进展素诱导的端粒功能障碍在HGPS细胞过早衰老中的作用

TERT阻断进展诱导的DNA损伤信号

DNA损伤触发参与DNA损伤反应的蛋白质磷酸化和/或活化。其中包括H2AX，H2A组蛋白的一种变体，它分布在染色质中，并在新生的双链断裂处迅速磷酸化（γH2AX），以及通过自磷酸化（ATM）激活的ATM-P（P）)并被招募到双链断裂现场(Riches等人，2008年). 这些蛋白质在DNA损伤部位的细胞中形成离散的病灶，因此是此类损伤的有用标记。据报道，HGPS成纤维细胞表现出增加的DNA损伤信号(Liu等人，2005年;刘等人，2006). 当我们比较外源性TERT表达对γH2AX和ATM数量的影响时-P（P）在这些细胞中观察到的病灶，我们发现TERT表达导致此类病灶数量显著减少(图2A、B). 同样，ATM的总水平-P（P）通过免疫印迹分析可检测的在表达TERT的HGPS成纤维细胞中显著减少(图2C). HGPS成纤维细胞中TERT表达的影响很快，在选择后7天γH2AX水平显著降低，这种降低与相同细胞的增殖能力增加有关(图2G).

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图2。

TERT阻断进展诱导的DNA损伤信号。(一个)γH2AX（绿色）和ATM的共焦免疫荧光显微镜-P（P）逆转录病毒转导和标记物选择后2周，表达TERT或载体控制的HGPS成纤维细胞中的（红色）DNA损伤灶。合并后的图像叠加在DNA的DAPI（蓝色）染色上，γH2AX和ATM共定位-P（P）黄色。(B类)染色定量如A所示。含有0、1、2-5或>5γH2AX和ATM的细胞百分比-P（P）显示焦点。每种情况下，至少有300个细胞被计数。(C类)显示ATM水平的蛋白质印迹-P（P）感染和选择后2周，HGPS成纤维细胞表达TERT或载体对照。β-肌动蛋白水平显示为对照。(D类)Western blots比较HGPS成纤维细胞中内源性前体蛋白和NDF中异位前体蛋白的水平。层粘连蛋白A、层粘连蛋白C和β-肌动蛋白水平显示为对照。(E类)γH2AX（绿色）和ATM的共焦免疫荧光显微镜-P（P）慢病毒转导和选择后，在有或无异位TERT和表达前体蛋白或载体控制的NDF中出现（红色）DNA损伤灶。合并后的图像叠加在DNA的DAPI（蓝色）染色上，γH2AX和ATM共定位-P（P）黄色。(F类)E中显示的染色定量。含有0、1、2-5或>5γH2AX和ATM的细胞百分比-P（P）显示焦点。每种情况下，至少有300个细胞被计数。(克)异位TERT表达的HGPS成纤维细胞延长寿命和减少DNA损伤的时间进程。用表达TERT的慢病毒或载体对照感染迟通过HGPS成纤维细胞并选择2周。选择后立即通过追踪PD与时间来测量寿命。使用G1门控细胞对γH2AX进行流式细胞术分析，测量DNA损伤信号。在第7、17、25和39天检测γH2AX阳性。误差条表示代表性实验的标准偏差，一式三份。

为了进一步研究TERT对HGPS DNA损伤信号的影响，我们在人类NDF中体外表达了前体蛋白。在这些细胞中，外源性前体蛋白的表达水平与HGPS成纤维细胞中内源性前体素的表达水平相似(图2D). 而NDF中异位前体蛋白的表达诱导了DNA损伤信号(图2E、F)，progrein在先前感染TERT的NDF中未能做到这一点(图2E、F;图3D). 因此，TERT表达对前体蛋白诱导的DNA损伤信号具有保护作用。

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图3。

TERT对前体蛋白诱导的生长缺陷和DNA损伤表型的补救作用取决于其在端粒的功能。(一个,B类)TERTs催化和DNA结合功能是拯救HGPS早衰和DNA损伤表型所必需的。（A） 比较表达野生型TERT、DNA-结合缺陷型TERT（N125A+T126A TERT）、催化活性TERT（D868A-TERT）或载体控制的晚期HGPS成纤维细胞的增殖能力。在感染和选择后28天测定每个培养物的累积PD。误差条表示三个独立实验的s.e.m。（B） 在感染和选择后2周，对表达指定TERT结构的G1-门控HGPS成纤维细胞进行γH2AX流式细胞术分析。误差条表示重复进行的代表性实验的范围。(C类)Western blot显示HGPS成纤维细胞中异位野生型和突变TERT结构的蛋白水平相似。β-actin作为负荷对照。(D类)TERT对阿霉素（DOX）治疗的影响。转导有或无异位TERT表达的NDFs（IMR90），并用前体蛋白或载体控制选择标记物。载体对照成纤维细胞未经治疗或用500 nM DOX治疗1小时。流式细胞术检测γH2AX阳性。误差条表示重复进行的代表性实验的范围。

TERT对前体蛋白诱导的生长缺陷和DNA损伤表型的补救作用取决于其在端粒的功能

越来越多的证据表明，TERT具有独立于端粒维持所需催化功能的活性(Choi等人，2008年;Cong和Shay，2008年;De Semir等人，2007年;Lee等人，2008年;Park等人，2009年;Smith等人，2003年;Zhou等人，2009年). 例如，野生型和催化失活突变体TERT都被招募到生长控制基因的启动子中，并起着不可区分的调节基因表达和促进细胞增殖的作用(Park等人，2009年;Zhou等人，2009年). 因此，我们比较了野生型TERT的能力以及催化活性不高的TERT突变体D868A TERT或端粒结合缺陷突变体N125A+T126A TERT，该突变体具有催化活性但不能延长端粒(Goldkorn和Blackburn，2006年)延长寿命，减少DNA损伤。尽管所有TERT结构都在相似的水平上表达(图3C)，只有野生型TERT延长了HGPS成纤维细胞的增殖寿命(图3A). 同样，只有野生型TERT降低HGPS成纤维细胞中DNA损伤信号的水平(图3B). 这些结果表明，改善HGPS成纤维细胞的DNA损伤信号和过早衰老需要TERT的催化和DNA结合功能来维持端粒。

为了进一步确定端粒酶在改善前体蛋白诱导的DNA损伤信号方面的特异性，我们研究了外源性端粒酶对多柔比星（DOX）引起的DNA损伤的影响，DOX通过抑制拓扑异构酶II诱导DNA双链断裂(Tewey等人，1984年). 在TERT有效阻断前体蛋白诱导的DNA损伤信号的相同条件下，DOX治疗可在有或无异位TERT表达的NDF中诱导同等水平的DNA损伤(图3D). 这些发现进一步支持了以下结论：TERT改善前体蛋白诱导的DNA损伤信号和过早衰老的能力与其端粒功能有关。

孕激素诱导的DNA损伤信号定位于端粒

接下来，我们试图确定前体蛋白表达诱导的DNA损伤信号是否定位于端粒。为此，我们检测了表达进展蛋白的成纤维细胞是否存在端粒功能异常诱导的病灶（TIFs），如γH2AX和TRF1的共同定位所定义的，TRF1是端粒标记物(Takai等人，2003年). TRF2是一种端粒DNA结合蛋白，对正常端粒保护至关重要，也是TRF2（TRF2）的主要阴性形式^ΔBΔM)之前已经证明可以诱导TIF的形成(Takai等人，2003年). 前体蛋白的异位表达诱导NDF中TIFs的形成，与TRF2观察到的方式类似^ΔBΔM(图4A、B). 相比之下，检测到的γH2AX病灶对DOX诱导的DNA损伤反应没有显示端粒特异性的证据(图4A、B). 此外，进展诱导的TIFs偶尔涉及γH2AX与几个重叠的TRF1病灶（端粒聚集体）的共定位，这在任何分析的对照细胞中都没有观察到(图4C). 这些发现进一步表明端粒是前体诱导的DNA损伤信号的特定靶点。

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图4。

孕激素诱导的DNA损伤信号定位于端粒。(一个)用前体蛋白TRF2感染NDF后5天，通过共焦免疫荧光显微镜对γH2AX（绿色）和TRF1（端粒标记物）（红色）病灶进行端粒功能障碍诱导灶（TIFs）检测^ΔBΔM阳性对照或未经治疗或用500 nM DOX治疗1小时的病媒对照。合并后的图像叠加在DAPI（蓝色）染色上，显示DNA与γH2AX和TRF1共定位为黄色。白色方框表示放大10倍的区域，显示在右侧，没有DAPI。比例尺：10μm。(B类)通过γH2AX和TRF1的共定位来确定A.TIFs细胞中TIFs的定量。显示了含有0-1、2-5、6-10或>10 TIF的DNA损伤细胞的百分比。对于每种情况，计算100个细胞。(C类)进展表达细胞中TIF的其他合并图像，每个都显示端粒聚集。检测到的TIF与A中相同。白色方框表示放大10倍的区域。比例尺：10μm。

为了进一步证明前体蛋白引起的DNA损伤信号定位于端粒，我们进行了端粒染色质免疫沉淀（ChIP）。与对照组相比，progrein诱导与端粒重复序列相关的γH2AX数量增加了4.2倍，而在相同条件下，γH2AX与内部Alu序列的关联仅增加了1.2倍(图5). 作为端粒特异性DNA损伤的阳性对照，TRF2^ΔBΔM诱导与端粒重复相关的γH2AX增加6.2倍，而与Alu序列相关的γH2AX仅增加1.4倍(图5). 我们对端粒DNA损伤信号的共焦成像和ChIP数据显示γH2AX增加与端粒序列相关，提供了强有力的证据表明前体蛋白参与端粒功能障碍的诱导。

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图5。

端粒染色质免疫沉淀显示，前体蛋白诱导的DNA损伤信号在端粒特异性富集。(一个)感染NDF（IMR90），并用前体蛋白TRF2选择标记7天^ΔBΔM或矢量控制病毒。免疫沉淀使用γH2AX或IgG阴性对照的特异性抗体。使用狭缝印迹将DNA加载到尼龙膜上，并用DIG标记的端粒探针进行探测，用DIG-标记的Alu探针进行剥离和再验证。输入DNA占总DNA的0.1%。显示了曝光和曝光。(B类)A中所示暗暴露的量化。信号密度由ImageJ测量，直方图值表示归一化为输入信号的γH2AX端粒或Alu ChIP信号，并减去IgG对照中的背景信号。将载体控制序列标准化为1后，每个ChIP中的DNA量以任意单位（a.u.）表示。

TRF2导致TIF形成^ΔBΔM是TRF2从端粒DNA中分离的结果，导致3′端悬垂和DNA损伤信号的丢失(Takai等人，2003年). 我们使用ChIP分析比较前体蛋白和TRF2的作用^ΔBΔMTRF2与端粒DNA的关联。如预期，TRF2^ΔBΔM表达显著降低了TRF2与端粒的结合，而对端粒稳定性的另一个主要调节因子TRF1的结合影响最小(Smogorzewska等人，2000年) (图6A、B). 相反，在两个独立的实验中，孕激素的表达与TRF1和TRF2与端粒DNA结合的增加有关(图6A-D). TRF1和TRF2与端粒DNA的结合是特异性的，因为在Alu序列中未检测到结合(图6C). 因此，与TRF2引起的端粒功能障碍不同^ΔBΔM，进展诱导的TIF并不是由TRF2与端粒结合的显著缺失引起的。

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图6。

前体蛋白对端粒结合蛋白与端粒DNA关联的影响。(一个)NDF（IMR90）感染了表达前体蛋白TRF2的病毒^ΔBΔM或选择7天的病媒控制和标记。对于ChiP分析，在交联和DNA剪切后，使用针对TRF1、TRF2或IgG阴性对照物的抗体进行免疫沉淀。使用狭缝印迹将DNA加载到尼龙膜上，并与DIG标记的端粒探针杂交。输入DNA占总DNA的1%。(B类)A中显示的印迹定量。通过ImageJ测量信号密度，直方图值表示TRF1和TRF2端粒ChIP信号归一化为输入信号。将载体控制序列标准化为1后，每个ChIP中的端粒DNA量以任意单位（a.u.）表示。(C类)NDF（IMR90）感染表达前体蛋白或载体控制和标记的慢病毒5天。对于ChiP分析，在交联和DNA剪切后，使用针对TRF1、TRF2或IgG阴性对照的抗体进行免疫沉淀。使用槽印迹将DNA加载到尼龙膜上，并与DIG标记的端粒探针杂交，剥离并与DIG-标记的Alu探针重杂交。输入DNA占总DNA的1%。(D类)按B所述对C中的斑点进行定量。

表达结构、病毒产生和感染

通过RT-PCR扩增，从AG01972 HGPS细胞株的总RNA中获得全长cDNA编码前体低分子量核酸（有义，包括GCCACC-Kozak序列，5′-GCCCACCATGGAGCCCCGTCCCAGC-3′；和反义，5′-GGCCCAGATTACATGATGCTGC-3′）。孕激素在含有嘌呤霉素选择标记的NSPI衍生慢病毒载体中表达(Akiri等人，2009年). 野生型TERT、显性阴性p53（R248W）和野生型CDK4分别在含有嘌呤霉素、潮霉素和新霉素选择标记的pBabe衍生逆转录病毒载体中表达(Mahale等人，2008年). pBABE逆转录病毒主干中的TERT突变体N125A+T126A和D868A(Kim等人，2003年)与野生型TERT一起亚克隆并在NSPI衍生的慢病毒载体主干中表达，该慢病毒载体具有杀鼠素选择标记。2号机房^ΔBΔM在pLPC逆转录病毒载体中表达，带有嘌呤霉素选择标记（Addgene质粒18008）(Karlseder等人，2002年). 为了建立逆转录病毒载体，HEK293T细胞与适当的逆转录病毒表达载体和pCL-ampho包装质粒共同转染。为了建立慢病毒载体，HEK293T细胞与适当的慢病毒表达载体pCMVΔR8.74包装载体和pMD2-VSVG包膜载体共同转染。在同一个检测细胞HT1080中进行标记选择后，通过菌落形成来确定每个病毒株的滴度，从而可以在不同的实验中使用相同数量的病毒来比较结果。在8μg/ml聚布伦（Sigma）存在的情况下，对成纤维细胞的大量群体进行逆转录病毒和慢病毒感染。随后选择细胞进行抗生素耐药性检测（2μg/ml嘌呤霉素、100μg/ml潮霉素、750μg/ml新霉素和5μg/ml急变霉素），并将其扩大为群体。在所有情况下，都使用了类似的MOI。

抗体

使用了针对以下蛋白质的抗体：Lamin A/C（Millipore，MAB3211）、p53（1801，西奈山医学院杂交瘤中心）、p21（BD Biosciences，556431）、p16（Santa Cruz，sc-468）、Rb（Cell Signaling，9309）、Ser139γH2AX（Milliporte，05-636）、Ser133γH2AX（Millipose，07-164）、Ser-1981磷酸化-ATM（Rockland，600-401-400）、，TERT（abcam，ab32020），TRF1（#370）（来自纽约洛克菲勒大学Titia de Lange的礼物），TRF1-（圣克鲁斯，sc-6165），TRF2（Imgenex，IMG-124A），β-肌动蛋白（Sigma，A5441）和IgG（密理博，12-371）。

流式细胞术

根据制造商的说明，使用CycleTEST Plus DNA试剂盒（Beckton Dickinson）进行细胞周期分析。根据制造商的说明，使用γH2AX流式细胞术磷酸化试剂盒（Millipore，17-344）检测细胞γH2AX。为了结合细胞周期分析和γH2AX染色，将已染色的γH2AX细胞与10μg/ml碘化丙啶（Trevigen，4830-250-3）和10μg/mlRNase A（Invitrogen，12091-021）在37℃孵育10分钟。通过FACS（FACSCalibur，Beckton Dickinson）对至少10000个染色细胞进行分类，并使用Cell Quest 3.2软件（Beckton狄金森）进行分析。

衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色

细胞在PBS中清洗，并在室温下用2%甲醛和0.2%戊二醛在PBS内固定5分钟，然后按照前面所述进行染色(Dimri等人，1995年).

免疫印迹法

通过在裂解缓冲液中溶解细胞获得全细胞提取物（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，1%Triton X-100，补充以下蛋白酶和磷酸酶抑制剂：5 mM EDTA，50 mM氟化钠，25 mMβ-甘油磷酸，1 mM原钒酸钠，0.5 mM苯甲基磺酰氟和10μg/ml抑肽酶）或SDS-溶解缓冲液[50 mM Tris-HCl，pH 8.1，1%SDS，10 mM EDTA，补充完整的微型蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏，11836153001）]。将蛋白质样品（50μg）进行SDS-PAGE，转移到Immobilon-P或Immobilon-FL过滤器（Millipore）上，并用指示的抗体进行探测。使用ECL系统（GE Healthcare）和辣根过氧化物酶结合二级抗体（GE Hearthcare，GE Healthcare）进行检测，或使用奥德赛红外成像系统（LI-COR Biosciences，LI-COR bioscience）和IR-dye标记二级抗体进行检测。

共焦显微镜

将在玻璃盖玻片上电镀并生长至少48小时的细胞用PBS清洗两次，然后用甲醇在−20°C下固定20分钟。然后用PBS-T（含0.1%吐温20的PBS）清洗细胞两次，在PBS-BSA-T（含1%BSA和0.1%吐温20的PBS-）中封闭1小时，并在4°C下用一级抗体孵育过夜。然后用PBS-BSA-T清洗样品三次，并用二级抗体孵育1小时。使用抗Abbit Cy3（Jackson ImmunoResearch，711-165-152）或抗鼠Alexa Fluor 488（Molecular Probes，A11029）二级抗体。在一些实验中，在固定之前，添加500 nM的阿霉素（DOX）（Sigma，D1515）1小时。使用带有DAPI（Vector Laboratories，H-1200）的Vectashield安装介质安装盖玻片。使用蔡司LSM 510 META共焦显微镜（卡尔蔡司显微成像），使用63×油物镜进行共焦成像。在Adobe Photoshop中对图像进行裁剪和组合。DNA损伤量通过对含有0、1、2-5或>5γH2AX和ATM的细胞百分比进行评分来量化-P（P）共定位病灶。每个变量至少有300个细胞被评分。对于TIF分析，细胞被评分为具有0-1、2-5、5-10或>10个TRF1病灶，与γH2AX染色共定位。每个变量至少有100个细胞被评分。

端粒染色质免疫沉淀（ChIP）

根据制造商的说明，使用EZ-ChIP分析试剂盒（Millipore，17-371）进行ChIP分析。使用Sonicator 3000（Misonix）在以下条件下进行超声检测：Amp=5.5，6个周期为20秒开启和20秒关闭。使用Ser139γH2AX（Millipore，07-164）或IgG（Millibore，12-371）抗体进行免疫沉淀，并将免疫沉淀DNA转移到Hybond-N（GE Healthcare，RPN2020N）使用slot-blot设备的膜。然后将膜与DIG标记的端粒（TTAGGG）杂交₄探针，并用TeloTAGGG端粒长度测定试剂盒（Roche 12209136001）检测。然后用0.2 M NaOH和0.1%SDS在52°C下洗涤两次，将膜剥离30分钟，并用DIG-标记的Alu（GGAGGCTGAGGCAGGAGAATTGCT）探针重新混合。使用DIG寡核苷酸3′末端标记试剂盒（Roche，03353575910）进行DIG标记。用ImageJ软件（NIH）对信号进行量化。ChIP后端粒和Alu DNA的量被标准化为每种条件的总输入信号。

这项工作得到了拨款编号的支持PO1CA80058型来自NCI和纽约州干细胞合同#C024313。E.B.得到了NCI癌症生物学培训计划的支持(T32 CA078207号)以及NIGMS细胞和分子生物学培训计划(T32 GM008553号). 共聚焦激光扫描显微镜在MSSM-Micropy共享资源设施进行，由NIH-NCI共享资源拨款资助(5R24 CA095823-04号)NSF重大研究仪器拨款(DBI-9724504数据库)和NIH共享仪器拨款(1 S10 RR0 9145-01). 我们感谢Elizabeth Blackburn（加州大学旧金山分校）在pBABE puro主链中为我们提供了TERT突变构建体N125A+T126A和D868A。我们感谢Titia de Lange（洛克菲勒大学）提供的TRF1（#370）抗体和TRF2^ΔBΔM通过Addgene获得的构造。我们还感谢赵波和塞萨尔·穆诺兹·丰特拉的有益讨论。存放在PMC中，12个月后发布。