抗淀粉样蛋白免疫治疗的生化后果

形态学评估

对BSHRI AD和NDC病例进行斑块总评分、斑块密度、NFT总评分、建立阿尔茨海默病注册协会（CERAD）、神经炎斑块评分、Braak分期、WMR总评分和CAA总评分的评估（见表​表2）。2)。这些神经病理学参数的详细评估在以前的出版物中给出[36]. 主观上归因于免疫治疗的斑块清除率的半定量评估估计为无（0）、轻度（+）、中度（++）和广泛（++）。通过在100 ml 10%SDS、10 mM Tris-HCl pH 7.4中溶解10立方大脑皮层组织（每侧约1 cm）来评估UCSD患者的CAA含量。在室温下连续搅拌48小时后，剩下的唯一结构是不溶性血管簇和附着的淀粉样沉积物。去除洗涤剂后，在玻璃载玻片上风干容器，并用硫黄素-S染色[17].

来自USSM的Aβ42免疫接种对阿尔茨海默病患者#12-15的临床、神经病理学和长期影响已在其他地方详细描述[29,30,35]. UCSD病例#19、20和22的神经病理学报告总结见表​表3三.

ELISA法测定可溶性和不溶性Aβ

所有步骤均在4°C下进行。用特氟隆组织研磨机将灰质组织（100 mg）均匀化，其中6体积为20 mM Tris-HCl，5 mM EDTA，pH 7.8，含蛋白酶抑制剂鸡尾酒（PIC，罗氏诊断公司，德国曼海姆）。匀浆以435000×克在使用120.2转子的Optima TLA超离心机中保持20分钟（加利福尼亚州富勒顿贝克曼）。上清液保存为可溶性Aβ组分和总蛋白，通过Pierce BCA蛋白质分析进行定量（Rockford，IL）。在3 ml 90%的玻璃蒸馏甲酸（GDFA）中均匀化每四毫克灰质和白质组织，并在250000×克在使用SW41转子（贝克曼）的贝克曼LE-80K超离心机中，在4°C下保持20分钟。仔细收集上清液，避开顶部脂肪层。标本在90%GDFA中均质，目的是完全溶解所有形式的Aβ（纤维、弥散、膜结合、细胞内和细胞外寡聚物）。高速离心可以去除所有脂质，包括被GDFA完全破坏并在离心管顶部形成致密聚集体的膜相关形式。每个病例的全部体积在80%GDFA流动相中进行快速蛋白液相色谱（FPLC）尺寸排除Superose-12色谱（见下文）。从每次运行中收集并汇集Aβ肽组分，并通过真空离心将其减少至2 ml（SpeedVac；Savant/Thermo，Waltham，MA）。为了去除酸，每例患者在1000 MW切断管中进行透析，每次换2次水（每次1小时），换2次0.1 M碳酸氢铵溶液（每次1 h）。样品被冻干和冻干。然后用500μl的5 M盐酸胍（GHCl）在50 mM Tris-HCl（pH 8.0）中制备，并在4°C下摇晃过夜，重新配制样品。总蛋白通过Pierce BCA蛋白测定进行定量。用于定量Aβ40和Aβ42的ELISA试剂盒分别从Invitrogen（加利福尼亚州卡尔斯巴德）和Innogenetics（比利时根特）获得，并按照制造商的说明进行操作。

ELISA法测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）

所有步骤均在4°C下进行，并遵循先前发布的方案[37]. 使用Omni-TH电动组织研磨机在20体积的20 mM HEPES、1.5 mM EDTA、pH 7.4的PIC（Roche）中对灰质（100 mg）进行均质，并在3000×克在IEC Centra CL3R离心机（Thermo，Waltham，MA）中保持15分钟。然后收集上清液并在40000×克使用50.4 Ti转子（Beckman）和Optima LE-80K超离心机（Beck曼）持续1小时。再次收集上清液，并用BCA蛋白测定法（Pierce）测定总蛋白。根据制造商的说明，使用PromoKine（德国海德堡）的试剂盒测量人类TNF-α水平。

Western Blot分析

如前所述进行蛋白质印迹[38]. 简单地说，灰质在RIPA缓冲液（西格玛，圣路易斯，密苏里州）中均匀化，其中含有PIC（罗氏）。离心匀浆，收集上清液，用BCA蛋白检测试剂盒（Pierce）定量总蛋白。用SDS-PAGE分离样品（每道装载25μg总蛋白），然后电泳转移到0.45μm孔的硝化纤维素膜（Invitrogen）上，用5%的非脂肪乳在磷酸盐缓冲液（PBS）中封闭，0.5%吐温20（弗卢卡，圣路易斯，密苏里州）。实验中使用的主要抗体包括22C11（识别APP的66-81个氨基酸；Millipore，Billerica，MA）、CT9APP（识别APP-的最后9个C末端氨基酸；Milliepore）和anti-au HT7（识别氨基酸159-163；Pierce）。所用的二级抗体为山羊抗鼠IgG结合辣根过氧化物酶（HRP；22C11和antiau）或Pierce的山羊抗兔IgG偶联HRP（CT9APP）。用SuperSignal WestPico化学发光（Pierce）基质、CL Xpose薄膜（Pierce）和Kodak GBX显影剂和定影剂（Sigma）检测蛋白质信号。使用GS-800校准密度计（Bio-Rad，Hercules，CA）和Quantity One软件（Bio-Read）进行分析。用Restore™Western Blot Stripping Buffer（Pierce）剥离所有膜，在PBS中清洗，然后重新封闭。使用抗鼠或抗兔肌动蛋白抗体（Abcam，Cambridge，MA）对总蛋白标准化的印迹进行再验证。

快速蛋白质液相色谱法

将大脑皮层（约3克）切碎并在18毫升90%的GDFA中匀浆，在室温下静置15分钟，并以240000×克在4°C下保持1小时。小心地清除收集在试管顶部的分离脂质层，并丢弃试管底部的小颗粒。将中间上清液分为500μl份，并在-80°C下冷冻。使用Superose 12色谱柱（10×300 mm，General Electric，Uppsala，Sweden）将每等分样品提交给大小不限的FPLC，并用80%的GDFA进行平衡。使用80%GDFA在室温下以15 ml/h的流速开发色谱，并在280 nm下进行监测。在50-66分钟之间洗脱的部分，含有2-8 kDa M_第页收集分子，并通过真空离心（Savant Instruments Inc）将其还原至约50μl，并储存在-80°C下。

高效液相色谱法（HPLC）

使用C8柱（4.6×250 mm，Zorbax SB，Mac Mod），使用含0.1%三氟乙酸（TFA）的0-60%水-乙腈浓度的线性梯度，在80°C下以1 ml/min的流速在120 min内展开，通过反相HPLC分离2-8 kDa FPLC组分。在214nm处监测吸光度，共收集9个组分，并通过真空离心法缩小体积。为了消除酸，用三次换水（每次200μl）洗涤样品，并通过真空离心减少体积。最后一次清洗后，体积减小，样品在含有50 mM二硫苏糖醇的2xLDS样品加载缓冲液（Invitrogen）中重新溶解。如上所述，以抗Aβ40、抗Aβ42（Invitrogen）和CT9APP（Millipore）作为一级抗体，以山羊α-兔IgG HRP作为二级抗体进行Western blot。

表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF）质谱（MS）。Aβ40/42方法

使用Western blot分析并发现含有Aβ的HPLC峰，按照之前发布的方案进行SELDI-TOF MS[39]. 简言之，将捕获抗体、抗Aβ40和抗Aβ42抗体（Invitrogen）以0.38 mg/ml的浓度加载到PS20蛋白质芯片阵列（Bio-Rad，Hercules，CA）上。然后应用HPLC Aβ峰或Aβ1-40或1-42肽标准（阳性对照）。分子质量赋值是由Bio-Rad SELDI蛋白质生物学系统II中的100个平均注射结果产生的，使用蛋白质芯片肽质量校准试剂盒（Bio-Rad）进行外部校准。

二、。AβELISA定量

评估免疫治疗效果的关键是通过ELISA对Aβ40、Aβ42和总Aβ肽进行定量，即在灰质（GM）和白质（WM）中以Tris-soluble和GDFA/GHCl-soluble形式存在。USSM没有冷冻WM用于ELISA分析。这些值如表所示​表4。4为了进行比较，表中还列出了在非免疫AD和NDC个体中观察到的类似值​表4。4GM GDFA/GHCl Aβ42和总AβGM GDFA-GHCl水平在GM和WM组织分区中观察到NDC和AD人群之间的Aβ水平存在显著差异（分别为p=0.0026和0.0066，未配对，双尾t检验）。

免疫AD病例GM中总Aβ水平的总体变异程度很大，GDFA/GHCl可溶性物种的总蛋白为283至14011 ng/mg（平均值=6544），对应的Tris-soluble Aβ组分的总蛋白则为0至13431 pg/mg（均数=3467）（表​（表4）。4)。如受试者#13和#14所示，免疫治疗的最终结果存在显著差异。两人都接受了8次50μg AN-1792注射（表​（表1）。1)。在后一种情况下，组织学观察[29,30]与ELISA定量相匹配，ELISA定量显示总可溶性和不溶性Aβ肽的数量相对较少，而案例#13的GDFA/GHCl可溶性Aβ水平第二高，观察到的Tris-soluble Aβ水平最高。相反，与免疫组相比，病例#14在两种溶剂中的Aβ水平最低。在这两个人中，自第一次免疫以来的存活时间几乎相同：57个月和60个月，这表明Aβ淀粉样斑块病理学的存在与否显然与AD痴呆的进展和致命结局无关。

免疫组和非免疫组AD组之间平均Aβ水平的比较也表明可溶性和不溶性Aβ含量的总体差异很大（表​（表4）。4)。免疫组和非免疫组的GDFA/GHCl可溶性aβ42差异具有统计学意义（p=0.039），前者较低。另一方面，在免疫队列中，Aβ40的水平反常增加，几乎是非免疫AD对照组中观察到的平均数量的两倍，尽管差异没有达到统计学意义。在一名免疫个体（病例#14）中，总Tris-soluble Aβ水平低于检测限。其余6名免疫个体的平均值是未免疫AD病例中观察到的平均值的22倍。

鉴于NDC、AD和Aβ免疫AD患者的病理变化程度很高，如表所示​表4，4同样重要的是，要考虑单独权衡数据，而不是只考虑组平均值。例如，在NDC组中，病例#5的GM和WM GDFA/GHCl可溶性Aβ水平异常高，因此，该组的平均值向上倾斜，比NDC组其他成员的平均值大4-5倍。因此，该病例应归类为非痴呆型“高度病理控制”。在AD组中，11号个体WM中的GDFA/GHCl可溶性Aβ异常高，再次将平均值向上倾斜，这是该组其他人观察到的平均值的7倍。在免疫组中，病例#20的WM-GDFA/GHCl-可溶性总Aβ水平是病例#19观察值的13倍。在Tris可溶性Aβ组分中，免疫的AD个体#13和#16的Aβ分别是该组其余5个个体的21倍和12倍。这些升高的值也反映在GM GDFA/GHCl可溶性aβ组分中，虽然程度较低，但只与中度和轻度斑块清除相关[29,30]. 狄克逊Q检验[40]也将这些个体识别为异常值。

有趣的是，7例免疫性神经病理学确诊的AD病例中，有3例的总GM GDFA/GHCl可溶性aβ值大大低于6例非免疫性AD病例的平均值（总蛋白7218 ng/mg），这表明抗体可能已清除了这些病例中的aβ。其余4例免疫病例的值等于或高于未免疫AD组的平均值。

如上所述，在接受UCSD提供的AN-1792免疫原治疗的3例患者中，有一例神经病理学诊断为HS。其余2名患者，即19号和20号病例，表现出AD的神经病理学，如表所示​表3。三从Aβ免疫分析的角度来看，病例19具有相对中等水平的GM和WM GDFA/GHCl可溶性Aβ肽以及Tris-可溶性Aβ。相比之下，病例#20显示了20例受调查病例中GM和WM-GDFA/GHCl-可溶性Aβ肽的最高水平，包括作为对照的5例NDC和6例非免疫性AD病例。

此外，抗体反应也存在高度的变异性（表​（表1）。1)。例如，病例12和病例14的抗体滴度最高，但从神经病理学角度来看，病例12几乎没有斑块清除的证据，而病例14有广泛的aβ清除。AβELISA数据也显示了病例#12和病例#14的类似模式（表​（表4）。4)。病例15的抗体滴度相对较低，但aβ清除率适中（表​（表2）。2)。21号病例的抗体滴度较低，这与免疫背景无关，因为这是一例PSP患者。

三、 载脂蛋白E基因型

神经病理学诊断为AD的七分之六的患者进行了ApoE基因分型。其中5人携带ε4等位基因（表​（表1）。1)。ApoE状态与GDFA/GHCl提取的GM Aβ总量或Tris-可溶组分中的含量之间没有直接相关性（表​（表44).

四、 肿瘤坏死因子-αELISA定量

肿瘤坏死因子-α是一种促炎细胞因子，与未免疫AD中观察到的平均水平相比，AD免疫个体的促炎细胞因子平均升高2.4倍（分别为34 pg/mg总蛋白和14 pg/mg总蛋白；p<0.0001，表​表4）。4)。值得注意的是，即使在Aβ（#14）减少最显著的免疫性AD患者中，TNF-α水平仍高于非免疫性AD组（表​（表44).

V.灰质匀浆的蛋白质印迹

来自9个免疫病例的大脑皮层在RIPA缓冲液中直接匀浆，并使用22C11、CT9APP和tau HT7抗体通过蛋白质印迹进行分析。为了进行比较，还纳入了4-5例AD和4例NDC病例。与未免疫的AD和NDC个体相比，N末端定向抗体22C11在免疫病例中的总APP无显著差异（图​（图2A）。2安培)。然而，25 kDa APP N末端肽的量有一些波动（图​（图2A）。2安培)。CT9APP抗体在~13 kDa处检测到CT99/83，在~40 kDa时检测到一条条带，这条条带存在于所有研究样本中（图​（图2B）。2B型)。这种由CT9APP抗体揭示的肽很有意思，因为在散发性AD和NDC病例的PS突变中也存在类似大小的条带[38]以及LaFerla等人设计的三重转基因小鼠（3XTg）（A.Roher，未发表的观察结果）。需要进一步的研究来阐明这种假定更长的APP C末端肽及其蛋白水解产物的性质。免疫组与非免疫组之间CT99（~13kDa带）水平无差异。25和40 kDa带可能代表来自未修饰APP分子的互补N端和C端物种。CT9APP抗体还显示，与非免疫AD和NDC组相比，免疫病例中的APP总量略有下降，尽管22C11没有显示出这种趋势。该抗体还显示了在~58和~75kDa处的两个额外的APP C末端相关带（图​（图2B）。2B型)。这些观察结果与22C11和CT9APP可以与淀粉样前体样蛋白（APLP）交叉反应的警告一致。Western blot HT7 tau抗体模式的总体比较表明，AD免疫和非免疫样品之间没有显著差异，但表现出抗SDS二聚体形式tau的7号和9号AD病例除外（图​（图2C2厘米).

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图2

转基因匀浆的蛋白印迹每个通道中总共装载了25μg蛋白质。A） 22C11对抗APP的氨基酸残基66-81，B）CT9APP对抗APP最后9个氨基酸残基，C）tau HT7对抗tau的氨基酸残基159-163。有关更多详细信息，请参阅结果部分。免疫IMZ；阿尔茨海默病；NDC，非痴呆控制。

六、 柱色谱法

通过FPLC初步分离后，含有Aβ肽的组分在50-62分钟内洗脱（相当于12.5-15.5 ml洗脱溶剂），通过C8反相HPLC分离（图​（图3）。三)。对3例免疫病例进行了Western blot生化鉴定。案例19相对于aβ40亚型，主要是二聚aβ42肽的数量减少（图​（图3A）。3A级)。另一方面，AN-1792病例#20具有等摩尔水平的Aβ40和Aβ42肽（图​（图3B）。3B公司)。HS病例#22含有极少量的Aβ40和更丰富的Aβ42相关肽补体。用CT9APP抗体探测的蛋白质印迹证明在图中约13 kDa处存在预期的CT99和CT83 APP C末端片段​图3C。3厘米此外，它们还显示了一条带有M的肽带_第页约40 kDa。

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图3

HPLC分离UCSD免疫病例的灰质（C8反相）图中显示了使用抗Aβ40、抗Aβ42和CT9APP抗体开发的Western blotting研究的HPLC色谱部分。对角线表示乙腈梯度。通道10包含标准Aβ40或Aβ42合成肽。A） 和B），分别对应于神经病理性证实的AD病例#19和#20。C） 对应于神经病理学证实的海马硬化。m、 Aβ单体；d、 Aβ二聚体；t、 β三聚体。