美国生理学杂志胃肠病学肝病生理学。2010年11月；299（5）：G1204–G1210。
分离门周、小叶中和小叶中心的大鼠肝窦内皮细胞，可以进行药物毒性的研究
南加州大学凯克医学院胃肠和肝脏疾病科和肝脏疾病研究中心
通讯作者。转载请求和其他通信地址：L.D.DeLeve，南加州大学凯克医学院，胃肠道和肝脏疾病科，2011 Zonal Ave.-HMR603，Los Angeles，CA 90033（电子邮件：ude.csu@eveled公司). 收到日期：2010年6月25日；2010年8月27日接受。
摘要
许多肝窦内皮细胞（LSEC）依赖性过程，包括药物诱导的肝损伤、缺血再灌注损伤、急慢性排斥反应、纤维化和HELLP（溶血性贫血、肝酶升高、血小板减少）综合征，可能具有小叶分布。从不同地区分离LSEC种群的可靠方法将有助于研究这种分布的机制。我们建立并验证了一种简单的方法来分离门脉周围、小叶中和小叶中心LSEC。在CD45表达的基础上，通过免疫磁珠分离法分离出三个LSEC亚群。流式细胞术显示，78.2±2.3%的LSEC为CD45阳性，LSEC可分为CD45明亮型（占总人口的28.6±2.7%）、暗型（49.6±1.0%）和阴性型（21.8±2.3%）。免疫组织化学证实，CD45在LSEC中的体内表达呈小叶分布，门周LSEC中CD45染色增强。细胞直径、窗孔直径、每个筛板和每个细胞的窗孔数量、孔隙度和凝集素摄取在亚群中存在显著差异，与文献一致。低浓度LSEC特异性底物（甲醛处理的血清白蛋白）的胞吞作用仅限于CD45明亮和暗淡LSEC。醋氨酚对CD45暗淡和阴性人群的毒性大于对CD45明亮人群的毒性。综上所述，CD45在门脉周围低分化肝细胞中高表达，在小叶中低分化肝组织中低表达，而在小叶中心低分化肝细胞核中呈阴性表达，这为从三个不同的肝区分离低分化肝肿瘤提供了一种简便的方法。通过该方法获得的LSEC亚群足以用于功能研究和药物毒性测试。
关键词：肝循环、药物性肝损伤、对乙酰氨基酚、CD45、内吞作用
肝窦内皮细胞（LSEC）与多种形式的（通常是分区的）肝损伤有关，包括药物性肝损伤、缺血再灌注损伤、急性和慢性排斥反应、纤维化和HELLP（溶血性贫血、肝酶升高、血小板减少）综合征(1,4,5,7,8,10,11,13,16,18,20,23,26,27,30). 起源于窦的带状损伤可能是由于小叶LSEC的差异，但其他可能性包括相邻肝细胞代谢的区域差异以及小叶的氧或底物梯度。分离活的LSEC亚群的简单方法将极大地促进LSEC依赖性分区损伤的深入研究，但也将允许研究整个小叶的LSEC生理学。众所周知，门脉周围和小叶中心LSEC在形态学上存在差异(24,25,29)，抗原表达(22)和凝集素亲和力(三). 然而，据我们所知，迄今为止已证明的唯一功能差异是内吞作用中的小叶差异(2,21).
CD45是常见的白细胞抗原，在正常大鼠LSEC体内和体外均表达(15,19). 此外，LSEC中CD45表达存在亚群异质性(19). 本研究检测LSEC中CD45的表达模式；根据CD45表达水平确定LSEC是否可以分为门脉周围、小叶中段和小叶中心亚群；检查各亚群内吞作用的差异；并调查所获得的亚群是否足以研究对乙酰氨基酚的分区毒性。
材料和方法
试剂
除非另有说明，否则化学品来自西格玛阿尔德里奇（密苏里州圣路易斯）。使用的抗体包括小鼠抗鼠CD45抗体（BD Pharmingen，加利福尼亚州圣地亚哥，目录号554875）、异硫氰酸荧光素（FITC）偶联的小鼠抗鼠CD45（BD Pharmingen，目录号5504877）、藻红蛋白（PE）偶联的鼠抗鼠CD45-（BD Farmamingen，目录号55/4878）、鼠抗鼠CD31抗体（Abcam，Cambridge，MA）、，兔抗鼠血管性血友病因子（vWF）抗体（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）、兔抗鼠IgG FITC偶联物（BD Pharmingen）、驴抗鼠Ig G、PE偶联物和驴抗兔Ig G，罗丹明偶联物（圣克鲁斯生物技术公司）。FITC标记的甲醛处理血清白蛋白（FITC-FSA）是挪威特罗姆瑟大学Bård Smedsrød博士赠送的一份礼物。
动物
雄性Sprague-Dawley大鼠（体重220–250 g）来自Bantin and Kingman Laboratories（加利福尼亚州弗里蒙特）。南加州大学（USC）的动物护理和使用委员会审查并批准了所有方案，以确保对动物的道德和人道待遇。本研究遵循国家科学院编制、国家卫生研究院出版的NIH《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物86-23，1985年修订）中概述的指南。
细胞隔离
如前所述，LSEC首先通过胶原酶灌注、碘克沙醇密度梯度离心和离心淘洗分离(12). 通过荧光乙酰化低密度脂蛋白阳性染色和过氧化物酶阴性染色检测发现，LSEC的平均产量为每10 g肝脏1亿个窦内皮细胞，存活率>95%，纯度>98%。然后，根据制造商的说明，使用自动MACS Pro分离器（加利福尼亚州奥本市Miltenyi Biotec）根据CD45表达进一步分离总LSEC。在用FcR阻断试剂阻断后，将LSEC与0.2 ml（1:10）FITC-结合小鼠抗鼠CD45或PE结合小鼠抗大鼠CD45在4°C温度下孵育45分钟，轻轻摇晃，清洗，然后与0.2 ml在4°C下再摇晃45分钟。清洗细胞，将其重新悬浮在0.5 ml缓冲液中，并进行磁分离。autoMacs“Possel”程序用于从CD45暗淡和阴性人群中分离CD45明亮细胞。使用autoMacs“Possel_s”程序进一步分离CD45暗淡和阴性人群。细胞培养在鼠尾胶原蛋白涂层板上（400000个细胞/cm2)在Dulbecco的最低必需培养基（DMEM）中-低葡萄糖和10%胎牛血清（FBS）。细胞通常在接种后3小时内附着在培养皿上。
实时PCR
大鼠骨髓单个核细胞（BMMC）取自大鼠股骨，去除红细胞。根据制造商的说明，使用RNeasy Mini Kit（加利福尼亚州巴伦西亚市齐根市）制备LSEC和BMMC的总RNA。大鼠主动脉内皮细胞（RAEC）的总RNA购自Cell Applications（加州圣地亚哥）。使用RT制备cDNA2SABiosciences公司的First Strand Kit（马里兰州弗雷德里克）。使用实时RT在ABI Prism 7900HT序列检测系统（Applied Biosystems，Carlsbad，CA）上进行实时PCR2qPCR引物分析（SABiosciences），以β-肌动蛋白为参考对照。所有引物均购自SABiosciences。
荧光染色
正常大鼠肝脏在液氮中快速冷冻，并包埋在最佳切割温度的复合物中。冷冻切片（10μm）用冷丙酮固定10 min，用5%兔血清封闭30 min。切片用CD45抗体（1:50）孵育2 h，然后用兔抗鼠IgG FITC结合物（1:100）孵养45 min。对照组用纯化的鼠IgG1κ-同种对照抗体（BD Pharmingen）染色。使用Prolong Gold Antifade试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）安装载玻片。使用蔡司LSM 510共焦显微镜（纽约州桑伍德市卡尔蔡司显微成像公司）拍摄图像。
免疫细胞化学
细胞培养过夜，清洗盖玻片，将其固定在4%多聚甲醛（PF）和冷甲醇中，并在室温下与小鼠抗鼠CD31抗体（1:50）或兔抗鼠vWF抗体（1:50%）孵育2 h。在PBS中清洗盖玻片，并在室温下与PE偶联的驴抗鼠IgG或罗丹明偶联的驴抗兔IgG孵育45分钟。对照组用与一级抗体浓度相同的同型对照IgG孵育。使用Prolong Gold防褪色试剂（Invitrogen）将盖玻片安装在载玻片上。通过蔡司LSM 510共焦显微镜（卡尔蔡司显微成像）在×40倍放大率下检查载玻片。每种情况检查三次，通过计算15个随机选择的字段中CD31或vWF阳性细胞的数量获得数值。
用WGA对CD45进行染色
用小麦胚芽凝集素（WGA）标记的LSEC通过体内灌注或体外标记检测CD45染色。活体灌注和共焦成像证实了门脉周围LSEC对WGA的优先摄取。用10ml普通小麦四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）缀合凝集素（10μg/ml）以2ml/min的速度通过门静脉灌注肝脏。然后将肝脏切成块，用4%PF、4%蔗糖溶液固定，然后在30%蔗糖中浸泡过夜。固定的肝脏在液氮中快速冷冻，切成10μm的切片，并用Prolong Gold Antifade试剂（Invitrogen）固定。通过蔡司LSM 510共聚焦显微镜（卡尔蔡司微成像）以×20放大倍数获得图像。
体内标记。
如上所述，从WGA-TRITC灌注肝中分离出的100万LSEC与FITC小鼠抗鼠CD45（1:50）在4°C下孵育30分钟。
体外标记。
从非WGA灌注大鼠肝脏中分离出的100万LSEC在37°C下与WGA-TRITC（10μg/ml）孵育10分钟，然后与FITC-偶联的小鼠抗鼠CD45（1:50）在4°C孵育30分钟。
流式细胞术。
在对活细胞进行门控后，使用FACSCalibur（新泽西州富兰克林湖Becton Dickinson）分析通道FL1和FL2上CD45的表达和WGA的摄取。在一些实验中，还分析了前向散射；每个样本分析20000个细胞。
扫描电子显微镜
在胶原涂层的Thermanox盖玻片上培养的LSEC（Thermo Fisher Scientific，Rochester，NY）用2%戊二醛（Electron Microscopy Sciences，Hatfield，PA）固定在0.1 M的二羧酸缓冲液中，PH值为7.4，持续30分钟。清洗后，用1%单宁酸（Electronic Microscopys Sciences）在0.15 M的二羰基缓冲液中处理LSEC 1小时，用1%四氧化锇（Ted Pella，加利福尼亚州雷丁市）在0.1 M二羧酸缓冲液中固定30分钟，用分级醇脱水，用六甲基二硅氮烷（Ted Pella）干燥，用10-nm金溅射涂层，并通过JSM-6390LV扫描电子显微镜进行检查（日本东京JEOL）。
定量成像
对每个实验中随机选择的15个LSEC的扫描电子显微镜（SEM）图像进行了分析。使用MetaMorph软件（7.0版；Molecular Devices，Downingtown，PA）测定窗孔直径、每个筛板和每个细胞的窗孔数量以及孔隙度。总LSEC表面积和单个窗孔的开放面积以平方微米为单位进行量化。将这些开放面积相加，除以检查的LSEC表面的总面积，再乘以100，得出孔隙度（开放面积的百分比），并取平均值，得出每组的单个值。对于细胞直径，将一滴新鲜分离的细胞添加到玻璃载玻片中，通过光学显微镜在×20放大倍数下随机拍摄15张照片，并使用MetaMorph软件测量直径。
内吞作用
FITC-FSA的体内摄取。
用10 ml FITC-FSA（2μg/ml）以2 ml/min的速度经门静脉灌注正常大鼠肝脏。然后将肝脏切成块，在室温下用4%PF-4%蔗糖溶液固定4小时，然后在室温下浸泡在30%蔗糖中过夜。固定的肝脏在液氮中快速冷冻，切成10μm的切片，并用Prolong Gold Antifade试剂（Invitrogen）固定。使用蔡司LSM 510共焦显微镜（卡尔蔡司显微成像）获取图像。
FITC-FSA的体外摄取。
如图所示，将在胶原涂层盖玻片上培养过夜的LSEC清洗，并与含1%FBS的DMEM-低葡萄糖孵育60分钟。然后，将LSEC与含有1%FBS、DMEM-高葡萄糖的FITC-FSA（0.5μg/ml或0.02μg/ml）孵育10分钟。清洗后，将LSEC与含1%FBS的DMEM低葡萄糖培养60分钟。然后将LSEC在冷PBS中清洗，并在4%PF（4°C）中固定30分钟。用去离子水清洗盖玻片，并用Prolong Gold Antifade试剂（Invitrogen）固定。使用蔡司LSM 510共焦显微镜（卡尔蔡司显微成像）在40倍放大率下获得图像。LSEC对FITC-FSA的摄取百分率进行了三次检查，并通过计算15个随机选择的区域中阳性标记的细胞数量来获得数值。
药物研究
在含有10%FBS的DMEM中暴露过夜对乙酰氨基酚的新鲜培养细胞中进行研究。在药物孵育之前，允许细胞粘附至少3小时。在96个平板中进行毒性试验研究，并在黑暗的37°C CO中进行孵育2培养箱过夜。如前所述，用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四氮唑试验评估细胞活力(6). 活性表示为未经处理的对照细胞的百分比。
统计
数值数据表示至少三个单独实验的平均值±SE。数值通过双因素方差分析（ANOVA）进行比较，并使用Microsoft Excel analysis ToolPak（Microsoft，Redmond，WA）进行复制。如果方差分析具有显著性，则采用最小显著性差异检验进行后验分析。结果与P（P）<0.05被认为是显著的。
结果
LSEC实时PCR检测CD45的表达
我们之前的研究已经通过免疫细胞化学和免疫组织化学表明LSEC表达CD45(15). 一种可能性是，CD45的表面表达是由于含有CD45的细胞片段的内吞作用和吞噬作用，而不是由于LSEC内源性表达CD45。滋养细胞增生是一种细胞从另一个细胞中提取表面分子，然后在自己的细胞表面表达这些抗原的现象(17); 这一过程首先在白细胞中被描述，随后在包括内皮细胞在内的各种细胞类型中被识别(14). 为了排除表面表达仅仅是由于滋养细胞增生，在LSEC中检测了CD45的基因表达。采用逆转录聚合酶链反应检测LSEC、RAEC和BMMC中CD45 mRNA的表达。RAEC中几乎没有CD45的表达，但LSEC和BMMC中都有显著表达（数据未显示）。然后通过实时PCR对三组CD45水平进行比较，结果表明，与RAEC相比，LSEC和BMMC中CD45 mRNA水平分别增加了近18倍和25倍().
分离肝窦内皮细胞（LSEC）CD45表达的实时PCR。实时荧光定量PCR检测正常大鼠肝脏LSEC中CD45 mRNA的表达。以大鼠骨髓单个核细胞（BMMC）为阳性对照，大鼠主动脉内皮细胞（RAEC）为阴性对照。LSEC和BMMC中CD45 mRNA水平显著高于RAEC(n个= 4;P（P）ANOVA对3种细胞类型的比较<0.0001*P（P）LSEC和BMMC与RAEC通过最小显著性差异检验的比较<0.001）。
基于CD45表达水平的LSEC亚群分离
流式细胞术显示78.2±2.3%的LSEC为CD45阳性，用同种对照抗体染色的细胞作为步态对照(). LSEC可分为CD45明亮、CD45暗淡和CD45阴性人群(,). CD45明亮人群的前向散射（与细胞大小相关的参数）小于CD45暗淡人群和CD45阴性人群(). 用autoMACS分离三个亚群的细胞，并用光学显微镜测量细胞直径()这证实了流式细胞术的观察结果，即三个LSEC亚群之间的细胞大小不同。LSEC的大小增加，CD45在三个亚群中的表达减少，这与起源于门脉周围（CD45明亮）、小叶中部（CD45暗淡）和小叶中心（CD45阴性）的亚群一致。
分离LSEC中CD45表达的流式细胞术。用同型对照抗体对正常大鼠肝脏分离的LSEC进行染色(左边)或CD45-FITC(正确的)流式细胞仪检测。散射图在CD45上设置门控，是4个独立实验的代表。每个图中显示了表达CD45的LSEC的百分比。在正确的图中可以观察到三个种群：CD45明亮（椭圆形右上角)，CD45 dim（多边形英寸右上角)和CD45阴性(右下角).
表1。
| CD45 Bright（门脉周围） | CD45 Dim（小叶中部） | CD45阴性（中枢性） |
|---|
| 占总细胞的百分比 | 28.6 ± 2.7% | 49.6 ± 1.0% | 21.8 ± 2.3% |
| 每个肝脏的细胞产量（106) | 18.67 ± 2.54 | 35.42 ± 3.12 | 16.46 ± 2.06 |
| 电池直径，μm | 6.0 ± 0.1 | 6.8 ± 0.0* | 7.1 ± 0.2* |
| CD31-阳性细胞百分比 | 66.5 ± 1.2% | 90.5 ± 2.7%* | 92.0 ± 2.1%* |
| vWF阳性细胞百分比 | 11.5 ± 0.5% | 8.9 ± 1.8% | 15.1 ± 0.7% |
体内CD45表达
LSEC体内表达CD45(12)CD45染色与CD31染色共定位。在对照肝切片的免疫组织化学上，CD45呈小叶分布()门脉周围比小叶中心区染色更明显。
对照大鼠肝脏CD45染色的免疫组织化学。冷冻大鼠肝脏切片进行CD45染色。沿着门静脉三联体（PT）周围的窦状体观察到连续染色（箭头所示），而沿着中央静脉（CV）周围的窦状体未观察到染色。比例尺：50μm。
CD45亮LSEC与WGA阳性LSEC共定位
WGA是一种凝集素，优先与小鼠门脉周围LSEC结合(三)以及通过免疫组织化学定位于大鼠门周LSEC(). 服用WGA的LSEC在体内灌注或体外标记后，CD45染色为明亮()证实CD45亮细胞为门脉周围LSEC。
利用CD45明亮LSEC对小麦胚芽凝集素（WGA）吸收进行结焦。A类：用WGA-四甲基罗丹明异硫氰酸盐（TRITC）灌注肝脏，并在共焦显微镜下进行检查。LSEC阳性染色，表现为沿鼻窦的连续线，在PT周围的鼻窦中观察到，而在CV周围的鼻窦中未观察到染色。比例尺：50μm。B类：从WGA-TRITC灌注大鼠肝脏中分离的LSEC与CD45-FITC在体外孵育，并通过流式细胞术进行检测。C类：从非WGA灌注大鼠肝脏分离的LSEC与WGA-TRITC和CD45-FITC在体外孵育，并通过流式细胞术进行检测。图中对CD45和WGA进行了门控，仅对WGA、CD45和WWA以及仅对CD45呈阳性的细胞百分比如所示左上角,右上角、和右下角分别是。所示示例是3个独立实验的代表。
CD31和vWF的表达
将三个LSEC亚群培养过夜，并对其进行CD31或vWF染色。CD45明亮LSEC表达CD31的人群少于CD45暗淡和阴性人群(). vWF在三个LSEC亚群中的表达相似()LSEC对vWF阳性的百分比与之前的研究结果一致(9).
CD45明亮、暗淡和阴性LSEC具有不同的窗型
门脉周围和小叶中心LSEC在窗孔大小、每个筛板和每个细胞的窗孔数量以及孔隙度方面存在差异(24,25,28). 对三个LSEC亚群进行过夜培养，并通过SEM检查这四个参数(). 定量分析表明，与CD45暗色和阴性群体相比，CD45明亮LSEC具有更大的窗孔，每个筛板和每个细胞的窗孔更少，孔隙率更低(). CD45 dim LSEC的孔隙度与CD45阴性LSEC显著不同(). 这与门脉周围、小叶中和小叶中心LSEC的分离相一致。
扫描电子显微镜（SEM）。分离LSEC并将其分为CD45明亮、暗淡和阴性亚群，如材料和方法细胞隔夜培养、处理，并在×5000倍放大下通过SEM进行检查。注意CD45明亮人群中的细胞(A类)窗孔比CD45暗区的细胞少(B类)CD45阴性(C类)人口。比例尺：5μm。
表2。
| CD45 Bright（门脉周围） | CD45 Dim（小叶中部） | CD45阴性（小叶中心） |
|---|
| 窗孔直径，nm一 | 155.4 ± 2.7 | 127.7 ± 2.4d日 | 118.0 ± 2.1e（电子） |
| 每个筛板的窗孔数量b条 | 8.5 ± 0.6 | 23.1 ± 2.0e（电子） | 24.5 ± 1.8e（电子） |
| 每个细胞的窗孔数量b条 | 306.8 ± 36.8 | 731.3 ± 89.5d日 | 832.3 ± 56.9e（电子） |
| 多孔性c（c） | 2.8 ± 0.3% | 4.5 ± 0.3%e（电子） | 5.7 ± 0.3%e（电子）,（f） |
内吞作用
细胞内吞是LSEC的一个关键功能特征。低浓度体内灌注和共焦成像证实FITC-FSA在门静脉周围LSEC中的优先摄取(). 将LSEC的三个亚群分离、培养过夜，然后暴露于0.5或0.02μg/ml的FITC-FSA中10分钟。这三个亚组的FITC-FSA摄取量（0.5μg/ml）为～99%（数据未显示）。在浓度为0.02μg/ml时，CD45阴性人群中没有摄取FITC-FSA，而86.9±2.4%的CD45明亮和84.0±3.9%的CD45-dim LSEC摄取了FITC-FSA().
LSEC摄取FITC-标记的甲醛处理血清白蛋白（FITC-FSA）。A类：用FITC-FSA灌注肝脏并用共焦显微镜检查。左侧，×20倍放大；中间的和正确的，×40倍放大倍数左边。在PT周围的鼻窦中观察到FITC-FSA的摄取（箭头所示），而在CV周围的鼻窦中未观察到摄取。比例尺：50μm。B类：CD45明亮、暗淡和阴性人群暴露于0.02μg/ml FITC-FSA，如材料和方法在CD45明亮和暗淡群体中均观察到FITC-FSA的摄取，而在CD45阴性群体中未观察到摄取。驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。比例尺：50μm。
对乙酰氨基酚毒性
对乙酰氨基酚对LSEC有毒(11,16,26,27)并导致小叶中心出血性坏死。分离LSEC的三个亚群，隔夜暴露于1、3和10 mM对乙酰氨基酚。对乙酰氨基酚对CD45暗淡和阴性LSEC的毒性明显高于对CD45明亮LSEC的().
对乙酰氨基酚对CD45亮（门脉周围）、CD45暗（小叶中部）和CD45阴性（小叶中心）LSEC的毒性。将CD45亮（●）、CD45暗（○）和CD45阴性（▾）LSEC暴露于对乙酰氨基酚1、3和10 mM，如材料和方法对乙酰氨基酚对CD45暗细胞和CD45阴性细胞的毒性明显高于对CD45亮细胞的毒性(n个= 3;P（P）<0.0001用于ANOVA对3个亚群的比较*P（P）通过最小显著性差异测试，在3和10 mM时CD45暗淡和阴性与CD45明亮的比较<0.001）。
讨论
本研究证明了LSEC中CD45基因的高表达，建立并验证了一种基于CD45表达水平将LSEC分为门静脉周围、小叶中和小叶中心亚群的简单方法，并证明这些亚群可用于研究分区LSEC依赖性过程。通过CD45表达选择的三组是根据细胞大小、开窗大小、每个网板和每个细胞的开窗数量、孔隙率、WGA摄取和内吞作用的差异来确定的，这些差异先前报道在门周和小叶中心LSEC中是不同的(三,24,25,29). 由于研究中的细胞是隔夜培养的分离细胞，先前的描述检查了肝切片中的LSEC，因此细胞大小和窗孔发现与之前的报告在数量上有所不同。
CD45是一种跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，通常在白细胞上表达。本研究证实了LSEC中CD45的内源性表达，这表明LSEC可能来源于骨髓。免疫组织化学还表明，LSEC中CD45的表达具有小叶梯度分布。CD45在门静脉周围LSEC中高表达，在小叶中LSEC中低表达，而在小叶中心LSEC中呈阴性。所描述的方法是新颖的，因为它从小叶的三个区域分离细胞，这些区域来自单个肝脏，足以进行功能研究。三个亚群的形态特征作为一个连续体发生变化，这表明表型差异可能是由于LSEC在流经小叶时的成熟或氧张力对LSEC表型的影响。
本研究证实门脉周围和小叶中LSEC为CD45阳性。一些最近开发的分离LSEC的方案从排除CD45+细胞开始，以排除Kupffer细胞，但目前的发现表明，这些方法将产生小叶中心LSEC亚群。
在本研究中，CD45 dim和CD45阴性人群在大小、CD31和vWF表达以及对乙酰氨基酚毒性的敏感性方面相似。然而，与CD45阴性人群相比，CD45 dim人群具有更低的孔隙率和更高的内吞活性，这表明CD45dim和阴性人群是不同的人群。
众所周知，对乙酰氨基酚在体外对LSEC有毒(11,16)，尽管LSEC损伤对体内肝损伤的贡献仍需探索。这里介绍的对乙酰氨基酚实验是为了证明通过CD45免疫磁选获得的细胞足够健康，可以进行药物毒性研究。醋氨酚诱导的肝损伤导致小叶中心出血性坏死。与此相一致，这里的研究结果表明，对乙酰氨基酚确实对肝小叶中央区和小叶中心区的LSEC毒性更大，这与LSEC在确定对乙酰氨基苯酚诱导的肝损伤的小叶中心定位方面的作用一致。将LSEC分为亚群可以回答的一个重要问题是，CYP2E1和LSEC中谷胱甘肽周转的小叶差异是否决定了损伤的分带。在一些小鼠菌株中，对乙酰氨基酚被LSEC激活为P450，而在其他小鼠菌株中LSEC只是相邻肝细胞代谢激活的对乙酰氨基苯酚的靶点(11). 目前的实验表明，对乙酰氨基酚由大鼠LSEC代谢激活，而不需要肝细胞激活P450。
总之，本研究描述并验证了一种分离门脉周围、小叶中段和门脉周围LSEC的简单方法。用这种方法分离的细胞在内吞作用和对乙酰氨基酚损伤易感性方面表现出小叶差异。该方法将允许未来对分区、LSEC相关过程进行研究。
赠款
这项工作得到了NIH拨款DK66423和DK46357、南加州大学肝病研究中心组织学和显微镜亚中心（P30DK048522）以及南加州酒精性肝病、胰腺疾病和肝硬化研究中心非前列腺肝细胞亚中心（R24AA012885）的支持。
致谢
作者感谢Michelle MacVeigh-Aloni在免疫染色和共焦显微镜方面提供的宝贵帮助。
参考文献
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