1998;Wurmser和Emr，1998年). 沃特曼宁阻断MVB形成的观察(费尔南德斯·博尔贾等., 1999)也与上述模型一致，提示PI（3）P可能对向内囊泡形成至关重要。此外，沃特曼素诱导EEA1从早期内体分离的动力学(帕奇等., 1997)与内体载体囊泡形成的动力学完全一致(格伦伯格和麦克斯菲尔德，1995年).

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图7。PI（3）P在内吞流量中的作用模型。（1） 内吞囊泡，不含EEA1(克里斯托福里迪斯等., 1999)，包含将Rab5:GDP转换为Rab5:GTP的活动(堀内等., 1995). （2） 囊泡在EEA1和其他蛋白质调节的过程中与早期内体（EE）融合(西蒙森等.，1998年b;麦克布莱德等., 1999). EE的限制膜富含PI（3）P，由Rab5:GTP介导的PI 3-激酶募集引起(基督教等., 1999)，以及在EEA1中，其通过与PI（3）P和Rab5:GTP的相互作用与EE结合(西蒙森等.，1998年b). （3） 在ECV上，Rab5对GTP的水解伴随着EEA1和Rab5:GDP的解离，PI（3）P被内化到腔内小泡中。（4） ECV与晚期内体（LE）融合（或成熟），其中PI（3）P被代谢。

这个就地本文描述的PI（3）P的检测为检测磷脂酰肌醇提供了一种新的强有力的方法，并为研究不同真核生物系统中的内吞流量提供了一个独特的工具。虽然我们专注于成纤维细胞和酵母细胞，但确定PI（3）P在其他细胞类型（如神经元和抗原呈递细胞）中的定位将是令人感兴趣的。此外，2×FYVE对PI（3）P的成功检测表明，可以设计类似的探针来确定其他磷脂酰肌醇的细胞内定位。这将大大提高我们对脂质信号的理解。

材料和方法

质粒和表达

所有FYVE构建物均采用PCR制备。本研究中使用的FYVE手指由小鼠Hrs的147-223残基组成(Komada和Kitamura，1995年). 2×FYVE由这个重复的域组成，链接器QGQGS将两个FYVE手指分开。我们还准备了EEA1的双FYVE手指(Mu等人，1995年)，由残基1325–1411组成，一式两份，由连接剂GSGN分离。用于使用T7 RNA聚合酶重组痘苗系统进行转染(Sutter等人，1995年)，构建带有myc表位的N末端标记的结构(Evan等人，1985年)或增强型绿色荧光蛋白（EGFP；Clontech）被克隆到pGEM-1（Promega）的T7启动子后面。按照说明转染细胞(Simonsen等人，1998年a)并对转染后6h进行分析。对于中的表达式大肠杆菌BL-21（DE3），构建物被克隆到pGEX-5X-3（Pharmacia）的多聚体中。蛋白质的表达和纯化按照制造商的说明进行。

酵母菌株

本研究中使用的酵母菌菌株在富含培养基（1%酵母提取物、1%蛋白胨、2%葡萄糖）或标准最低培养基中培养，并添加适当的添加剂(Sherman等人，1986年). 本研究中使用的菌株与SF838-9D（野生型）相似(垫子αleu2-3112 ura3-52 his4-519 ade6 gal2 pep4-3) (罗斯曼和史蒂文斯，1986年)如下：SF838-9Dα-mut.223(第34版/vpl7-1版) (Raymond等人，1992年) (垫子αleu2-312 ura352 his4-519 ade6 gal2 pep4-3 vpl7-1) (罗斯曼和史蒂文斯，1986年); SF838-9Dα-mut.2066(vps15/vpl19-10) (Raymond等人，1992年) (垫子αleu2-3112 ura3-52 his4-519 ade6 gal2 pep4-3 vpl19-10) (罗斯曼和史蒂文斯，1986年); 和NBY123(第27版Δ) (垫子αleu2-3、112 ura3-52 his4-519 ade6 gal2 pep4-3伏27Δ：：LEU2). NBY123由SF838-9D制成，使用pKJH2中断VPS27系列(Piper等人，1995年). 50 OD（外径）600收集对数中期细胞单位，用8%的PFA固定在pH7.35的磷酸盐缓冲液中。处理细胞进行冰冻切片，并用2×FYVE–GST标记切片进行电子显微镜检查，如下所述。

脂质体结合分析

将磷脂酰肌醇（0.05-2%，梯形）并入含有63-65%磷脂酰胆碱、20%磷脂酰丝氨酸、15%磷脂酰乙醇胺和微量[三H] 磷脂酰胆碱，以及与固定在谷胱甘肽-Sepharose珠（Pharmacia）上的GST融合蛋白的结合进行了分析(斯齐亚沃等., 1996).

表面等离子共振

在25°C下，在BIAcore X上记录了表面等离子体共振。所用的脂质体与脂质体结合试验中使用的脂质体相同，只是它们含有2%的PI（3）P，没有放射性示踪剂。通过以5µl/min的流速连续三次注射80µl脂质体，将脂质体（0.35 mg/ml）加载到BIAcore L1芯片上。用缺乏PI（3）P的类似脂质体加载参考细胞。以20µl/min.的流速注射0.2–2µg蛋白质，记录感测图。使用10 mM NaOH再生脂质表面。使用仪器附带的BIAsimulation 3.0软件包进行缔合和解离动力学分析。根据χ评估了对各种动力学模型的拟合2残差的值和散布。

共焦荧光显微镜

用0.05%皂苷或冻融使盖玻片上的转染细胞透化，然后用PFA固定，并用指示的抗体染色，然后用异硫氰酸荧光素（FITC）或赖氨酸-罗丹明标记的第二抗体（Jackson Immunoresearch）染色，如所述(西蒙森等.，1998年a). 在某些情况下，盖玻片用生物素化GST–2×FYVE（20µg/ml）染色，然后用Cy3–链霉亲和素（2µg/ml，Jackson Immunoresearch）染色。使用配备Kr/Ar激光器和PL Fluotar 100×/1.30油物镜的徕卡TCS NT共焦显微镜检查盖玻片。用仪器提供的软件定量两种抗体标记的结构的相对强度。

电子显微镜

BHK细胞在室温下用4%PFA/0.01戊二醛或8%PFA固定在pH 7.35的0.1M磷酸盐缓冲液中2h。在适当的情况下，将细胞与BSA金在37°C下孵育10–30分钟，以标记早期内吞室。然后对其进行冷冻切片处理，并如前所述使用甲基纤维素/蔗糖回收切片(利乌等., 1997). 切片用5–10µg/ml GST–2×FYVE（或相同浓度的对照探针GST或GST-2×FYVE）培养C215S型)在室温下清洗30分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗[4×5分钟]并用4%PFA固定在PBS中。然后用GST的兔多克隆抗体（AmRad）清洗并孵育，然后用蛋白A–金（荷兰乌得勒支大学）孵育。在室温下用8%PFA固定2小时的原代人成纤维细胞获得相同的结果。由于未知原因，在不同的哺乳动物细胞制剂之间观察到标记密度（但不是标记模式）的一些变化。如上所述，对固定的BHK细胞进行冷冻替代处理，并将其包埋在HM23树脂中(范·根德伦等., 1991). 酵母细胞固定在8%PFA中，按照上述冷冻切片的方法进行处理、切片和标记，所有菌株一起进行处理和标记。通过随机分析细胞轮廓并确定与特定隔室相关的金颗粒百分比，对BHK细胞的标记进行定量。这与每个隔间占用的体积有关，通过相同部分的点数进行估算。为了估算内胚小室的体积，使用内化BSA–金30分钟的BHK细胞进行定量。需要该培养时间来完全标记早期内吞室的复杂管状/囊泡区域。每个膜面积的GST–2×FYVE金标记密度是通过将金颗粒与膜面积相关联，并使用图像上覆盖的网格进行交叉计数来确定的(格里菲斯等., 1989). 对20个随机细胞轮廓进行酵母细胞标记定量。

致谢

我们感谢Jean Gruenberg、Peter Schu、Sue-Goo Rhee和Naomi Kitamura分别赠送抗LBPA、抗甘露糖6-磷酸受体、PLC-δ1 DNA和Hrs DNA，以及Tom H.Stevens赠送酵母菌株。我们特别感谢大卫·詹姆斯对手稿的评论。H.S.得到了顶级研究计划、挪威研究委员会和诺和诺德基金会的支持。R.G.P得到了澳大利亚研究委员会和人类前沿科学计划的支持。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团