乳腺癌研究治疗。作者手稿；PMC 2011年7月1日发布。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院156204
HER2信号通路的激活和乳腺癌细胞对HER2靶向药物的反应强烈依赖于3D微环境
，
，，、和 布丽塔·威格特
美国加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室生命科学部，邮编：94720
阿尔文·T·罗
美国加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室生命科学部，邮编：94720
凯瑟琳·帕克
美国旧金山加利福尼亚大学综合癌症中心放射肿瘤学系
乔·格雷
美国加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室生命科学部，邮编：94720
米娜·J·比塞尔
美国加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室生命科学部，邮编：94720
Britta Weigelt，美国加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室生命科学部，邮编：94720，加利福尼亚州伯克利回旋加速器路1号，Mailstop 977R225A；
通讯作者。 当前地址：B.Weigelt癌症研究英国伦敦研究所，英国伦敦
- 补充资料
补充数据。
GUID:5B15A87C-6537-4222-AAAB-690B8463C59B
摘要
制定有效和持久的乳腺癌治疗策略需要对微环境对反应的影响有一个机械的理解。先前的工作表明，与传统的二维（2D）单层相比，细胞信号通路和细胞形态受到三维（3D）培养物的显著影响。在这里，我们比较了2D和3D培养模型，以确定3D结构和细胞外基质（ECM）对HER2信号传导和对HER2型-HER2靶向药物Trastuzumab、Pertuzumab和Lapatinib扩增的乳腺癌细胞系。我们表明HER2型-将AU565、SKBR3和HCC1569细胞扩增到这些抗HER2药物高度依赖于细胞是在2D单层还是3D层粘连蛋白丰富的ECM凝胶中培养。β1整合素是一种主要的细胞外基质受体亚单位，其抑制显著增加了HER2型-当在3D环境中生长时，扩增乳腺癌细胞系以获得人源化单克隆抗体Trastuzumab和Pertuzumab。最后，在没有抑制剂的情况下，3D培养对HER2下游信号传导有实质性影响，并在所有研究的细胞系中诱导PI3K-AKT和RAS-MAPK途径激活之间的转换，包括缺乏抑制剂的细胞HER2型扩增和过度表达。我们的数据提供了直接证据，证明乳腺癌细胞能够通过激活调节增殖和细胞存活的替代途径，快速适应不同的环境和信号线索，这些事件可能在获得靶向治疗的耐药性方面发挥重要作用。
关键词：乳腺癌细胞系、药物反应、靶向治疗、3D细胞培养、HER2信号
介绍
癌细胞并不自主存在和功能，而是浸入由非上皮细胞（如成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞）组成的复杂微环境中，并嵌入细胞外蛋白基质中[1]. 细胞外基质（ECM）已被证明能够提供影响细胞内信号级联的生化信号和结构约束，并在确定正常乳腺上皮细胞在特定微环境中的行为方面发挥关键作用[2——5]. 尽管与非恶性细胞相比，癌细胞对环境扰动的敏感性较低，但在不同的培养环境下，癌细胞在信号转导方面表现出不同的调控[6——10]对靶向特定信号通路药物的研究具有重要意义[11——17].
人类表皮生长因子受体2型（HER2）在大约15-20%的乳腺癌中扩增和过度表达，并与侵袭性疾病和不良预后相关[18]. 随着曲妥珠单抗（Herceptin，Genentech Inc.）的问世，一种靶向HER2的单克隆抗体被证明可以显著提高HER2阳性患者的生存率[19]，已经确定并开发了几种新型HER2靶向药物。其中包括抑制HER2与其他HER受体二聚化的单克隆抗体Pertuzumab（Omnitarg，Genentech），以及靶向HER1（EGFR）和HER2的双小分子酪氨酸激酶抑制剂Lapatinib（Tykerb，GlaxoSmithKline）。尽管乳腺癌患者的靶向治疗前景广阔，从头开始的获得性耐药性仍然是临床上的主要障碍[20]. 因此，需要进一步的体外研究来阐明能够解释并帮助克服靶向药物耐药性的分子机制。为此，希望使用细胞系统来提供更紧密地概括乳腺癌细胞中的体内样信号传导的背景，以增加将培养模型的结果转化为患者护理的可能性。
在这里，我们采用了一个3D细胞培养模型，其中乳腺癌细胞生长在富含层粘连蛋白的ECM（lrECM）之上，允许肿瘤样集落的形成以及细胞与ECM的相互作用[三，21]. 当前研究的目的是双重的：（1）确定ECM和3D结构是否调节曲妥珠单抗、佩图祖单抗和拉帕替尼对乳腺癌细胞系的反应，这些细胞系中含有HER2型与单层培养相比，基因扩增和过度表达；（2）研究在所述条件下，细胞与ECM的相互作用是否对HER2信号传导产生影响。
材料和方法
细胞培养和药物治疗
按照ATCC的指示维持AU565、SKBR3、HCC1569和BT549乳腺癌细胞系（ATTC）。对于2D培养中的药物治疗，细胞接种在含有1%FBS的H14培养基中的8孔室载玻片上[22，23]. 为了在3D培养中进行治疗，将单个细胞接种在含有1%FBS和5%Matrigel的H14培养基中的Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤基质（Matrigel，BD Biosciences）顶部[9，22]. 以2.1×10的密度电镀AU565、SKBR3和HCC15694细胞/厘米2和BT549，1.6×104细胞/厘米2如前所述[9]在细胞培养后第4天添加药物或对照。
用抗HER2曲妥珠单抗（21µg/ml；Herceptin，由Genentech，Inc.善意提供）或Pertuzumab（25µg/ml；Omnitarg，由Genertech，Inc.恶意提供）的人源化单克隆抗体和针对EGFR和HER2拉帕替尼（1.5µM；Tykerb，由GlaxoSmithKline善意提供）的双小分子抑制剂处理细胞，β1整合素抑制性大鼠单克隆IgG1抗体AIIB2（160µg/ml；最初由加州大学旧金山分校Carolyn Damsky提供）或非特异性大鼠IgG2（25µg/ml）（皮尔斯生物技术公司）作为抑制性抗体的对照或DMSO作为拉帕替尼的对照。药物治疗48小时后分析细胞增殖情况，72小时后分析凋亡情况。
增殖和凋亡测定
按照制造商的说明，使用5-溴-2′-脱氧尿苷标记和检测试剂盒I（Roche），通过5-溴-2-脱氧尿嘧啶（BrdU）掺入来测量2D或3D培养物中生长的细胞的增殖。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染。如前所述，通过裂解Caspase 3（Asp175）的免疫荧光染色（细胞信号技术）检测在3D lrECM上生长的细胞的凋亡[9]. 用DAPI对细胞核进行复染。
如前所述，使用Solamere Technology Group旋转圆盘共聚焦系统在3D lrECM顶部生长的细胞的菌落中段采集共聚焦图像[9]. 对于在二维培养基中生长的细胞，荧光图像是在蔡司Axioplan 2成像显微镜和AxioCam相机上采集的。使用图像J（美国国立卫生研究院）对所有图像进行分析。通过量化BrdU或裂解Caspase 3阳性细胞的比例来确定增殖和凋亡指数[6，7]. 每种情况下至少评估200个细胞。对于每种药物或对照，增殖试验重复至少三次，凋亡试验重复至少两次。在观察者不知道细胞系和培养条件的情况下进行分析。条形图显示了与对照处理细胞相比，治疗药物中BrdU掺入的平均百分比。计算组间差异的同方差学生t检验；双尾的第页<0.05的值被认为是显著的。
蛋白质印迹
使用冰镇PBS/EDTA从3D lrECM培养物中提取细胞[6]. 如前所述进行蛋白细胞裂解物制备和蛋白质印迹[9]. 用牛血清白蛋白封闭膜，并用抗HER2（#2242）、磷酸化-HER2（Tyr1221/1222）（#2243）、HER3（#4754）、磷酸氢-HER3（Tyr1289）（#4791）、EGFR（#2232）、磷酸-EGFR（Tyr992）（#2235）、HER 4（#4795）、磷酸-HER4（Tyr 1284）（#4757）、AKT（#4685）、磷酸-AKT（Ser473）（#4058）、MEK1/2（#9126）、，phospho-MEK1/2（Ser217/221）（#9121）（细胞信号技术）和β1整合素（#610467）（均为1:1000）。用辣根过氧化物酶连接的二级抗体孵育斑点，并用荧光化学8900成像仪（Alpha Innotech）使用化学发光（Pierce）进行可视化。
结果
乳腺癌细胞株对HER2靶向药物的反应因培养条件的不同而发生显著变化
为了评估ECM和组织结构是否对人类乳腺癌细胞对不同作用机制的HER2靶向药物的敏感性或耐药性有影响，我们分析了HER2型-扩增细胞系AU565、SKBR3和HCC1569以及作为对照的BT549细胞HER2型在2D和3D lrECM培养中，Trastuzumab、Pertuzumab或Lapatinib的基因扩增和过度表达。所选的细胞系小组反映了乳腺癌细胞系的每一种不同分子亚型：AU565和SKBR3细胞属于Luminal，HCC1569细胞属于Basal A，BT549细胞属于Basal B分子亚型[24] ().
表1
| 细胞系 | 分子亚型一 | HER2型放大 | 表皮生长因子受体b条 | HER2型b条 | HER3型b条 | HER4型b条 |
|---|
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| | | 二维 | 三维 | 二维 | 三维 | 二维 | 三维 | 二维 | 三维 |
|---|
| AU565年8月 | 鲁米纳尔 | + | + | + | + | + | + | + | 负极 | 负极 |
| SKBR3公司 | 鲁米纳尔 | + | + | + | + | + | + | + | 负极 | 负极 |
| 肝癌1569 | 基础A | + | + | + | + | + | ± | ± | 负极 | 负极 |
| 英国电信549 | 基底B | 负极 | + | + | 负极 | 负极 | 负极 | 负极 | 负极 | 负极 |
这个HER2型-与2D培养条件相比，扩增的AU565细胞系在3D lrECM上培养时对曲妥珠单抗显著更敏感（通过BrdU掺入测定，分别为55%的2D和18%的3D增殖抑制；第页< 0.0004). 与2D培养物相比，3D培养物中AU565细胞对佩图单抗的耐药率显著增加（3D抑制率为20%，2D抑制率为46%；第页< 0.002) (). 当SKBR3细胞作为3D集落生长时，它们对曲妥珠单抗治疗有抵抗力，但在2D单层中有反应（3D掺入率分别为103%和62%；第页< 0.0002) (). 拉帕替尼治疗可明显抑制AU565和SKBR3两种细胞系的增殖，并可改善培养条件(). 然而，在SKBR3细胞中，在3D和2D培养模型中生长时，这种增殖减少更为明显（2D和3D增殖抑制分别为68%和84%；第页< 0.006) ().
的响应(一)AU565年8月(b条)SKBR3、(c（c）)HCC1569和(d日)BT549细胞用21µg/ml曲妥珠单抗、25µg/mlPertuzumab或1.5µM拉帕替尼处理48小时，两组-(黑色条)和三维细胞培养(灰色条)由BrdU公司测量。条形图显示了与非特异性IgG1抑制抗体和DMSO拉帕替尼治疗的对照组相比，治疗药物中BrdU掺入的平均百分比。误差条代表平均值的标准误差，重复实验3次*第页< 0.05
尽管是从同一患者的胸腔积液中建立的，并且具有惊人相似的遗传和转录组特征（Spearman的rho用于微阵列比较基因组杂交和Pearson的rho第页AU565和SKBR3之间的基因表达数据值[24]为0.8388，第页<0.0000001和0.9689，第页分别<0.0000001），SKBR3和AU565细胞在培养条件下对药物治疗有明显反应。例如，当生长在3D lrECM上时，SKBR3菌落对曲妥珠单抗治疗具有耐药性，而AU565菌落则敏感（分别为103%SKBR3和45%AU565 BrdU掺入；第页< 0.0001). 这些发现表明，尽管SKBR3和AU565细胞系在遗传和转录组水平以及HER家族蛋白水平上几乎相同(;) [9，24]很明显，它们在转录后发生了差异，因为它们在HER2下游表达不同的信号转导途径，当它们生长在3D lrECM凝胶中时（见下文）。
western blotting检测HER2、EGFR、HER3、HER4、MEK1/2和AKT的总水平和激活水平，以及β1整合素(一)AU565年8月(b条)SKBR3、(c（c）)HCC1569和(d日)BT549细胞生长在两（2D）或三维（3D）培养物中，用DMSO对照、21µg/ml曲妥珠单抗、160µg/ml AIIB2或21µ/ml曲妥珠单抗加160µg/ml AIIB2处理48小时。Trastu=曲妥珠单抗
这个HER2型-扩增的HCC1569细胞系含有PTEN公司-失活基因突变，已被证明在患者中产生曲妥珠单抗耐药性，在异种移植物模型中产生拉帕替尼耐药性[25，26]. 正如预期的那样，HCC1569细胞在2D和3D培养中对曲妥珠单抗治疗不敏感(). 然而，与单层培养相比，HCC1569细胞在3D lrECM中增殖时对佩图单抗或拉帕替尼治疗更敏感（BrdU掺入；佩图单单抗：104%2D vs.74%3D；第页< 0.008; 拉帕替尼：分别为65%2D和20%3D；第页< 0.008).
Basal B BT549细胞系，缺乏HER2型正如预期的那样，在2D和3D培养环境中，扩增和过度表达对HER2靶向药物曲妥珠单抗、佩图单抗和拉帕替尼具有耐药性(). 这一结果表明，在缺乏这些药物分子靶点的细胞系中，培养条件不会影响其对靶向药物的反应。
这些结果表明，2D和3D培养条件显著影响人源化单克隆抗体对HER2、曲妥珠单抗和佩图单抗的反应HER2型-扩增和过度表达乳腺癌细胞系。
使用β1整合素抑制抗体抑制细胞与ECM的相互作用可提高乳腺癌细胞对三维培养中HER2靶向药物的敏感性
细胞生长和存活受生长因子受体和粘附受体整合素家族的调节[27]. β1整合素亚单位是细胞与ECM相互作用的关键介质，已被证明在体内乳腺肿瘤的进展和维持中发挥作用[28]，以及在3D培养和体内抑制乳腺癌细胞生长[6，7，29，30]. 此外，之前我们已经报道了β1整合素和EGFR信号在3D培养中协调调节[6].
我们试图确定HER2型-在2D和3D培养物中，通过使用β1整合素抑制抗体AIIB2同时抑制β1整合素信号传导，可以增加对曲妥珠单抗和Pertuzumab的扩增细胞系AU565、SKBR3和HCC1569[6，7，29]. 对于联合治疗，使用与单剂治疗相同的方案。在曲妥珠单抗、佩图祖单抗或拉帕替尼中添加AIIB2对乳腺癌细胞株AU565、SKBR3、HCC1569和BT549的增殖没有显著的额外影响，但在SKBR3细胞中添加拉帕替尼比拉帕替宁加AIIB2治疗的情况除外(补充图1). 这些结果提供了一些解释：（1）β1整合素下游的信号通路未被激活，（2）2D培养的细胞不依赖β1整整素进行增殖或存活，或（3）在组织培养塑料上保存的乳腺癌细胞系中，β1整合素表达水平下调。相比之下，在3D lrECM中，与所有三种药物中的单一药物相比，联合使用曲妥珠单抗或佩图珠单抗治疗AIIB2的反应显著增加HER2型-扩增的细胞株，以及SKBR3细胞中拉帕替尼和AIIB2的组合(第页< 0.002) (). 相比之下，BT549癌细胞对AIIB2具有耐药性，无论是作为单一药物还是在3D培养中与HER2靶向药物联合使用。
的响应一AU565年8月，b条SKBR3、，c（c）HCC1569和d日在3D lrECM细胞上生长的BT549细胞用单一试剂处理48小时：21µg/ml曲妥珠单抗、25µg/ml佩图单抗、1.5µM拉帕替尼(黑色条)或与上述物质结合，再加上160µg/ml AIIB2(灰色条)由BrdU公司测量。条形图显示了与对照处理细胞相比，治疗药物中BrdU掺入的平均百分比（抑制抗体的非特异性IgG1；拉帕替尼的DMSO）。误差条代表平均值的标准误差，重复实验3次*第页< 0.05,t吨-测试：单代理与单代理加AIIB2
值得注意的是，在用HER2靶向剂AIIB2或两者的组合在3D lrECM中处理72小时的乳腺癌细胞系中，通过活化的Caspase 3染色测量，没有观察到细胞凋亡的显著增加。只有在SKBR3细胞、拉帕替尼治疗以及AU565和SKBR3的细胞中，拉帕替尼和AIIB2的联合治疗显著诱导了凋亡（SKBR3:Lapatinib vs.DMSO，第页< 0.009; 拉帕替尼加AIIB2与二甲基亚砜，第页< 0.0003; AU565:Lapatinib加AIIB2与DMSO，第页分别<0.0003）(补充图2). 这些发现表明，HER2靶向单克隆抗体曲妥珠单抗和佩图单抗主要对我们的3D模型中培养的乳腺癌细胞系产生细胞抑制（即减少增殖）而非细胞毒性（即诱导凋亡）作用。
2D和3D培养条件诱导乳腺癌细胞株中HER2下游信号的差异
鉴于所研究的乳腺癌细胞系中HER受体的基线蛋白表达水平在2D和3D培养中相似(;)，我们假设，对HER2靶向药物的不同药物反应是2D单层培养细胞或3D lrECM中肿瘤样集落培养细胞中HER2下游信号不同的结果。在酪氨酸激酶结构域磷酸化后，HER2通过激活RAS-MAPK途径促进增殖，并通过PI3K-AKT途径促进存活[31].
在所有三个HER2型-扩增后的乳腺癌细胞株，HER2下游信号通路激活的显著差异取决于培养微环境。事实上，AU565和SKBR3细胞系的HER2下游信号的差异在基因组和转录组学特征方面极为相似，这可能解释了它们对曲妥珠单抗和佩图单抗的2D和3D反应不同。在细胞培养塑料上生长时，AU565细胞显示AKT磷酸化，但MEK1/2没有磷酸化，这表明在这些培养条件下，AU566细胞中的HER2主要通过AKT途径发出信号。然而，在3D lrECM中，从AKT到MAPK通路的HER2下游信号的转换被观察到为MEK1/2，而不是AKT被磷酸化(). 在2D培养基中增殖和处理的SKBR3细胞中，我们发现AKT和MEK1/2磷酸化，这表明HER2下游的MAPK-和AKT-通路激活。相反，在SKBR3细胞系的3D lrECM中，HER2信号通过RAS-MAPK途径介导，这与AU565细胞相似，因为AKT在这些条件下没有磷酸化(). 有趣的是，与2D培养相比，3D培养的SKBR3细胞中HER2的磷酸化显著降低，这可能解释了在3D lrECM上生长的这些细胞中观察到的曲妥珠单抗耐药性[32]. 此外，我们的结果证明，尽管HER2型在3D培养条件下，该受体的扩增和过度表达并不构成调节SKBR3细胞增殖和细胞存活的主要生长因子受体。
这个HER2型-与2D培养相比，扩增的HCC1569细胞株清楚地显示出3D中EGFR的磷酸化增强。曲妥珠单抗对HER2的抑制也能诱导活化的EGFR减少，但对HER3或HER4没有影响()表明EGFR可能是这些细胞中HER2的首选二聚化伙伴。值得注意的是，这里研究的细胞系中没有一个像之前报道的那样表达HER4或激活HER4[24]. 如前所述，HCC1569细胞系含有PTEN公司-失活突变，提示PI3K-AKT信号的结构性激活[33]. 实际上，在两种培养条件下，HCC1569都显示AKT磷酸化。相反，RAS-MAPK通路的激活仅在3D培养物中发现，而不是2D培养物中().
值得注意的是，尽管培养在3D lrECM上的AU565和SKBR3细胞对β1整合素抑制抗体AIIB2有反应(，)在这些条件下，我们没有检测到任何β1整合素蛋白的表达。相反，β1整合素在HCC1569细胞中表达，并在3D lrECM中用AIIB2或曲妥珠单抗加AIIB2治疗后下调(，). 这些发现支持了我们早期的工作，即对AIIB2的反应并不一定与癌细胞中β1整合素表达的总水平相关[29].
在她的四个家庭成员中-HER2型-扩增的BT549细胞在二维和三维培养环境中仅表达EGFR；然而，没有检测到EGFR磷酸化和磷酸化AKT(). 然而，尽管事实上BT549细胞在两种培养条件下都对曲妥珠单抗、佩图单抗或拉帕替尼治疗产生了耐药性，但通过BrdU掺入测定，western blot分析显示，细胞培养环境的改变也诱导了该Basal B细胞系的通路激活的改变(). BT549细胞在细胞培养塑料中生长时，MEK1/2磷酸化，但在3D lrECM中没有。我们的结果表明，即使在HER2不表达的情况下，微环境也会影响PI3K-AKT和RAS-MAPK信号级联。
讨论
在这里，我们证明了HER2下游的信号转导途径激活，以及对HER2靶向药物曲妥珠单抗、佩图单抗和拉帕替尼的反应HER2型-2D和3D lrECM培养环境中扩增的乳腺癌细胞株存在显著差异。这些观察结果对专注于揭示潜在机制的体外研究具有重要意义从头开始的大多数接受抗HER2量身定制治疗的患者出现获得性耐药性。
我们的研究结果进一步表明，细胞与ECM的相互作用和乳腺癌细胞的3D形态对靶向HER2药物的反应具有显著影响。值得注意的是，我们的实验室和其他实验室已经发现3D组织结构本身可以调节癌细胞的药物反应[11，34]. 与传统的2D培养相比，使用聚HEMA涂层的组织培养皿将SKBR3细胞作为漂浮聚集体进行培养时，其对曲妥珠单抗的敏感性更高[13]. 与我们的3D lrECM模型不同，在该模型中，乳腺癌细胞通过细胞-ECM相互作用接收生化信号，而聚HEMA培养物在没有外源ECM供应的情况下诱导锚定非依赖性生长。我们已经证明，poly-HEMA上的细胞无法在非恶性乳腺细胞中诱导腺泡极性，而lrECM上的细胞则可以[35]. 这些结果可以解释poly-HEMA和我们的3D模型之间SKBR3对曲妥珠单抗反应的差异，为ECM对癌细胞行为的影响提供了额外证据。
细胞与ECM相互作用的关键介质之一是β1整合素，它在某种程度上类似于生长因子受体，调节正常细胞的细胞生长和存活，并与乳腺癌的发生和发展有关[6，29，30，36，37]. 与单一抗HER2药物相比，将β1整合素抑制抗体AIIB2添加到曲妥珠单抗或佩图单抗中，可显著增加3D生长的AU565、SKBR3和HCC1569细胞的反应(). 这在2D中未观察到。假设β1整合素在2D塑料培养的细胞中表达()，我们的结果进一步支持了这一结论[7，请参阅5，38]这表明β1整合素及其下游信号级联在组织培养塑料上增殖的细胞中不需要，并且在2D和3D条件下信号的调节有根本不同。
我们的数据提供了证据，表明细胞对HER2靶向药物的依赖性差异反应是HER2下游信号级联激活的结果。值得注意的是，这里研究的所有乳腺癌细胞株在2D和3D环境中显示了PI3K-AKT和RAS-MAPK通路之间的激活转换。
对正常乳腺细胞的广泛研究表明，这里使用的3D lrECM模型比传统的2D模型更准确地再现了乳腺的体内结构、信号和行为[2，三，5，17]. 有越来越多的证据表明，即使是癌细胞，3D细胞培养模型也可能比2D模型更好地模拟乳腺癌的组织特异性、行为和功能[15——17，39]. 我们的工作进一步证明，乳腺癌细胞系的3D形态与潜在的基因表达模式和功能密切相关[9]3D lrECM模型中观察到的乳腺癌菌落对β1整合素抑制抗体AIIB2的反应模式可以在裸鼠体内得到证实[29，30]. 在这里，我们提供了3D培养影响靶向治疗反应以及分子靶标下游信号传导的直接证据。
然而，最重要的是，我们的数据表明，乳腺癌细胞能够迅速适应新的环境和信号线索，并改变调节生存和增殖的信号通路，这显然在调节对特定靶向治疗药物的敏感性方面发挥了作用。根据我们的结果，可以假设不同解剖部位的转移性沉积物靶向治疗的不同反应可能源于不同的肿瘤-微环境相互作用模式。我们假设，为了最大限度地提高靶向治疗在临床上发挥作用的可能性，我们不仅需要了解治疗药物在癌细胞中直接抑制的途径，还需要了解同时激活和可能调节对特定药物反应的非靶向途径。
为了充分实现靶向治疗的承诺，需要更好地再现体内条件的培养系统。我们的数据表明，2D培养物可能不能代表疾病进展的所有阶段，直到最近，2D培养物几乎只用于功能基因组学、表观基因组学和药物敏感性筛选，以确定对给定分子信号的依赖性或对靶向药物的敏感性。肿瘤-微环境相互作用在乳腺癌进展的不同阶段（即原位、侵袭性、转移性）明显改变，因此，除了使用等基因系统或大量细胞系外，微环境的影响，在测试治疗药物时，还需要考虑ECM和3D形态。
致谢
我们感谢G.Lee（Genentech，Inc，South San Francisco）的讨论，感谢W.-L.Kuo和N.Bayani对细胞系的支持，感谢P.Kenny（纽约阿尔伯特爱因斯坦学院）和J.S.Reis-Filho（伦敦突破性乳腺癌研究中心）对手稿的批判性阅读。
BW得到了荷兰癌症协会博士后奖学金的支持。MJB实验室的工作得到了美国能源部生物与环境研究办公室（DE-AC02-05CH1123）、健康与环境研究室低剂量辐射项目杰出研究员奖（03-76SF00098）、国家癌症研究所奖5 R01CA064786、R01CA057621、，U54CA126552和U54CA112970以及美国国防部（W81XWH0810736）。CP得到了美国癌症协会（RSG-07-1110-01-CCE）和美国国立卫生研究院（R01CA124891）的资助；JWG由美国能源部生物与环境研究办公室科学办公室主任根据合同号DE-AC02-05CH1123授予，由国家卫生研究院、国家癌症研究所授予P50CA58207和U54CA112970，由SmithKline Beecham Corporation授予。
缩写
| 轻量化控制模块 | 富含层粘连蛋白的细胞外基质凝胶 |
| 二维 | 二维 |
| 三维 | 三维 |
| HER2型 | 人表皮生长因子受体2型 |
| 表皮生长因子受体 | 表皮生长因子受体 |
参与者信息
Britta Weigelt，美国加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室生命科学部，邮编：94720，加利福尼亚州伯克利市回旋加速器路1号，Mailstop 977R225A。
阿尔文·T·罗，美国加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室生命科学部，邮编：94720，加利福尼亚州伯克利市回旋加速器路1号，Mailstop 977R225A。
凯瑟琳·帕克，美国旧金山加利福尼亚大学综合癌症中心放射肿瘤学系。
Joe W.Gray，美国加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室生命科学部，邮编：94720，加利福尼亚州伯克利市回旋加速器路1号，Mailstop 977R225A。
米娜·比斯尔，美国加州大学伯克利分校劳伦斯伯克利国家实验室生命科学部，邮编：94720，加利福尼亚州伯克利市回旋加速器路1号，Mailstop 977R225A。
工具书类
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