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公共科学图书馆一号。2010; 5（6）：e1137。
2010年6月29日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pone.0011373
预防性维修识别码：项目经理2894062
PMID：20617191

从人外周血T淋巴细胞衍生诱导的多能干细胞

马修·布朗, 伊丽莎白·朗登, 迪皮卡·拉杰什, 阿曼达·马克, 雷切尔·刘易斯, 冯雪珠, 劳拉·乔·齐特, 兰德尔·D·利里什,和Emile F.Nuwaysir先生*
德里亚·乌努特马兹，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

诱导多能干细胞（iPSCs）在个性化发展方面具有巨大潜力在体外疾病模型、基因组健康分析和自体细胞治疗。在这里，我们描述了T淋巴细胞衍生的多能干细胞的产生，这些细胞来源于临床上具有优势的小容量非动员外周血。这些T细胞衍生的多能干细胞（“TiPS”）对供体保留了正常的核型和遗传特性。它们与人类胚胎干细胞（hESCs）在形态、多潜能相关标记表达和生成神经元、心肌细胞和造血祖细胞的能力方面具有共同的特征。此外，它们保留了其特有的T细胞受体（TCR）基因重排，这一特性可用于iPSC克隆追踪和T细胞发育研究。以微创方式获得的重新编程T细胞可用于描述和扩展供体特异性iPSC，并控制其分化为特定谱系。

介绍

体外通过病毒转染特定因子（如SOX2、OCT4、NANOG和林28或SOX2、OCT4、c-Myc、和KLF4型 [1],[2]为使用多种细胞类型生成特定于患者的人类iPSC开辟了道路[3],[4]通过基因的瞬时表达或使用适当转录因子的蛋白质转导来衍生iPSCs，进一步推进了这一前提[5],[6]到目前为止，人类iPSC的大多数研究都集中在作为细胞来源的成纤维细胞上。虽然成纤维细胞作为起始材料具有一定的优势，因为它们的商业可用性和基因传递的便利性，但由于需要进行侵入性皮肤活检和难以从原组织建立稳定的细胞系，它们对于大规模临床衍生iPSC系次优。由于易于获得患者样本，非流动外周血可能是重新编程的理想细胞来源[7]此外，来自活体和已故献血者的大量冷冻血液样本储存在世界各地的生物储存库中[8].

研究人员最近报告成功地对原发性CD34进行了重新编程+动员和非动员献血者的造血祖细胞[3],[9]这些发现代表了iPSC研究的一个重要进展，然而，未动员的成人外周血含有大约100–1000 CD34+细胞/ml[10],[11]使这些罕见的祖细胞成为从小血容量获得iPSC系的具有挑战性的细胞来源。作为另一种更丰富、更易处理的血细胞来源，我们报道了从相当于1毫升全血的T淋巴细胞中衍生iPSCs。这些T细胞衍生的iPSC（“TiPS”）与人胚胎干细胞以及成纤维细胞衍生的多能干细胞系具有共同的基本特征。此外，它们保留了其特有的T细胞受体（TCR）基因重排，这一特性可以被利用，例如，作为遗传追踪标记或在再分化实验中研究人类T细胞发育。

结果和讨论

由于T细胞在全血中含量丰富（～6.5×10），因此它非常适合作为重编程的起始材料5–3.1×106/ml（健康成年人）[12]以及易于使用既定协议的文化[13],[14]为了促进T细胞增殖和有效的逆转录病毒转导，从白细胞分离或标准静脉穿刺（Vacutainer©CPT管）中分离外周血单个核细胞（PBMCs），并在无血清培养基中培养IL-2和抗CD3抗体(图1). 这导致成熟CD3+T细胞优先扩增，其中包括平均第3天的CD3+纯度为90%+/-7%(图2A).

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T细胞重编程过程概述，从激活的T细胞开始，产生具有hESC样形态的iPSC集落。

在Olympus IX71显微镜上分别获得10×和20×物镜下的T细胞和iPSC集落图像。

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人T细胞诱导多能干细胞的衍生和特性。

（A） 流式细胞术分析输入细胞源CD3的表面表达。（i） 来自代表性供体的PBMC群体的第-3天未活化的PBMC和第0天活化的T细胞的CD3表面表达。（ii）转导（GFP）的CD3表达门控+)在典型供体中转导72小时后的细胞群，以证明CD3的优先转导+细胞。（iii）上述指标（i-ii）在平均10个供体Vacutainer衍生样品中的直方图表示。（B） 流式细胞术分析代表性白细胞减少症（“TiPS L-2”）和Vacutainer（“TiPS-V-1”）衍生的TiPS系中的hESC多能性标记物OCT4、Tra-1-81、SSEA-3和SSEA-4。（C） 使用多重PCR引物对TCRβ基因座V-J区域内的保守区域进行T细胞受体（TCR）β链重排分析。多克隆起始T细胞群体由电泳图上有效片段大小范围内的扩增子峰的钟形曲线表示。成纤维细胞（非T细胞）iPS细胞（“Fib-iPS”）在TCRβ位点缺乏种系重排，并作为阴性对照。克隆衍生的TiPS株系（分别来自两个白细胞分离株系和一个Vacutainer株系的代表性数据，分别为“TiPS L-1”、“TiPS L-2”和“TiPS V-2”）显示出一个明确大小的明显峰值。DNA片段分析在ABI 3730 DNA分析仪上进行。

含有1×10的活化T细胞富集群体6细胞接受两轮（第0天和第1天）逆转录病毒转导，转导中有四个单独的载体，每个载体编码一个重编程因子(SOX2标准,华侨城4号,c-Myc公司，或KLF4型)与荧光标记基因相关。在第3天通过荧光显微镜和流式细胞术评估转导效率。CD3染色显示转导群体为99%+/-1%CD3+(图2A).

将含有转导T细胞的细胞群放置在补充有100 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的hESC培养基中辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）上。从第23天开始观察iPSC菌落。通过将具有hESC样形态的菌落数除以输入的转导细胞数来评估T细胞的重新编程效率，并确定其约为0.01%，与已发表的成纤维细胞和CD34相似+电池效率[1],[3].

TiPS是从白细胞分离样本（来自一名拉美裔男性成年人，线条表示为“TiPS-L”）和全血Vacutainer样本（来自于一名白人男性成人，线条表示“TiPS-V”）中生成的。在每种情况下，都使用与1 ml全血中T细胞数量相等的输入细胞数来实现重新编程。显示人胚胎干细胞形态的克隆在MEF上进行扩增，并使用mTeSR培养基和Matrigel涂布板在无饲料条件下成功维持克隆。

我们进行了DNA指纹分析，以验证TiPS与初始供体T细胞群体具有相同的遗传背景，并排除细胞系交叉污染(图S1). 用流式细胞术通过hESC多能性标记物SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-81和OCT4的表达来验证多能性(图2B)和碱性磷酸酶染色(图S2). 我们通过TCRβ链重排的多重PCR检测证实了TiPS系的T细胞起源(图2C).

进行RT-PCR以确认hESC遗传标记的表达DNMT38型,左图8,诺达尔,REX1型,ESG1系列,TERT（地形）,GDF3型、和UTF1标准(图3A). 进一步的鉴定表明转基因整合到宿主基因组中，并在成功重新编程后沉默(图3B、C). 在所有上述分析中，TiPS与hESC株H1和成纤维细胞衍生iPSC株对照相似。此外，经过多次传代后，这些品系的核型正常，并在培养基中繁殖了30多代，同时保持了正常的核型(图S3).

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人T细胞诱导多能干细胞的特性。

（A） 代表性白细胞增多症（TiPS L-1和TiPS L-2）和Vacutainer（TiPS V-2）衍生的TiPS细胞系hES细胞标记基因表达的RT-PCR分析DNMT38型,左图B,诺达尔,REX1型,ESG1系列,TERT（地形）,GDF3型、和UTF1标准GAPDH被用作每个样品的正负荷对照。（B） 基因组DNA的PCR分析证实了转基因的整合。对感兴趣的重编程基因（“RG”）使用正向引物，对IRES使用反向引物。华侨城4号如载体图所示，使用正向和反向引物作为PCR反应阳性对照。（C） TiPS细胞系的RT-PCR分析显示外源转基因沉默，GAPDH作为每个样本的阳性对照。在（A）和（C）hESC细胞系H1和（A-C）中，成纤维细胞衍生的iPSC细胞系（“Fib-iPS”）作为阳性细胞对照，激活的供体T细胞作为阴性细胞对照。在（A-C）图像中，使用Photoshop软件进行修改，以合并凝胶，并从单独的实验中删除多余的控制数据。

最后，对TiPS细胞系进行评估，以确定其体内和在体外分化潜能。所有TiPS克隆均形成畸胎瘤。畸胎瘤的组织与所有三个原始胚层的来源一致(图4A). 还评估了细胞系的分化能力在体外在各种定向分化方案中分为外胚层和中胚层谱系。这些克隆能够产生神经元，击败心肌肌钙蛋白T阳性心肌细胞和多能干粒细胞-红细胞-巨噬细胞巨核细胞（GEMM）造血细胞(图4B、C、D、E).

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体内和在体外TiPS细胞系的分化潜能。

（A） 畸胎瘤形成显示体内分化潜能。注射到SCID/米色小鼠体内的TiPS细胞在5至12周时形成畸胎瘤。苏木精和伊红染色显示组织与三个原胚层的来源一致，包括带有杯状细胞的简单上皮，指示胃肠或呼吸组织（内胚层）、软骨（中胚层）和视网膜色素上皮（外胚层）。使用Olympus IX71显微镜和40倍物镜获取TiPS L-2细胞系的代表性图像。（B）体外分化为神经元。将TiPS L-2细胞诱导为神经元分化聚集物，然后用Alexa Fluor 594二级抗体对神经元标记物β-Ⅲ-管蛋白进行染色；细胞核用Hoechst染色进行复染。使用20倍物镜采集图像。使用Image J软件调整对比度并合并图像。（C） 通过细胞聚集法对TiPS细胞进行心脏诱导。细胞聚集物包含14至15天跳动的心肌肌钙蛋白T（cTNT）阳性心肌细胞。显示了代表性样品的流量数据。使用10倍物镜采集图像。（D） 体外分化为造血祖细胞。与人胚胎干细胞系（“H1”）和成纤维细胞衍生iPSC系（“Fib-iPS”）相比，通过无血清类胚体（EB）分化方案在两个TiPS系中生成12天的造血祖细胞（HPC）。通过将EB分离成单个细胞并用CD34、CD45、CD43、CD31、CD41和CD235a的荧光染色单克隆抗体染色，流式细胞术对HPC进行定量。（E） 通过将EB分化和个体化细胞放入含有细胞因子（SCF、G-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-6和EPO）的无血清MethoCult培养基中，进行造血克隆形成（CFU）检测。培养14天后，根据形态学标准对集落进行评分，包括红系（CFU-E/BFU-E）、髓系组成巨噬细胞（CFU-M）、粒细胞（CFU-G）和粒细胞巨噬细胞（CFU-GM），以及多系组成粒细胞-红系-巨噬细胞巨核细胞（CFU GEMM）集落。使用2倍物镜的Olympus CKX41显微镜对CFU总量进行量化并获得代表性图像。

T细胞衍生iPSC的一个潜在问题是，iPSC基因组中TCR基因重排的持续存在及其对随后分化的潜在影响。虽然我们没有观察到TiPS克隆与人胚胎干细胞系或成纤维细胞衍生iPSC系之间的分化潜能有任何显著差异(图4D，E这些基因组重排对淋巴分化的影响尚待研究。事实上，TCR重排在某些情况下可能被证明是有利的，例如在衍生性畸胎瘤中检测到母系克隆TCRβ链重排可以证明iPSC克隆追踪(图5). 此外，根据重新-分化为T细胞TiPS细胞可能会绕过胸腺发育序列中的关键步骤，这是由于其前重排TCR基因的表达导致TCR等位基因排斥的机制所致。这种现象可以在T细胞发育研究中探索。

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iPSC克隆跟踪。

从畸胎瘤样本中分离出基因组DNA，并将其与亲本细胞系进行TCRβ链重排比较。代表性数据来自细胞系TiPS V-1。衍生性畸胎瘤包含母细胞系的克隆性重排。使用针对TCRβ基因座V-J区保守区域的多重引物进行PCR分析。DNA片段分析在ABI 3730 DNA分析仪上进行。背景≤1000 RFU。

应该注意的是，当使用逆转录病毒重编程方案时，插入突变和其他潜在的细胞功能破坏是可能的[15]最近使用上位体重编程方法的进展可能会解决这些问题，并且正在努力通过这些替代方法对T细胞进行重编程[5],[6]此外，这种经会阴重组的TiPS细胞的潜在治疗用途的一个有趣的例子是作为一种来源来区分携带肿瘤相关抗原特异性内源性TCR基因的无整合造血干细胞[16].

先前关于在小鼠中重新编程终末分化的B淋巴细胞的报道需要添加或敲除细胞身份相关的转录因子，并使用多西环素诱导的表达系统[17]最近，发表了一篇关于小鼠T细胞重编程的描述，需要第53页基因敲除成功产生iPSC[18].涉及控制抗增殖途径的实验[19],[20],[21],[22]提供对重编程机制的见解，并可能显著提高重编程效率。然而，上述操作似乎都不是人类T细胞病毒成功重编程的必要条件。此外，我们的数据，以及用于重新编程成人CD34+造血祖细胞的方法[3],[9]，现在提供一个初级的人类系统来检查最近在小鼠系统中观察到的输入细胞分化阶段与重编程效率之间的关系[23].

我们描述了iPSCs来源于少量临床上有利的非动员人体外周血。T细胞是一种丰富的重编程细胞来源，可以以微创的方式从大量供体中获取，并通过成熟的培养方案进行培养。在我们详细介绍的实验中，TiPS与人胚胎干细胞系和成纤维细胞衍生的iPSC系具有相似的特征和分化潜力。此外，TiPS提供了一种新的模型，用于探索iPSC克隆追踪、T细胞开发和iPSC技术的治疗应用。

材料和方法

细胞生长培养基和碱性成纤维细胞生长因子

iPSC线路使用之前描述的方法进行维护[1]如前所述，斑马鱼bFGF在所有实验中均替代人类bFGF[24].

成纤维细胞iPSC系

对照成纤维细胞衍生iPSC系，称为“Fib-iPS”，如前所述，使用从ATCC（弗吉尼亚州马纳萨斯）获得的IMR90细胞生产[1].

T细胞激活和膨胀

外周血单个核细胞（PBMC）取自HLA-A2阳性的成年西班牙男性供体（“供体L”）白细胞包（Biological Specialty Corp，Colmar，PA），经淋巴细胞分离培养基（Cellgro，Manassas，VA）处理。此外，通过Vacutainer©CPT™试管（BD Biosciences，San Jose，CA）中的标准静脉穿刺，从血清型未知的男性白人供体（“供体V”）采集全血样本，并根据制造商的建议通过离心法采集PBMC。根据赫尔辛基宣言和生物专业公司（美国宾夕法尼亚州科尔马）的机构审查委员会批准，在获得书面知情同意的情况下获取血样。T细胞在新制备的AIM-V培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）中扩增，该培养基补充有pen/strep/gluminate（Invit罗gen）加300 IU/ml rhIL2（Peprotech，Rocky Hill，NJ）和10 ng/ml可溶性抗CD3抗体（eBioscience，OKT3 clone，San Diego，CA）[25],[26]在培养3天后，通过CEDEX（德国比勒费尔德罗氏创新公司）细胞计数验证增殖情况，在培养点对细胞进行T细胞表型分析，然后用重编程因子转导。

生产逆转录病毒的瞬时转染

逆转录病毒是通过将293T细胞转染在一个10 cm的平板中，在70-80%的汇合处，将10 ug逆转录病毒载体（Moloney Murine Leukemia Virus）主干与编码4个重编程基因和一个荧光标记基因（GFP或RFP）的每个基因、3 ug Gag-Pol、1 ug编码NFkB衍生物的质粒、，和1 ug水泡性口炎病毒G蛋白，使用聚乙烯亚胺（“PEI”）亲脂试剂（40 ug/10 cm平板）。4小时后，用5 ml DMEM（Invitrogen）加10%FBS（Hyclone，Waltham，MA）和50 mM HEPES（Invit罗gen）交换培养基。在转染后48小时收集病毒上清液，并通过0.8 um孔径的过滤器。

通过转染进行逆转录病毒转导

通过在四种逆转录病毒上清液加上4 ug/ml聚brene（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）和300 IU/ml rhIL-2的混合物中，在32°C下离心1.5 h×1000 g，每个孔“转染”100万个活化供体细胞。在螺旋感染后，培养皿接受半培养基交换，并培养过夜。第二天，通过离心法收集细胞，并进行第二次转染。

T细胞扩增和转导效率的验证

活化3天后，用抗CD3抗体（BD，克隆HIT3a）流式细胞术表面染色以及转导后验证T细胞的身份，以验证哪个细胞群成功转导。样本在Accuri（密歇根州安阿伯）流式细胞仪上运行。在第0天、第3天和第4天进行CEDEX细胞计数，以确认扩张情况以及MMLV逆转录病毒感染的耐受性（数据未显示）。

在MEF上电镀转导的T细胞

初始转导72小时后，通过荧光显微镜和流式细胞术验证转导成功率和效率评估，如上所示。5×105将转导的细胞在没有zbFGF（或额外的细胞因子）的50/50培养基组合D10F:hESC中1至3天前加入接种有MEFs的10cm板中。培养细胞并每隔一天用一半的培养基交换hESC培养基+100 ng/ml zbFGF（第一周）或MEF条件培养基+100ng/ml zbFGF。为了避免喂食过程中细胞丢失，将培养板稍微倾斜10分钟，以使细胞沉降，并从培养基水平面缓慢取出培养基。

iPSC菌落鉴定和挑选

第23天左右开始出现边界明确、具有典型人类胚胎干细胞形态的菌落。GFP和RFP沉默通过荧光显微镜进行验证，并计算菌落数，以估计输入平板细胞数的重编程效率。人工采集菌落，转移到MEF，并根据既定方案进行扩展[7],[27]通过将假定的iPSC菌落总数除以输入的转导细胞数，可以估计重编程效率。菌落收获后（第25-30天）停止计数，以避免包含收获后留下的假阳性再培养菌落。

DNA指纹

TiPS细胞系和供体PBMC被送往威斯康星大学组织相容性/分子诊断实验室（威斯康星州麦迪逊）进行短串联重复序列（STR）分析。从TiPS细胞样本DNA中确定了8个STR基因座的基因型。

核型分析

G带分析由WiCell研究所（威斯康星州麦迪逊）进行。

T细胞受体β链重排分析

根据制造商的方案（使用Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒）从供者T细胞、TiPS细胞系和作为阴性对照的成纤维细胞（非T细胞）衍生iPSC系中分离基因组DNA。此外，通过首先将组织和细胞样品溶解在含有Tris、NaCl、EDTA、SDS和蛋白酶K（Invitrogen）的缓冲液中，从冷冻畸胎瘤样品和亲本细胞系中分离出DNA。然后用饱和氯化钠和乙醇沉淀DNA，并将其重新悬浮在水中进行PCR分析。PCR使用多重引物试剂盒（Invivoscribe Technologies，San Diego，CA）进行，该试剂盒针对大多数克隆TCRβ链重排[28]在威斯康星大学生物技术中心DNA测序核心设施（威斯康星州麦迪逊）使用ABI 3730 DNA分析仪进行毛细管电泳和PCR产物片段分析。使用Peak Scanner软件（加利福尼亚州福斯特市ABI）对数据进行分析。

碱性磷酸酶（AP）染色

根据制造商的协议，用矢量蓝碱性磷酸酶底物试剂盒III（矢量实验室，SK-5300，加利福尼亚州伯灵盖姆）对MEF上生长的汇合细胞进行AP染色。

转基因和人胚胎干细胞标记基因表达的RT-PCR研究

根据制造商的方案，使用RNeasy Mini Kit（马里兰州日耳曼镇齐根）分离总RNA。用寡核苷酸-dT引物进行第一链cDNA合成（如前所述[1],[2])根据产品协议使用SuperScript III第一股合成套件（Invitrogen）。cDNA以1:2稀释，并使用Mastercyler（Eppendorf，Hauppauge，NY）用GoTaq Green Master Mix（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）进行PCR反应。

病毒整合的PCR分析

基因组DNA从1–5×106根据制造商的培养细胞协议，使用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen）的iPSC。基因组DNA（5 ul）用于PCR反应，以使用GoTaq Green Master Mix（Promega）检查病毒整合。使用了只检测转基因而不检测内源性基因的特定引物集。内源性引物华侨城4号作为反应的阳性对照。如前所述，用引物进行反应[1],[2].

流式细胞术：iPSC细胞内和表面多潜能标记特征

采集保存在Matrigel上的TiPS，并对其进行染色，以确定是否存在Tra-1-81（BD Pharmingen或Stemgent，加利福尼亚州圣地亚哥，均为克隆Tra-1-81）、SSEA-3（BD-Pharmingen，克隆MC631）和SSEA-4（BD-Parmingen、克隆MC813-70）。在用2%多聚甲醛固定并用PBS+0.1%皂苷渗透的细胞上进行细胞内OCT4（BD，克隆40/Oct-3）染色。将细胞染色过夜，第二天在Accuri流式细胞仪上进行分析。

造血分化和集落形成单位分析

未分化TiPS在Matrigel涂层板上适应无饲料条件，并使用mTeSR培养基进行维护（加拿大温哥华干细胞技术公司）。使用TrypLE（Invitrogen）采集菌落，并将其置于低附着板中的无血清类胚体（EB）基础培养基[含有IMDM、NEAA、谷氨酰胺（Invit罗gen）和20%BIT-9500（干细胞技术）和ROCK抑制剂H1152]中，以促进聚集形成。聚集形成后，将细胞置于补充有生长因子和细胞因子的EB基础培养基中：rhBMP-4（明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems）、rhVEGF、zbFGF、rhFlt-3配体、rhIL-3和rhGM-CSF（Invitrogen），为期12天。收集细胞，通过流式细胞仪对CD31、CD34、CD43、CD45、CD41和CD235a进行表面染色，评估每个iPSC克隆产生的表型。根据制造商的说明，将个体化细胞置于MethoCult（干细胞技术）培养基中，以量化结肠免疫单位。

畸胎瘤形成检测

将培养在MEF上的特征化iPSCs肌肉注射到SCID/米色小鼠的后肢中（Harlan Laboratories，Madison，WI）。每个细胞系注射三只小鼠，每只小鼠注射一个6孔板细胞。注射前，将Matrigel（BD Biosciences）以总体积的1/3添加到细胞悬浮液中。肿瘤在5至12周时形成，并由McArdle癌症研究实验室（威斯康星大学麦迪逊分校）进行苏木精和伊红染色和组织学分析。在细胞动力学国际动物护理和使用委员会的批准下，所有动物工作均按照相关的国家和国际指南进行。

心脏分化

通过细胞聚集法诱导心脏发生。简单地说，用胶原酶IV（Invitrogren）采集MEF上生长的TiPS细胞，用柠檬酸钠将Matrigel上生长的细胞分解成单细胞悬浮液。在存在重组人肝细胞生长因子（HGF）和/或zbFGF的情况下，允许细胞悬浮液在超低附着烧瓶中形成聚集物。此外，将ROCK抑制剂H1152添加到Matrigel来源的细胞悬浮液中。在第14-15天分离搏动聚集物并对其进行心肌肌钙蛋白T（cTnT）染色（Abcam，Cambridge，MA，克隆1C11）。

神经元分化

TiPS细胞的神经分化如前所述[29]简而言之，在MEF上生长的TiPS被胶原酶IV部分解离，并在干细胞神经干细胞扩展培养基（Sigma-Aldrich）中悬浮培养，该培养基补充有B27补充剂（Invitrogen）、bFGF（100 ng/ml）和表皮生长因子（100 ng/ml，Chemicon，Billerica，MA）。每周使用McIlwain组织切碎器传代培养物。为了诱导神经分化，将球体在神经诱导培养基（DMEM/F12加N2补充物，Invitrogen）中生长一周，然后在添加cAMP（1 uM，Sigma-Aldrich）、抗坏血酸（200 ng/ml，Sigma Aldrich，脑源性神经营养因子和胶质细胞系源性神经生长因子（均为10 ng/ml，R&D Systems）再治疗3周。如前所述，通过免疫荧光染色分析神经元标记物β-Ⅲ-管蛋白的表达[30].

支持信息

图S1

DNA指纹。短串联重复序列（STR）分析表明，在所分析的8个STR基因座中检测到的所有15个等位基因多态性，TiPS细胞系与亲本激活的T细胞完全相同。显示了两条TiPS线（TiPS L-1和TiPS L-2）的代表性数据。

（3.65 MB TIF）

图S2

碱性磷酸酶（AP）染色。TiPS线TiPS L-1和TiPS L-2呈AP阳性。图像是在HP Scanjet G3110计算机扫描仪上采集的。

（2.87 MB畅通节能法）

图S3

TiPS细胞系显示正常核型。TiPS细胞系“TiPS L-1”和“TiPS L-2”在MEFs上生长6代，系“TiPS V-1”和“TiPS V-2”分别在Matrigel上生长18代中的8代和34代中的30代。对细胞进行G显带分析，未检测到克隆异常。

（4.70 MB TIF）

图S4

用于重编程实验的MMLV逆转录病毒结构的矢量图。“RG”表示重编程基因。

（1.91 MB畅通节能法）

致谢

作者感谢乔治娅·萨尔瓦吉奥托（Giorgia Salvagiotto）、尼克·西伊（Nick Seay）和彼得·福尔肯（Peter Fuhrken）对手稿进行了有益的科学讨论和批判性审查；Jeffrey Roszkowski为有益的科学讨论；威斯康星大学麦迪逊-麦卡德尔癌症研究实验室和斯坦福大学畸胎瘤样本组织学分析的Ruth Sullivan及其同事。

脚注

竞争利益：所有作者均受雇于Cellular Dynamics International，Inc.，并在其中拥有经济利益。此外，所有作者都被列为与本文所述作品相关的专利申请的发明人。这并不会改变作者对所有PLoS ONE数据和材料共享政策的遵守程度。

基金：这项研究得到了Cellular Dynamics International，Inc.对所有作者的研究资助。出资人在决定出版手稿中发挥了作用。

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