FEBS信函。作者手稿；PMC 2010年7月28日发布。
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NIHMSID公司：美国国家卫生研究院222077
由CD74和CXCR4形成的功能性异聚MIF受体
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维雷娜·施瓦茨
一德国亚琛D-52074，Pauwelstrasse 30，RWTH亚琛大学生物化学和分子细胞生物学系
红旗路
一德国亚琛D-52074，Pauwelstrasse 30，RWTH亚琛大学生物化学和分子细胞生物学系
桑德拉·克莱默
一德国亚琛D-52074，Pauwelstrasse 30，RWTH亚琛大学生物化学和分子细胞生物学系
乔安娜·科尔比尔
一德国亚琛D-52074，Pauwelstrasse 30，RWTH亚琛大学生物化学和分子细胞生物学系
里贾娜·克罗恩
b条德国亚琛市Pauwelstrasse 30，D-52074，RWTH亚琛大学心血管分子研究所
金·奥尔
一德国亚琛D-52074，Pauwelstrasse 30，RWTH亚琛大学生物化学和分子细胞生物学系
理查德·布卡拉
c（c）耶鲁大学医学院，美国康涅狄格州纽黑文，邮编06520
克里斯蒂安·韦伯
b条德国亚琛市Pauwelstrasse 30，D-52074，RWTH亚琛大学心血管分子研究所
尤尔根·伯恩哈根
一德国亚琛D-52074，Pauwelstrasse 30，RWTH亚琛大学生物化学和分子细胞生物学系
监控编辑：Masayuki Miyasaka
一德国亚琛D-52074，Pauwelstrasse 30，RWTH亚琛大学生物化学和分子细胞生物学系
b条德国亚琛市Pauwelstrasse 30，D-52074，RWTH亚琛大学心血管分子研究所
c（c）耶鲁大学医学院，美国康涅狄格州纽黑文06520
1这些作者为这项工作做出了同等贡献。
摘要
MIF是一种趋化因子样炎症介质，通过与CXCR2和CXCR4结合触发白细胞募集。MIF还与CD74/不变链（一种单程膜受体）相互作用。我们确定了CD74和CXCR2之间的复合物在白细胞募集中的作用。尚不清楚CD74是否也与CXCR4结合。我们证明，当CD74与CXCR4在HEK293细胞中表达时，CD74/CXCR4复合物形成。缺乏ER抑制信号的CD74变异表达表明CD74/CXCR4复合物位于细胞表面。重要的是，内源性CD74/CXCR4复合物是通过联合免疫沉淀法从单核细胞中分离出来的。最后，MIF刺激的CD74依赖性AKT激活被抗CXCR4和抗CD74抗体以及AMD3100阻断，而CXCL12刺激的AKT激活并没有被抗CD74降低。因此，CD74与CXCR4形成功能复合物，介导MIF特异性信号。
关键词：CD74、CXCR4、MIF、趋化因子受体、GPCR、不变链
1.简介
巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）是一种结构独特的12.5kDa细胞因子，是感染性休克、克罗恩病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和癌症等急慢性炎症疾病的关键介质[1——4]. 与其历史名称相反，MIF被认为具有趋化因子样特性[5,6]并被鉴定为趋化因子受体CXCR2和CXCR4的非同源配体[5].
趋化因子是一种趋化性细胞因子，在免疫监测和炎症过程中协调白细胞的活化和募集。趋化因子及其G蛋白偶联受体（GPCR）的结构分类已经有了很好的定义。50多个趋化因子与大约20个受体结合，这就构成了配体作用的冗余[7——10]. CXCR2是ELR+趋化因子如CXCL8（白细胞介素-8，IL-8）或CXCL1/GRO-α的原型受体。CXCL8/CXCR2介导从炎性白细胞募集到癌细胞迁移和血管生成的病理生理过程[7]. CXCR4被认为是趋化因子CXCL12（基质细胞衍生因子-1α，SDF-1α）的唯一受体，尽管CXCR7最近被认为是CXCL12的替代受体[11]. CXCR4和CXCL12之间一夫一妻制关系的教条也受到了HIV gp120和MIF与CXCR4结合的观察结果的挑战[4,5,12]. CXCL12/CXCR4轴参与各种稳态和炎症细胞迁移过程，包括炎症和动脉粥样硬化性T细胞募集、干细胞归巢和癌细胞转移[7,13].
尽管架构相似，但MIF并不属于规范的CC、CXC、CX三C、 或趋化因子的C亚家族，并被归类为趋化因子样功能（CLF）趋化因子[4,5,14]. MIF与CXCR2的结合依赖于一个让人想起ELR基序的伪（E）LR基序[15]. MIF通过与CXCR2和CXCR4的双重相互作用，独特地触发动脉粥样硬化内皮上的单核细胞和T细胞阻滞，促进白细胞迁移，并增加动脉粥样硬化斑块的形成和进展[4,5].
MIF还与CD74相互作用，CD74是一种单程II型膜蛋白，也称为MHC II类不变链（II）[16]. Ii在内质网（ER）-溶酶体的运输过程中与MHC Ii类分子结合，并作为Ii类伴侣分子控制抗原肽负载。CD74是Ii的膜形式，它以较小的百分比进入质膜，可能是在硫酸软骨素修饰后。表面CD74在II类阳性细胞上表达，但在炎症刺激下，可以在II类阴性细胞的质膜上检测到，包括基质细胞和上皮细胞类型[17,18]. 有充分证据表明，MIF与CD74的表面相互作用导致ERK1/2-MAPK和AKT/PI3K信号的激活。CD74对MIF调节B细胞存活也很重要[19]. MIF触发的ERK1/2信号需要CD44和非受体酪氨酸激酶的募集[16,20]. 我们最近确定了CD74和CXCR2之间的受体复合物。这种相互作用的确切分子细节尚不清楚，但CD74/CXCR2复合物在MIF驱动的动脉粥样硬化性白细胞募集中起着重要作用[5]. CD74与CXCR2的结合证明了GPCR和单程跨膜蛋白之间异聚受体复合物的形成，并可能与受体酪氨酸激酶（RTK）复合物和GPCR之间的串扰有关[4,5].
我们检测了CD74是否与CXCR4相互作用，CXCR4是MIF使用的第二个趋化因子受体。应用流式细胞术和荧光显微镜，我们确定转染CD74和CXCR2标记融合蛋白的HEK293细胞表达这两种受体。应用一种缺乏ER保留信号的CD74变异体来验证细胞表面CD74和CXCR4之间的相互作用，该变异体可以防止CD74在没有II类的情况下的表面转运。然后，我们通过联合免疫沉淀（CoIP）/下拉分析和共焦显微镜（使用过度表达的受体融合和内源性蛋白）研究了这些受体之间的相互作用。通过应用CXCR4特异性小分子抑制剂，并通过比较MIF和CXCL12在有无阻断抗CD74和抗CXCR4抗体的情况下的作用，在MIF-触发的CD74依赖性信号检测中解决了CD74和CXCR4之间的功能相互作用。
2.材料和方法
2.1. 质粒、抗体和试剂
如前所述制备重组人MIF（rMIF），其内毒素浓度可忽略不计（<10 pg内毒素/μg MIF）[21]. AMD3100是从Sigma购买的。
描述了V5标记CD74的质粒pcDNA3.1/V5-His-TOPO-CD74[16]. pEYFP-C1-CD74是通过将编码人CD74的cDNA克隆到pEYFP-C1中而产生的，其中CD74的基因是从pcDNA3.1/V5-His-TOPO-CD74中扩增出来的[16]使用引物：5′-TCCGCTCGAGCACAGGAGGAGA-3′和5′-AGCGATATTCCGTCACATGGACTGGCC-3′。无ER滞留信号的人CD74 p33变异体的未标记CD74质粒编码[22]这种大量靶向细胞表面的药物被称为pCD74minRTS，是Carolus Therapeutics（美国加利福尼亚州圣地亚哥）赠送的礼物。通过将CD74minRTS插入pEYFP-C1（见上文），克隆了pEYFP-C1-CD74minRT。将人CXCR4 cDNA克隆到pECFP-N1中，得到pECFP-N1-CXCR4。从pcDNA3.1-CXCR4（HA）中扩增出CXCR4 cDNA三（密苏里州科技cDNA资源中心）使用引物：5′-TCCGCTCAGCCATGTACCCATACGAT-3′和5′-AGCGAATTCGCTGGAGAAAACTTGAAG-3′。pBABEpuro来自B.Lüscher（亚琛RWTH大学），最初来自美国Addgene。
使用的抗体有：小鼠单克隆抗体（mAb）-V5（R960-25，Invitrogen，Karlsruhe，德国）、大鼠抗HA mAb（3F10，Roche Diagnostics，德国曼海姆）、小鼠同种型控制IgG1（14-4714，eBioscience，美国圣地亚哥）、人抗CD74 mAb，人抗CD74单克隆抗体（C-16，sc-5438，Santa Cruz Biotechnology）、多克隆兔抗CXCR4（c8352，Sigma，Taufkirchen，德国）、辣根过氧化物酶（HRP）结合的抗鼠抗体（1858413，Pierce Biotechnology，Rockford，USA）、HRP结合的抗大鼠抗体（NA9350，GE Healthcare/Amersham，Freiburg，Germany）和HRP-结合抗兔IgG（1858415，Pierce）用于CoIP和下拉。流式细胞术采用荧光素偶联的小鼠抗人CXCR4（FAB170f，R&D Systems）和小鼠抗人CD74（M-B741，555540，BD Pharmingen）。AKT信号检测使用了抗磷酸AKT（Ser 473特异性，Cell Signaling，Danvers，MA，USA）、抗肌动蛋白（Ab 691001，MP Biomedicals，Eschwege，Germany）、HRP结合羊抗鼠IgG（GE Healthcare）和HRP结合驴抗兔IgG。在中和实验中，使用了抗人CXCR4单克隆抗体（MAB171，R&D Systems，Wiesbaden，Germany）、抗人CD74（Ab 555612，BD Pharmingen，Heidelberg，Gerany）和同型IgG1（eBio-sciences）。其他试剂是市面上可买到的最高等级试剂。
2.2. 细胞培养和转染
包括培养基、补充剂和抗生素在内的细胞培养试剂来自Invitrogen（德国卡尔斯鲁厄）。除非另有说明，否则细胞培养实验在37°C下，在含5%CO的湿润培养箱中进行2.
人类胚胎肾细胞（HEK293）和MonoMac6人类单核细胞购自德国微生物和细胞培养学会（DSMZ，德国布伦瑞克）。HEK293细胞在添加了含4.5 g/l谷氨酰胺™的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养天-葡萄糖和丙酮酸钠，含10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素/链霉素（P/S）。MonoMac6细胞在含有10%FCS、1%P/S、1%非必需氨基酸（NEAA）、9μg/ml人胰岛素（赛诺菲-安提斯）和1mM丙酮酸钠的RPMI 1640培养基中培养。Jurkat T细胞购自ATCC（TIB152），在含有10%FCS和1%P/S的RPMI 1640培养基中培养。
对于HEK293的瞬时转染，使用了罗氏诊断公司（德国格伦扎奇威伦）的FuGENE HD转染试剂。
2.3. 流式细胞术
对HEK293转染体、MonoMac6和Jurkat细胞进行流式细胞术。流式细胞术分析之前，将Jurkat T细胞置于含有降低浓度FCS（0.5%）的培养基中处理24–48小时。每次测量时，用缓冲液（1×磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.2，含0.5%牛血清白蛋白（BSA）和0.1%叠氮化物）清洗20万个细胞一次。用抗CXCR4-FITC（1:3.5）或抗CD74-FITC（1:20）标记细胞。清洗和再悬浮后，在FACS Canto™（BD Bioscience，Heidelberg，Germany）上对细胞进行分析。
2.4. 免疫荧光显微镜和共定位分析
接种后1天，分别用pECFP-N1-CXCR4、pEYFP-C1-CD74minRTS和pBABEpuro瞬时转染HEK293细胞，并在37°C和5%CO下培养24小时2改变培养基并通过添加嘌呤霉素（1μg/ml，Calbiochem，Darmstadt，Germany）选择细胞24小时。抽吸培养基，分离细胞并以1250 rpm离心5分钟。抽吸上清液，将颗粒重新悬浮在DMEM培养基中。至含有无菌聚乙烯的6孔板的一孔-L（左）-赖氨酸涂层盖玻片，加入3ml细胞悬浮液。种子细胞在37°C和5%CO下培养24小时2，在活细胞成像条件下清洗[5]并使用Axiovert 100 M共焦显微镜进行研究（德国奥伯科钦卡尔蔡司）。
2.5. 协同免疫沉淀和下拉实验
质粒pcDNA3.1/V5-His-TOPO-CD74和pcDNA3.1-CXCR4（HA）组合转染48小时后三，或pCD74minRTS和pcDNA3.1-CXCR4（HA）三，HEK293转染体被CoIP缓冲液（50 mM Tris–HCl，pH 7.4，含有100 mM NaCl，15 mM EGTA，1%Triton X-100，1%CHAPSO，0.02%叠氮化物和蛋白酶抑制剂混合物（Calbiochem，Darmstadt，1:100）破坏。清除裂解物后，将样品与抗V5或-HA抗体或同种小鼠IgG在4°C下孵育2小时1（阴性对照）。蛋白G珠（法兰克福NEB）用含有1%BSA的PBS封闭，并重新悬浮在200μl CoIP缓冲液中。将裂解物与预处理的蛋白-G珠在4°C下孵育过夜。用500μl CoIP缓冲液和4×1:5稀释的CoIP缓冲溶液清洗一次带有结合免疫复合物的珠子。将珠重新悬浮在样品缓冲液中，并对样品进行SDS-PAGE/Western印迹。用大鼠抗HA（1:2000）、小鼠抗V5（1:5000）、兔抗CXCR4（1:1000）或抗CD74（1:500）抗体显示斑点。HRP结合的抗鼠（1:1000）或抗鼠（1-1000）抗体用作次级抗体。化学发光由ECL（Pierce）检测。对于相应的下拉控件，分别用抗V5、抗HA或抗CXCR4反向显影印迹。
为了免疫沉淀内源性受体复合物，在应用上述方案之前，MonoMac6细胞在人干扰素-γ（Peprotech，1:100）存在下培养72小时。用抗CD74抗体和IgG对这些细胞的裂解液中的受体复合物进行下拉1作为对照。对于蛋白质印迹，使用抗CXCR4（1:1000）抗体作为第一抗体，使用HRP缀合的抗兔IgG（1:1000）作为第二抗体。用抗CD74蛋白免疫印迹法（1:500）显示CD74下拉对照。
2.6. AKT信号转导分析
为了对Jurkat细胞进行AKT活化分析，细胞在含有10%FCS的RPMI 1640培养基中生长，并用RPMI 1640/0.5%FCS替换培养基培养24小时。未经处理的Jurkat电池和那些预先用CXCR4特异性抑制剂AMD3100培养的细胞（1μg/ml，30分钟）用rMIF培养（0-1250 ng/ml，10分钟）。为了阻断CD74或CXCR4，用10μg/ml中和性抗CD74单克隆抗体或10μg/ml抗CXCR4单克隆抗体预处理细胞30分钟。对于对照，用同种IgG预处理。使用Aida图像分析仪软件（德国柏林Raytest Isotopen）通过带密度测定法计算磷酸化比率（phospho-Ser473-AKT/actin）。
2.7. 统计分析
两组数据之间的统计显著性由Student’st吨-测试。低于0.05的P值被认为具有统计学意义。
3.结果
3.1. CD74和CXCR4受体融合蛋白的克隆化和蛋白复合物的形成
为了研究CD74和CXCR4之间的相互作用，我们应用了以下融合蛋白：（i）V5-His-tagged p35形式的CD74，（ii）HA-taged CXCR4，和（iii）带有CFP-tag的CXCR4-CFP C末端与CXCR4融合。在不表达MHCⅡ类的细胞中，一种缺乏介导CD74内质网滞留的ER滞留信号的CD74变体（CD74minRTS）被用作未标记蛋白（iv）和YFP标记的融合蛋白，YFP连接到CD74的N末端（v）。
使用Western blotting，我们首先确定CD74和CXCR4融合蛋白在HEK293细胞中高效过度表达，HEK294细胞不内源性表达CD74，仅表达低水平的CXCR4（数据未显示）。流式细胞术直方图证实了HA标记的CXCR4的表达，并证明了该受体融合蛋白的表面定位(). 然而，在HEK293细胞表面无法检测到V5标记的CD74(). 已知Ii/CD74只有一小部分靶向表面，而大部分仍局限于内质网/溶酶体室。因此，我们体外表达了CD74minRTS变异体，证明其具有丰富的表面表达(). 为了进一步证实CXCR4和CD74的表面表达，我们将CXCR4-CFP和YFP-CD74minRTS应用于共焦荧光显微镜研究。这些实验证实了两种受体结构的显著表面表达()并证明YFP-CD74和CXCR4-CFP共同定位于双转染剂的质膜部分。与CXCR4在表面靶向之后也迅速重新内部化的概念一致[23]荧光融合受体之间的细胞内共定位也被观察到，特别是在YFP-CD74过度表达的亚细胞点().
过度表达后MIF受体融合蛋白的细胞表面表达。融合蛋白HA-CXCR4、V5-CD74、CD74minRTS以及YFP-CD74minRTS和CXCR4-CFP在HEK293细胞中体外表达。（a） 表达HA标记CXCR4的HEK293细胞的流式细胞术直方图。比较抗CXCR4染色细胞（绿色）和FITC-IgG染色细胞（灰色）的荧光强度。（b） 表达V5标记CD74的HEK293细胞的流式细胞术直方图。比较抗CD74染色细胞（红色）和FITC-IgG染色细胞（灰色）。（c） 表达CD74minRTS的HEK293细胞的流式细胞术直方图。比较抗CD74染色细胞（红色）和FITC-IgG染色细胞（灰色）的荧光强度。注：CD74中ER滞留信号的缺失增强了CD74的细胞表面表达（与c和b相比）。（d） CXCR4-CFP和YFP-CD74minRTS在HEK293细胞中的克隆化。使用Axiover 100M/Zeiss LSM510共焦显微镜进行荧光显微镜分析。箭头表示细胞表面CXCR4-CFP和YFP-CD74minRTS之间存在强共定位点。箭头+星号表示有明显的细胞内共定位点（可能是溶酶体内）。底部的细胞在整个质膜上显示出共定位。
接下来我们用生化方法研究了CD74和CXCR4受体复合物的形成。V5标记的CD74被抗V5抗体从HEK293裂解物中拉下，并通过使用抗HA或抗CXCR4抗体的蛋白质印迹显示共沉淀的CXCR4。在这些条件下检测到强的CXCR4条带，而单独应用G蛋白珠的下拉印迹没有CXCR4，这表明在HEK293细胞中过表达的V5-CD74与HA-CXCR4强烈结合(，左）。通过抗V5蛋白印迹证实了拉脱效率(，右侧）。为了证实这一点，在相反的设置下进行了下拉/蛋白质印迹实验，即用抗HA下拉CXCR4，用抗V5抗体进行印迹显影。这个实验产生了一个特定的带，再次表明CD74/CXCR4复合物的形成，而对照下拉仅显示了一个弱的非特异性带(，左）。通过抗HA或抗CXCR4 Western blot证实了下拉效率(，右侧）。为了探讨CD74的质膜表达增加是否会导致CXCR4/CD74复合物的下拉率提高，将pCD74minRTS、pHA-CXCR4和抗HA抗体下拉的复合物一起转染HEK293细胞。事实上，没有ER保留信号的共沉淀CD74的带比V5全长CD74的更明显（相比之下，左为，左），表明CXCR4/CD74复合物在质膜上形成更有利。抗HA蛋白印迹再次证实了下拉效率(，右侧）。
联合免疫沉淀显示过度表达CXCR4和CD74的蛋白质复合物形成。HA-CXCR4和V5-CD74融合蛋白或HA-CXCR与CD74minRTS蛋白在HEK293细胞中体外表达。（a，左）用抗V5抗体免疫沉淀V5-CD74，用抗HA或抗CXCR4抗体检测共沉淀CXCR4。（a，右）为CD74开发的对照印迹。（b，左）如（a）所示的反向设置，用抗HA抗体进行免疫沉淀，用抗V5抗体进行免疫印迹。（b，右）通过抗HA或抗CXCR4抗体为CXCR4开发的对照印迹。（c，左）设置如（b）所示，但转染pCD74minRTS并用抗CD74抗体形成印迹。（c，右）为CXCR4开发的控制印迹。仅用珠子进行对照免疫沉淀（对照）；输入通道表明对5%的相应HEK293裂解产物进行了Western blot分析。分子量标准品在相同的凝胶（Mr）中电泳。免疫沉淀；WB、Western blot。表明次级WB抗体对免疫球蛋白重链（IgG-HC）和轻链（Ig G-LC）进行了非特异性染色。请注意，抗HA抗体是一种较差的WB抗体；因此，CXCR4的输入控制显示弱或无带，但可通过抗CXCR4检测到（a、左侧和b、右侧的下部面板）。
3.2. 内源性表达CD74和CXCR4受体的蛋白复合物形成
为了验证CD74和CXCR4相互结合，我们研究了人单核细胞MonoMac6内源性表达蛋白的受体复合物形成。这些细胞在其表面内源性表达大量的两种受体(). 重要的是，当用抗CD74免疫沉淀MonoMac6细胞的裂解物时，发现内源性CXCR4与抗CXCR4的Western blot共沉淀，显示约40 kDa处有一条强条带，而对照CoIP中没有该条带(). 第二个明显特异的带在45-47 kDa处出现，可能代表不同糖基化CXCR4物种。通过抗CD74印迹证实了拉脱效率(). 因此，部分内源性表达的CD74可以与单核细胞中内源性表达CXCR4的部分结合。
单核细胞内内源性CXCR4/CD74受体复合物的形成。从MonoMac6细胞裂解物中共免疫沉淀内源性CD74/CXCR4复合物。（a） 流式细胞术直方图显示MonoMac6中CXCR4的丰富表面表达。将抗CXCR4染色的细胞（绿色）的荧光强度与用FITC-IgG染色的细胞（灰色）的荧光强度进行比较。（b） 流式细胞术分析，如a，但用抗CD74染色（红色）。（c） 共免疫沉淀显示内源性CXCR4/CD74复合物的形成。对MonoMac6裂解产物进行抗CD74免疫沉淀，并使用抗CXCR4蛋白印迹检测复合CXCR4。（d） 为CD74开发的对照印迹。仅用珠子进行对照免疫沉淀（对照）；输入通道表明对5%的MonoMac6裂解物进行了Western blot分析。分子量标准品在同一凝胶（Mr）中电泳。免疫沉淀；WB、Western blot。表明次级WB抗体对免疫球蛋白重链（IgG-HC）和轻链（Ig G-LC）进行了非特异性染色。*表明除了40 kDa的主要CXCR4带外，还检测到了第二个特异带，这可能代表不同糖基化的CXCR4变体（47 kDa）。
3.3. MIF刺激的T淋巴细胞AKT活化依赖于CD74和CXCR4
我们之前在小鼠胚胎成纤维细胞中证实了MIF对CD74依赖性AKT的激活[24]. 在这里，我们询问在MIF信号传导期间，CD74和CXCR4之间的复合物形成是否伴随着这些受体之间的功能相互作用。Jurkat T细胞中AKT激活，其内源性在质膜上表达明显水平的CXCR4和CD74()，由rMIF触发。为了询问MIF刺激的AKT激活是否由CXCR4/CD74复合物介导，CD74被中和CD74抗体阻断，CXCR4被AMD3100或CXCR4抗体抑制。将结果与不含抑制剂的MIF刺激细胞进行比较。刺激后10分钟测量磷酸AKT水平。证明AMD3100阻止了此MIF信令过程。磷酸化AKT与肌动蛋白比率的密度扫描显示，由于AMD3100，MIF-依赖性AKT磷酸化显著降低。同样，抗CXCR4和抗CD74都抑制MIF刺激的AKT信号。相反，只有抗CXCR4才能显著阻断SDF-1α诱导的AKT磷酸化(). 总之，这证实了MIF-而非SDF-1α诱导的AKT信号是由CD74/CXCR4复合物介导的。
CXCR4/CD74受体复合物的形成与CD74和CXCR4之间的功能相互作用有关。CXCR4抑制剂AMD3100以及抗CXCR4和抗CD74抗体阻断了Jurkat T细胞中MIF介导的AKT激活，而SDF-1α介导的AKT激活仅被抗CXCR4+而非抗CD74降低。（a） 流式细胞术直方图显示了CXCR4在Jurkat T细胞中的表面表达。将抗CXCR4染色的细胞（绿色）的荧光强度与用非特异性FITC IgG染色的细胞（灰色）的荧光强度进行比较。（b） 流式细胞术直方图显示Jurkat T细胞中CD74的表面表达。比较抗CD74染色细胞（红色）和非特异性FITC-IgG染色细胞（灰色）的荧光强度。（c） 用AMD3100（1μg/ml，30 min；+AMD3100+）或对照缓冲液预处理的Jurkat细胞与指定浓度的rMIF孵育10 min，并使用磷酸化-Ser473-AKT抗体通过Western blot测定AKT活化。肌动蛋白染色用于印迹的标准化。（d） 根据（c）（磷酸化比率：AKT/actin；平均值n个= 2). （e） 与c组相同，但Jurkat细胞用抗CD74、抗CXCR4抗体或对照IgG1预处理（每个10μg/ml，30分钟）。以100 ng/ml的浓度添加MIF，并用100 ng/ml SDF-1α刺激对照细胞。（f） 根据（e）对印迹进行定量（磷酸化比率：AKT/肌动蛋白n个=2）。
4.讨论
MIF是一种炎症细胞因子[1]具有趋化因子样特性[5,6,25]. MIF激活靶细胞的受体机制一直不清楚。目前已知，依赖于靶细胞和炎症环境，MIF可以与三种受体结合：（i）CD74，MHC II类不变链的膜形式[16]，（ii）CXCR2，ELR+CXC趋化因子（如CXCL8）的同源受体[5]和（iii）CXCR4，SDF-1α/CXCL12的同源受体[5]. 通过与CD74的相互作用，MIF刺激ERK1/2和AKT信号传导，调节细胞增殖和存活[16,20,24,26]. MIF/CXCR2和MIF/CXXR4配体/受体轴分别对致动脉粥样硬化的单核细胞/中性粒细胞和T细胞募集至关重要，并涉及G我蛋白质、PI3K-、钙和整合素介导的信号[4,5,25,27]. 动脉粥样硬化动脉中的抗体阻断实验表明，MIF募集致动脉粥样硬化白细胞依赖于CD74，MIF/CD74和MIF/CXCR2或MIF/CSCR4信号通路之间存在重叠/串扰[5]. 受体结合研究表明，MIF可以单独与CD74或CXCR2/CXCR4结合，且亲和力高，与其他受体类型是否共表达无关；然而，当CD74与CXCR2或CXCR4在单核细胞上同时表达时，会放大MIF触发的反应[5]. 因此，有人提出可以形成功能性异体CD74/CXCR受体复合物。事实上，在CD74和CXCR2过度表达或在半内源性表达条件下，异体CXCR2/CD74受体复合物已经被证明[5].
在此，我们询问CXCR4/CD74受体复合物是否存在并对MIF有反应。我们提供证据表明，CXCR4和CD74的部分在过度表达条件下，以及在单核细胞和T细胞内源性条件下，可以形成复合物。此外，我们的研究表明，CXCR4/CD74复合物对MIF有反应，因为MIF触发的T细胞CD74依赖性AKT激活被CXCR4小分子抑制剂AMD3100以及CD74和CXCR4抗体阻断。
CD74和CXCR4均形成同聚低聚物。被认为在内质网/高尔基体/溶酶体传代过程中与MHC Ii类相互作用的CD74/Ii寡聚物是CD74/Ii三聚体。目前尚不清楚CD74三聚体是否出现在细胞表面，尽管非聚合体MHC II/II复合物的质膜外观和高表面周转率被认为有助于MHC II/II复合物内体靶向[18,28——31]. 在高尔基体/溶酶体室中Ii类分子的相对Ii丰度情况下，过量的Ii分子会移动到质膜。此外，CD74可以在没有II类的情况下运输到质膜[18]. 已发现CXCR4和CXCR2一样形成二聚体复合物，并且在某些局部或炎症条件下观察到高阶低聚物[32]. 这里我们证明CXCR4和CD74的部分可以形成异聚受体复合物。
虽然不寻常，但趋化因子/GPCR系统和单程受体之间的相互作用并不是前所未有的。除了CD74/CXCR2相互作用外，许多报告表明GPCR和受体酪氨酸激酶（RTK）之间存在信号交叉[33,34]. 还观察到CXCR4和RTK之间的交叉对话[35]. 值得注意的是，CD74与血管紧张素II I型受体（AGTR1）直接相互作用，这是一种典型的GPCR[36]. 有趣的是，AGTR1上CD74的结合位点位于羧基末端尾部，该位点对AGTR1退出内质网很重要，在许多GPCR中都是保守的[36].
总的来说，对于低聚物CXCR趋化因子受体物种的潜在不同功能，人们知之甚少。CCR趋化因子受体也是如此，已检测到几种寡聚物[32]. 因此，我们的研究增加了对同源和异源趋化因子受体齐聚功能的理解。
CD74/CXCR4相互作用的鉴定为已知与CD74或CXCR4结合的有限数量的蛋白质增加了新的蛋白质实体。迄今为止，HLA-DR、CD44、AGTR1和MIF已被证明与CD74结合[16,29,36,37]. CXCR4的蛋白质相互作用伙伴的当前列表也很有限。除了CXCL12[38,39]和MIF[5,12]，只有HIV gp120被发现与CXCR4结合[38].
CD74与CD44相互作用，CD44参与介导MIF信号传导[20,37]. 事实上，CD44被认为是CD74的信号转导共受体[20]. 基于CXCR4和CD74之间的相互作用，研究CXCR4/CD74复合物是否包含CD44，或者CD44是否可以被招募到这些复合物中，这将是很重要的[20,24]. 沿着这个概念，推测异源三聚体CXCR2/CD74/CXCR4或异源四聚体CXCR2/CD74/CXCR 4/CD44复合物是很有趣的。目前尚不清楚CXCR4/CD74复合物是预先形成的，还是在配体活化后诱导形成的。另一个尚未解决的问题是CXCL12/SDF-1a是否与CXCR4/CD74复合体相互作用。我们的AKT实验中，CXCL12刺激的AKT磷酸化被抗CXCR4抑制，但几乎没有被抗CD74抑制。之前已经获得了CD74和CXCR4之间功能性相互作用的提示。例如，Marsh及其同事在II型肺泡上皮细胞中观察到CD74和CXCR4的共表达，但没有测试直接的功能相互作用[40].
本文确定的CD74/CXCR4相互作用的功能含义可能很重要。然而，考虑到CD74的一部分仅在大多数Ii/Ii类阳性细胞的细胞表面表达，并且趋化因子受体的表达，如CXCR4的表达在细胞内达到了可观的百分比，应该强调的是，功能表面表达的CD74/CXCR4复合物可能只代表给定细胞中表达的CD74和CXCR4池的一小部分。然而，在炎症情况下，这种分布可能会发生变化，有利于表面表达池。
CD74介导炎症细胞因子MIF的几个关键活性。同样，CXCL12/CXCR4轴控制炎症和免疫中的T细胞贩运等关键过程[7,9,41]、肿瘤细胞侵袭、转移[42]和干细胞归巢[43]. MIF与CXCL12分享其一些活动[5]. 另一方面，MIF和CXCL12表现出不同的活性特征，至少在致动脉粥样硬化T细胞募集和动脉粥样硬化进展方面如此[5]. 因此，除了揭示CD74/CXCR4复合物形成和化学计量的分子细节这一生化挑战外，CD74/CXXR4复合物可能对MIF与CXCL12作用的规范化也很重要。
致谢
我们感谢G.Müller-Newen和S.Wüller对共焦显微镜的帮助，感谢M.Dewor对受体融合蛋白克隆的帮助，以及R.Koenen的宝贵讨论。这项工作得到了德国联邦基金会（DFG）授予J.Bernhagen的拨款编号SFB 542/TP-A7和BE1977/4-1，DFG授予C.Weber的拨款编号WE1913/11-1，以及NIH授予R.Bucala的拨款。
缩写
| CoIP公司 | 共免疫沉淀 |
| CXCR公司 | CXC型趋化因子受体 |
| CXCL公司 | CXC型趋化因子配体 |
| 全球采购控制报告 | G蛋白偶联受体 |
| 第二章 | 不变链 |
| MIF公司 | 巨噬细胞移动抑制因子 |
| SDF-1α | 基质细胞衍生因子-1α |
参考文献
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