美国国家科学院院刊。2010年5月11日；107(19): 8788–8793.
线粒体代谢和活性氧生成对Kras介导的致瘤性至关重要
,一 ,一 ,一 ,一 ,b条 ,b条 ,b条 ,一 ,一和a、，c、，日期：，1
乔伊·约瑟夫
b条威斯康星医学院生物物理与自由基研究中心系，密尔沃基，WI 53226
马科斯·洛佩兹
b条威斯康星医学院生物物理与自由基研究中心系，密尔沃基，WI 53226
巴拉拉曼·卡利亚纳拉曼
b条威斯康星医学院生物物理与自由基研究中心系，密尔沃基，WI 53226
Navdeep S.Chandel公司
一医学部肺和危重病护理科，
c（c）Robert H.Lurie综合癌症中心
d日伊利诺伊州芝加哥西北大学医学院细胞与分子生物学系，邮编：60611；和
一医学部肺和危重病护理科，
c（c）Robert H.Lurie综合癌症中心
d日伊利诺伊州芝加哥西北大学医学院细胞与分子生物学系，邮编：60611；和
b条威斯康星医学院生物物理与自由基研究中心系，密尔沃基，WI 53226
由马萨诸塞州波士顿哈佛医学院Lewis Clayton Cantley编辑，于2010年3月31日批准（2010年3月17日收到审查）
作者贡献：F.W.、R.H.、B.K.、G.M.M.、G.R.S.B.和N.S.C.设计的研究；F.W.、R.H.、W.W.W.、S.W.和N.S.C.进行了研究；J.J.、M.L.和B.K.贡献了新的试剂/分析工具；F.W.、R.H.、G.M.M.、G.R.S.B.和N.S.C.分析数据；F.W.、R.H.、G.R.S.B.和N.S.C.撰写了这篇论文。
- 补充资料
支持信息
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摘要
奥托·沃伯格（Otto Warburg）关于癌症起源的理论假设，肿瘤细胞在线粒体氧化磷酸化方面存在缺陷，因此依赖高水平的需氧糖酵解作为ATP的主要来源来促进细胞增殖（沃伯格效应）。这与正常细胞不同，正常细胞主要利用氧化磷酸化促进生长和生存。在这里，我们报道了Kras诱导的锚定非依赖性生长（转化细胞的标志）的葡萄糖代谢的主要功能是支持磷酸戊糖途径。糖酵解ATP的主要功能是在缺氧条件下支持生长。谷氨酰胺通过谷氨酰胺酶和丙氨酸转氨酶转化为三羧酸循环中间产物α-酮戊二酸对Kras诱导的凤尾鱼非依赖性生长至关重要。线粒体代谢允许产生活性氧物种（ROS），而活性氧物种是Kras通过调节ERK-MAPK信号通路诱导凤尾鱼非依赖性生长所必需的。我们表明，非锚定生长所需ROS生成的主要来源是Qo（o）线粒体复合体III的位置。此外，线粒体转录因子A（TFAM）基因缺失导致的线粒体功能破坏降低了致癌Kras驱动的小鼠肺癌模型中的肿瘤发生率。这些结果表明，线粒体代谢和线粒体活性氧生成对Kras诱导的细胞增殖和肿瘤发生至关重要。
关键词：Warburg效应、谷氨酰胺、糖酵解、肺癌、复合物III
20世纪20年代，奥托·沃伯格（Otto Warburg）观察到肿瘤切片在氧气充足的情况下，葡萄糖消耗和乳酸生成水平升高（称为沃伯格效应）(1). 他后来假设癌症起源于呼吸的不可逆损伤，随后糖酵解增加，以替代因氧化磷酸化缺陷导致的ATP损失(2). 根据Warburg的说法，这种从氧化磷酸化到糖酵解的代谢转变将分化细胞转化为未分化细胞，并增殖为癌细胞。虽然肿瘤细胞表现出高水平的需氧糖酵解的观察得到了证实，但线粒体在肿瘤细胞中的作用一直存在争议(三). 虽然许多研究人员已经证明线粒体在大多数肿瘤细胞中确实起作用，但一些人认为线粒体代谢和呼吸速率的降低对肿瘤细胞增殖至关重要(4). 然而，唯一表现出线粒体功能障碍的肿瘤细胞是那些三羧酸（TCA）循环酶琥珀酸脱氢酶（SDH）或富马酸水合酶（FH）突变的肿瘤细胞(5). 此外，癌基因激活增加线粒体代谢(6)与转移潜能相关(7).
肿瘤细胞代谢的一个吸引人的模型是，癌细胞诱导的转化依赖于ATP合成的糖酵解升高以及糖酵化中间产物向磷酸戊糖途径的转移(8). 这些中间体分别用于生成NADPH和5-磷酸核糖，用于还原生物合成反应和核苷酸生物合成。糖酵解生成ATP的效率较低，但速度比氧化磷酸化更快(9). 糖酵解增加ATP的生成被假定为为增殖细胞提供代谢优势，而线粒体的作用仅限于提供TCA循环中间产物作为脂质和非必需氨基酸从头合成的底物(10). 自Warburg的初步观察以来，在阐明肿瘤细胞的代谢重编程方面取得了很大进展，然而，葡萄糖代谢和线粒体代谢在调节癌基因诱导的致瘤性方面的作用尚未完全了解。在本研究中，我们结合生物化学、药理学和遗传学技术来剖析葡萄糖和线粒体代谢在Kras介导的致瘤性中的作用。
结果
戊糖磷酸途径（而非糖酵解）对Kras在好氧条件下诱导生长至关重要。
为了测试Kras诱导的细胞增殖是否需要高水平的有氧糖酵解，我们评估了KrasG13D驱动的HCT116结肠癌细胞在含有半乳糖或葡萄糖的软琼脂中生长的能力。半乳糖通过Leloir途径进入糖酵解，其进入糖酵解的速率明显低于葡萄糖进入糖酵解的速率(11). 在含有葡萄糖或半乳糖的培养基中生长的细胞在软琼脂中生长(). 在半乳糖中生长的HCT116细胞显示耗氧率（OCR）与细胞外酸化率（ECAR）的比率增加(). ECAR是乳酸生成的间接测量。用显性阴性p53永生化并经肉豆蔻酰化AKT、HrasV12、KrasV12或MCF-7乳腺癌细胞（激活的PI3K突变）异位转化的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）也观察到了类似的结果以及从含有一个野生型Kras等位基因和另一个含有Lox-STOP-Lox-KrasG12 D等位基因的小鼠分离的MEF（称为LSL-KrasG12D 3T3MEFs）(图S1).
戊糖磷酸途径（而非糖酵解）对Kras在有氧条件下诱导生长至关重要。(A类)在含有20 mM葡萄糖、20 mM半乳糖、4 mM谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠的培养基中分析HCT116细胞的软琼脂集落。(B类)用4 mM谷氨酰胺加20 mM葡萄糖或半乳糖培养HCT116细胞的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）之比。平均值±SE(n个=20). **P（P）< 0.01 (C类)HCT116细胞中对照组的OCR和ECAR与GPI shRNA#1和#2的比率。平均值±SE(n个=20). **P（P）< 0.01 (D类)HCT116表达对照组或GPI shRNAs的软琼脂菌落在常压（21%O）下生长的分析2)或缺氧（3%O2). 条形代表平均值±SE(n个=16). **P（P）< 0.01.
半乳糖主要通过进入戊糖磷酸途径而非糖酵解来支持细胞增殖(11). 为了进一步分析糖酵解和磷酸戊糖途径在生长中的作用，我们通过shRNA降低了葡萄糖6-磷酸异构酶（GPI）蛋白水平。GPI的降低使磷酸戊糖路径在破坏糖酵化的同时正常进行。感染两种不同慢病毒GPI shRNA的HCT116细胞在线粒体抑制剂鱼藤酮存在下死亡(图S2A类)并显示OCR/ECAR比率增加，表明生存依赖线粒体代谢(). 在正常氧条件下，表达GPI shRNA的HCT116细胞和对照shRNA的细胞的软琼脂集落总数没有差异；然而，在缺氧条件下，菌落数有显著差异(). 对正常氧条件下菌落大小的进一步检查表明，降低GPI蛋白水平会抑制细胞在菌落中生长到150微米以上的能力，这是细胞缺氧的阈值(图S2B类). 这些结果表明，葡萄糖代谢对生长的主要作用是为戊糖磷酸途径提供燃料，而糖酵解ATP的生成只对缺氧条件下的生长是必需的。
肿瘤Kras诱导的生长需要TCA循环的谷氨酰胺分解代谢。
以前的研究表明Hela细胞和Myc过度表达的肿瘤细胞需要谷氨酰胺代谢来促进细胞生长和增殖(12–15). 谷氨酰胺可以通过谷氨酰胺酶转化为谷氨酸。随后，谷氨酸通过氨基转移酶或谷氨酸脱氢酶转化为α-酮戊二酸，从而进入TCA循环。为了确定谷氨酰胺进入TCA循环是否是肿瘤细胞生长的一般要求，我们使用了氨基氧乙酸（AOA），一种有效的转氨酶活性抑制剂。AOA抑制HCT116人结肠癌细胞的软琼脂集落生长，添加细胞渗透性α-酮戊二酸二甲酯（DMK）可以挽救AOA(). 在LSL-KrasG12D 3T3 MEF和人MCF-7乳腺癌细胞中也观察到类似的结果(图S3A类和B类). 谷氨酰胺添加到培养基中刺激了氧消耗，AOA抑制了氧消耗并被DMK挽救(). 在谷氨酰胺存在的情况下，DMK并没有进一步促进生长，这表明DMK诱导的菌落生长是AOA治疗的一种特效补救措施(图S3C类). 谷氨酸转化为α-酮戊二酸分别需要丙酮酸或草酰乙酸通过丙氨酸或天冬氨酸转氨酶。我们推断丙酮酸比草酰乙酸更丰富，可以进行转氨反应；因此，我们测试了线粒体丙氨酸氨基转移酶（ALT2）的减少是否会减弱锚定非依赖性生长。事实上，与对照shRNA细胞相比，表达ALT2 shRNA的HCT116细胞的集落生长减少，这是DMK挽救的效果(). 有趣的是，谷氨酰胺酶（GLS1）的敲除也降低了菌落生长，但DMK并没有有效地挽救(). 谷氨酸是GLS的产物，也是生成谷胱甘肽和NAPDH所必需的，以提供氧化还原平衡(15). 这些数据表明，谷氨酰胺通过ALT2和GLS1为TCA循环提供燃料的能力对于锚定非依赖性生长至关重要。
线粒体的谷氨酰胺分解代谢是致癌Kras诱导的凤尾鱼非依赖性生长所必需的。(A类)在含有4 mM谷氨酰胺和20 mM葡萄糖或20 mM半乳糖的培养基中，在2 mM氨基氧乙酸（AOA）和7 mM二甲基α-酮戊二酸（DMK）的存在下，分析HCT116细胞的软琼脂集落。平均值±SE(n个=9). **P（P）< 0.01. (B类)在基础培养基中培养HCT116细胞并随后暴露于谷氨酰胺、AOA和DMK后，测量其耗氧率（OCR）。(C类)HCT116细胞表达对照组和丙氨酸氨基转移酶2（ALT2）shRNA#1和#2±DMK或(D类)对照组和谷氨酰胺酶1（GLS1）shRNA#1和#2±DMK。条形代表平均值±SE（n=16英寸C类和n个=8英寸D类). **P（P）< 0.01.
线粒体衍生的活性氧（ROS）是细胞增殖所必需的。
线粒体代谢的结果是通过电子传递链产生活性氧。以前的报告表明癌细胞比正常细胞表现出更多的氧化应激(16). 事实上，我们观察到由线粒体靶向氧化还原敏感GFP（mito-roGFP，). 该roGFP蛋白含有两个表面暴露的半胱氨酸，它们在氧化剂存在下形成二硫键，导致400 nm处的激发增加，而在490 nm附近的峰则消失。这些结果通过检测细胞内H2O（运行）2水平(). 我们假设线粒体ROS是维持致癌诱导的凤尾鱼非依赖性生长所必需的。为了验证这一点，在存在线粒体靶向一氧化氮、MCP和MCTPO的情况下评估菌落生长，MCP和MC TPO作为超氧化物歧化酶模拟物和超氧化物清除剂。这些氮氧化物通过将氮氧化物部分共价偶联到三苯基膦阳离子（TPP）来靶向线粒体(17). 与不以线粒体为靶点的对照一氧化氮（CTPO和CP）相比，经线粒体一氧化氮（MCP和MCTPO）处理的细胞的集落生长降低，表明线粒体衍生的活性氧对凤尾鱼的非依赖性生长至关重要(和图S4A类–C类). 抗氧化剂不会导致细胞死亡(图S4D类).
线粒体活性氧是肿瘤诱导的凤尾鱼非依赖性生长所必需的。(A类)p53DN、Myr-Akt-p53DN、HrasV12-p53DN和KrasV12-p 53DN细胞中氧化丝裂原GFP的水平。平均值±SE(n个=4). *P（P）< 0.05; 对p53DN细胞与Myr-Akt、HrasV12或KrasV12细胞进行统计比较。(B类)细胞内H2O（运行）2用Amplex Red评估p53DN、KrasV12-p53DN细胞、LSL KrasG12D 3T3±Cre细胞裂解液中的水平。平均值±SE(n个=4). 所示数据为KrasV12-p53DN细胞/永生化p53DN和LSLKrasG12D3T3+Cre/永生化LSLKlasG12D。软琼脂菌落分析(C类)LSL-Kras G12D，以及(D类)用线粒体靶向抗氧化剂1μM MCTPO、1μM MCP或对照化合物1μM CTPO、1μM CP和1μM TPP处理的HCT116细胞系。平均值±SE(n个=9). **P（P）< 0.01; MCTPO或MCP与TPP之间的统计比较。
线粒体ROS通过ERK1/2调节细胞增殖。
为了确定线粒体ROS是否调节细胞增殖，我们评估了KrasV12-p53DN、HrasV12-p 53DN、myr-Akt-p53DN MEF、LSL-KrasG12D 3T3 MEF和HCT116细胞在用有丝分裂靶向抗氧化剂治疗后增殖的能力。治疗后48小时，所有细胞系的增殖速度均降低，表明线粒体活性氧被有丝分裂靶向抗氧化剂消融后，细胞增殖停滞(和图S5). 细胞外信号调节激酶（ERK1/2）MAP激酶途径是细胞增殖的重要调节因子。ERK MAPK受上游MEK激酶（MAPK激酶）调节，低水平诱导细胞增殖，高水平则导致生长停滞(18). 有丝分裂-一氧化氮（而非非靶向一氧化氮）诱导肿瘤细胞磷酸化ERK 1/2的增加(和图S6A类和C类). MEK抑制剂U0126将ERK1/2的磷酸化降低到与在缺乏有丝分裂氮氧化物的情况下培养的细胞相似的水平(和图S6B类和D类). 此外，用MEK抑制剂U0126处理的细胞在有丝分裂氮氧化物存在的情况下挽救了软琼脂集落的形成(和图S7). 这些数据表明，致癌诱导的线粒体ROS作为信号分子，将ERK1/2 MAPK途径抑制到与细胞增殖和随后的凤尾鱼非依赖性生长相兼容的水平。
线粒体ROS通过MAPK/ERK1/2途径调节锚定非依赖性生长。(A类)线粒体靶向一氧化氮和对照化合物对治疗后24、48或72小时LSL-Kras G12D 3T3 MEFs+Cre细胞增殖的影响*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01. MCTPO或MCP与TPP之间的统计比较。(B类)LSL-KrasG12D 3T3 MEFs细胞中磷酸化ERK1/2和总ERK的Western blot分析，将血清饥饿18小时（0个时间点）或在血清刺激15分钟后，用1μM MCTPO、1μM CTPO、1μC CP和1μM TPP治疗48小时。(C类)在0 nM、100 nM或500 nM U0126存在下，不使用药物或1μM MCP治疗48小时后，对磷酸化ERK1/2和总ERK进行Western blot分析。(D类)分析在0 nM、100 nM或500 nM UO216存在下用0或1μM MCP处理的LSL-KrasG12D 3T3 MEF的软琼脂菌落。平均值±SE(n个=9). **P（P）< 0.01. 对经Mito CP处理的细胞和未经Mito CR处理的细胞进行统计比较。
线粒体复合物III独立于氧化磷酸化调节锚定非依赖性生长。
为了从基因上解决线粒体活性氧对凤尾鱼非依赖性生长的需求，我们利用线粒体DNA缺失（ρ0143B电池）。这些ρ0然后用野生型线粒体或线粒体重建细胞，线粒体编码的细胞色素中含有4-bp突变b条基因（wt或Δ细胞色素b条143B杂交种）。两者ρ0细胞和Δ细胞色素b条143B杂合物缺乏氧化磷酸化，无法在富含半乳糖的无葡萄糖培养基中存活(图S8A类). 然而，ρ0143B细胞不能产生线粒体活性氧，而Δ细胞色素b条杂交可以在Q处产生超氧物o（o）综合体III场地(19). 正如预测的那样，ρ0与Δ细胞色素相比，143B细胞具有检测不到的线粒体ROS水平b条通过丝裂原绿色荧光蛋白探针氧化评估杂交(). ρ0与Δ细胞色素相比，143B细胞在软琼脂中的生长最小b条143B cybridges，强调线粒体ROS在肿瘤细胞增殖中的重要性(). Δ细胞色素b条与野生型143B杂交相比，143B杂交在软琼脂中的生长较少，这表明氧化磷酸化缺陷也会减少凤尾鱼的非依赖性生长。野生型杂交与Δ细胞色素b条由于AOA消除了软琼脂集落的形成，杂交后代都依赖谷氨酰胺进入TCA循环(). 这些结果表明Δ细胞色素b条尽管杂合物不能通过氧化磷酸化生成ATP，但它们仍然需要通过TCA循环进行谷氨酰胺分解代谢。
线粒体复合体III产生的活性氧是凤尾鱼非依赖性生长所必需的。(A类)143B细胞、ρ°143B细胞，野生型143B杂交细胞和Δ细胞色素中氧化丝裂原GFP的水平b条143B聚伞花序。(B类)143B，ρ的软琼脂菌落分析0143B细胞、野生型杂交和Δ细胞色素b条混血儿。平均值±SE(n个=9). *P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01. (C类)野生型杂交种软琼脂集落和Δ细胞色素分析b条用2 mM氨基氧乙酸（AOA）±7 mM二甲基α-酮戊二酸（DMK）处理的杂交后代。(D类)RISP蛋白和(E类)野生型143B杂交种软琼脂集落和Δ细胞色素分析b条143B杂交株稳定感染阴性对照shRNA或RISP shRNA**P（P）< 0.01.
Δ细胞色素b条143B杂交后代有一个被破坏的复合物III，但仍有Rieske铁硫蛋白（RISP）的残留水平，RISP是Q产生活性氧所需的成分o（o）综合体III场地(20). 如果没有RISP，则不会在Q生成ROSo（o）综合体III场地(19). 野生型143B杂交种和Δ细胞色素b条143B杂交株稳定感染了针对RISP或阴性对照shRNA的shRNA(). 在没有RISP的情况下，野生型143B杂交种和Δ细胞色素中的锚定非依赖性生长被阻断b条143B杂交，表明从Q产生的ROSo（o）综合体III的场地需要进行非锚定生长(). 针对RISP的第二个shRNA也获得了类似的结果(图S8B类).
体内肿瘤发生需要线粒体代谢。
ρ的无能力0细胞以不依赖锚定的方式生长表明线粒体功能对肿瘤细胞增殖至关重要。为了解决体内线粒体功能丧失是否影响肿瘤发生，我们交叉了LSL-Kras G12D携带线粒体转录因子A漂浮等位基因的小鼠(Tfam公司). 线粒体DNA复制和转录需要TFAM，以前的研究表明Tfam公司-空白组织缺乏电子传递和氧化磷酸化(21). 在杂交这些动物后，我们证实Cre重组酶降低了TFAM蛋白水平和线粒体DNA编码蛋白细胞色素c氧化酶亚基I（COXI）(). LSL-KrasG12D等位基因的重组频率不受TFAM漂浮等位基因存在的影响(图S9). 经Cre治疗的气管内腺病毒LSL-Kras G12D+/佛罗里达州-Tfam公司飞行/飞行与腺病毒治疗组相比，小鼠每单位面积形成的病变较少，肿瘤较小，Ki67阳性细胞较少LSL-Kras G12D+/佛罗里达州老鼠(). 这表明功能性线粒体电子传递链是肿瘤发生所必需的。
致瘤Kras驱动的小鼠肺腺癌需要线粒体代谢。(A类)肺裂解物中TFAM、细胞色素c氧化酶亚单位I蛋白（COXI）和α-管蛋白的Western blot分析(B类)组织学LSL-Kras G12D佛罗里达州/+和LSL-Kras G12D佛罗里达州/+Tfam公司飞行/飞行气管内滴注Cre-relubise治疗12周后的肺部。（比例尺，1厘米。）(C类和D类)肿瘤负荷和每个肺组织面积的病灶数LSL-Kras G12D佛罗里达州/+和LSL-Kras G12D佛罗里达州/+Tfam公司飞行/飞行老鼠。条形代表平均值±SE(n个=6只动物）*P（P）< 0.05. (E类)Ki67染色（增殖指数）LSL-Kras G12D佛罗里达州/+和LSL-Kras G12D佛罗里达州/+Tfam公司飞行/飞行小鼠肺部。条形代表平均值±SE(n个=6只动物）*P（P）< 0.05.
讨论
最近的研究表明，癌基因功能的增强、肿瘤抑制剂的缺失或突变以及磷酸肌醇3-激酶（PI3K）的激活是在肿瘤细胞中观察到的高水平有氧糖酵解的主要调节因子(22). 我们目前的研究表明，这种高糖酵解通量需要为戊糖磷酸途径提供连续的糖酵化中间体，以便为快速增殖的肿瘤细胞生成核苷酸和磷脂。我们的前提是，相对于ATP的生成，有氧糖酵解增强对合成代谢过程（如核苷酸和磷脂合成）更为重要，这一点得到了以下观察结果的支持：GPI蛋白水平的降低并不能阻止菌落在有氧条件下的生长。GPI的丢失应允许葡萄糖-6-磷酸为戊糖磷酸途径提供燃料，但不允许糖酵解。这些结果与先前的研究一致，这些研究表明丙酮酸激酶M2亚型（PKM2）的低活性形式将糖酵解中间体引导到核苷酸和磷脂生物合成中(23). 肿瘤细胞表达PKM2亚型并抑制PKM2减少人肺癌细胞的异种移植瘤生长(23). 值得注意的是，虽然有氧糖酵解为正常氧细胞的戊糖磷酸途径提供燃料，但低氧细胞糖酵分解的主要作用是生成ATP以维持生存。我们的观察结果支持了这一前提，即GPI的降低导致了缺氧条件下菌落生长的减少。这些结果与先前的研究一致，这些研究表明，抑制糖酵解酶乳酸脱氢酶A（LDH-A）可以通过阻止这些肿瘤细胞在缺氧条件下存活来阻止Myc肿瘤细胞的锚定非依赖性生长和小鼠乳腺癌细胞的异种移植瘤形成(24,25).
先前的研究表明，过度表达Myc的细胞利用谷氨酰胺代谢促进其增殖(13,14). Myc抑制microRNA mir23a/b，允许谷氨酰胺酶的表达(15). 我们目前的结果表明，谷氨酰胺成瘾可能是一种普遍现象，因为Ras-、Myc-和AKT-依赖性肿瘤细胞需要谷氨酰胺供应的线粒体代谢。在缺乏或存在葡萄糖的情况下，TCA循环的谷氨酰胺分解代谢对肿瘤细胞的生长和增殖至关重要。谷氨酰胺通过谷氨酰胺酶转化为谷氨酸，谷氨酰胺酶可以通过丙氨酸或天冬氨酸转氨酶以及谷氨酸脱氢酶转化为α-酮戊二酸。shRNA对线粒体丙氨酸氨基转移酶的抑制阻止了致癌Kras转化细胞中锚定非依赖性生长，而细胞可渗透的α-酮戊二酸挽救了这种生长。TCA循环中谷氨酰胺分解代谢的一个重要结果是通过电子传输链的络合物I、II和III产生还原当量以生成ROS。我们的数据表明，致癌Kras诱导线粒体ROS增加，以控制细胞增殖。这些结果与之前的研究一致，这些研究表明活性氧调节细胞周期进展(26). 我们认为癌基因诱导线粒体ROS作为信号分子来调节细胞增殖。
我们观察到线粒体DNA缺陷细胞（ρ0细胞）不会产生活性氧，也不会以独立于锚的方式生长。相比之下，线粒体DNA缺失的细胞编码细胞色素b条该基因能够产生活性氧，并在一个独立于锚定的人中生长。两者ρ0143B细胞和细胞色素b条空143B细胞缺乏氧化磷酸化。防止野生型或细胞色素复合物III产生活性氧b条靶向复合物III亚单位RISP的shRNA导致的空细胞减少细胞色素的生长b条软琼脂中的空细胞。这些结果表明，复合III生成的活性氧对维持转化的癌细胞表型至关重要。我们的观察进一步证实了线粒体在调节肿瘤发生中的重要作用，即在Kras致瘤小鼠肺腺癌模型中，复制和维持mtDNA拷贝数所需的TFAM蛋白的丢失降低了肿瘤的致瘤性。
总之，我们的数据表明，大多数癌细胞已经进化为利用糖酵解、磷酸戊酯途径和线粒体代谢为细胞快速增殖提供必要的资源。我们认为，癌细胞中有氧糖酵解的主要作用可能是为磷酸戊糖途径提供糖酵化中间体，以进行核苷酸和磷脂合成，而糖酵分解ATP的生成可能对缺氧条件下的生存很重要。以谷氨酰胺为燃料的TCA循环产生ATP、ROS、NADPH、氨基酸、核苷酸和脂质。我们认为，通过氨基酸以及脂肪酸氧化等其他来源将底物喂入TCA循环对肿瘤诱导的致瘤性至关重要。破译癌症细胞与正常细胞中不同的TCA循环燃料途径，将有助于设计靶向治疗。
方法
完整方法可用作SI方法.
通过两层琼脂系统（Millipore）中的平板细胞评估锚定非依赖性生长，其中底层琼脂糖的最终浓度为0.8%，包含细胞的顶层琼脂糖为0.4%。西北大学动物护理和使用委员会批准了小鼠使用方案。LSL-Kras G12D小鼠具有混合的B6/129背景，从国家癌症研究所知识库（马里兰州贝塞斯达）获得。Tfam公司漂浮小鼠的背景为C57BL/6，由Ozgene产生，如前所述(21). 我们使用了同窝出生的Tfam公司用鞭子将老鼠交给LSL-Kras G12D老鼠。
致谢
我们感谢Carlos Moraes博士和IFM de Coo博士提供的细胞色素b条突变细胞。我们感谢Gerry Shadel博士提供的小鼠TFAM抗体。这项工作得到了LUNGevity基金会和独立肺健康组织联合会的支持，该联合会由芝加哥大都会呼吸健康协会（至N.S.C.）和美国国立卫生研究院R01CA123067-04、ES015024（至G.M.M.）、ES013995（至G.R.S.B.）、P01HL071643（至N.M.、G.M.M.和G.R.S.B.）召集，和CA125112（至英国）。F.W.和W.W.得到了国家卫生研究所产前培训拨款T32CA009560-22的支持。R.H.得到了国家卫生研究所博士后培训基金T32CA070085-13的支持。
工具书类
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