基于电路的神经解剖学的分子遗传学和成像技术

前言

介绍

单个神经元代表大脑的基本组成部分。然而，了解神经元如何通过突触“连线”，它们形成的微电路，以及这些微电路如何参与神经网络以驱动感知和行为，仍是生物学的主要前沿之一。为了完全解开复杂的神经计算和表示，我们必须考虑混合细胞类型之间形成的连接结构，以及电活动如何通过网络传播以实现其动态功能。我们目前对神经元回路如何产生感觉知觉、记忆和行为的理解尚处于起步阶段。在大多数情况下，大脑功能是如何从现有电路图中显现出来的还很不清楚。弥合这一概念鸿沟需要跨多个尺度的知识，包括细胞类型特定的遗传身份、人群层面的网络连接、单个突触的功能和动力学以及电路输出。

21世纪的神经解剖学^标准分子和基因操作的结合，旨在通过基因表达谱分析、高分辨率成像和电生理学探测电路功能，正在重新点燃世纪的火花。此外，目前正在努力构建多模型生物中所有神经元及其全部突触的高分辨率地图¹这些用于监测和操纵电路、神经元和突触的新技术正在提供扩展的功能，预示着功能性神经解剖学的新纪元。在这里，我们简要追溯了目前可用于探测神经元和电路架构的技术武库的演变。此外，我们对当前的实验局限性进行了批判性讨论，并提出了未来的收敛方法，以促进对神经解剖学的更深入理解。

解决神经架构

随着生物电子显微镜（EM）的出现和Palade等人的初步工作，人们看到了神经元细胞器和结构的新亚细胞细节，包括突触接触的组织²早期的EM电路图从单细胞到完整的无脊椎动物神经系统^三,4以及哺乳动物的视网膜组合和皮质柱^5,6,7最近，随着体积EM技术的进步，电子显微镜的威力和实用性得到了扩展⁸，可以揭示神经元形态和亚细胞结构的精细细节，并在自然三维（3D）环境中提供近分子分辨率(方框1).

方框1体积电子显微镜

目前的体EM方法依赖于通过完整神经组织制作的超薄连续切片进行三维（3D）图像重建。单个剖面（A）在z轴上重建，以构建一个可使用图像分析软件（B）在所有轴上进行数字导航的图像平面体积块。3D图像重建进一步实现了从亚细胞器到细胞形态的完整神经元结构的体积分离（C）^10,77连续切片透射电子显微镜（SSTEM）是第一种能够组装高分辨率电路数据的体积EM技术，一直是解决三维神经元超微结构的主要方法^三,4,10,77这种方法依赖于手动将超薄组织切片收集到网格上，并以序列（D）的形式进行成像和重建。SSTEM是金标准，但劳动密集型，常规重建厚度小于~50 nm的高质量截面数据集的能力有限。

序列块面扫描电子显微镜（SBFSEM）不需要切割需要手动采集和后续成像的超薄切片，而是依靠从嵌入组织块表面散射的电子生成图像，该组织块经过反复的表面切片以揭示深层结构⁷⁸（E） ●●●●。由于图像是在每次切割之前从块的表面捕获的，因此无需收集组织，从而在自动化整个过程的同时减少了截面厚度的变化。用于连续成像的块面离子束铣削提供了机械切割的优雅替代方案¹¹尽管SBFSEM有望精简批量EM，但迄今为止，技术限制阻碍了其广泛使用；样品质量和图像分辨率仍低于SSTEM⁸.

与切片机切片相比，SSTEM的一种排列方式提供了更高的z截面分辨率，即串行截面电子断层扫描（SSET）（F）⁷⁹在这种方法中，亚细胞结构是通过组合从角度2D投影倾斜序列捕获的多个图像来重建的，以生成3D层析图。与SSTEM或SBFSEM相比，该技术的主要优点是减少了构建高分辨率图像体所需的截面数。

所有这些技术的一个主要挑战是需要精确的图像对齐、轮廓识别、自动分割和错误检查，以便组装详细的体积集。所有当前的精确方法都需要手动完成（或至少管理）^8,10,80,81。计算方法将在多大程度上取代暴力手动跟踪仍有待确定。克里斯汀·哈里斯（Kristen M.Harris）善意地提供了用于生成面板A-C中所用图像的原始EM数据系列。使用Amira软件（Visage Imaging，柏林）为图形表示准备了体积化数据集。

作为EM体积重建的补充，有序阵列层析成像与荧光成像相结合，允许对荧光探针标记的单个细胞或亚细胞结构进行亚微米研究⁹在这项技术中，纳米级z（z）通过收集超薄切片（50–100nm），然后使用抗体或荧光蛋白进行分子定位来实现分辨率。与体EM数据集所需的劳动密集型协议不同，阵列层析成像提供了一个相对简单的平台，该平台结合了光学显微镜和EM，以揭示完整神经组织的分子和超微结构细节。

连续切片、对齐和计算分析的新方法不断提高EM重建的速度和效用，以研究神经组织的超微结构特征¹⁰然而，使用电子显微镜和光学显微镜绘制大脑连接图的一个主要限制是目前缺乏超越小规模实验所需的高通量方法。随着技术的进一步发展，更快速地收集、管理和分析高分辨率成像数据^8,10,11超微结构分析将变得更容易掌握。然而，这种类型的数据不能实时或在活组织内提供动态信息。为此，我们必须求助于光学成像和遗传策略。

分子遗传学领域的不断扩大为探索神经解剖学提供了许多途径。条件敲除小鼠、诱导基因表达系统和神经活性基因控制的进展为以前所未有的精确度探测电路生物学提供了手段¹²在海洋无脊椎动物中编码荧光蛋白（FP）的基因的开创性发现使FP和FP标记的生物分子能够在哺乳动物大脑的活神经元中表达^13,14提供了一系列复杂的成像和基因剖析技术^15,16,17,18.

分子遗传革命

神经细胞群体具有特定的遗传特性。基于形态学或电特性的神经元细胞类型的经典定义现在可以与基因表达的离散模式联系起来，也许最终会被其取代。随着分子遗传学的发展，人们有能力查询单个细胞或整个大脑区域的基因组成。哺乳动物大脑中特定类型的神经元是否会形成刻板的连接模式？这种连接是否会导致可预测的电路功能或行为输出模式？现在，通过对大脑细胞进行基因标记和操作，可以解决这些问题。操纵小鼠遗传程序的主要进展允许随意产生功能丧失、功能获得和条件突变¹⁹条件遗传策略已经证明对理解神经元回路至关重要。噬菌体衍生重组系统的实现，如Cre/loxP技术，为神经元的基因操作提供了交叉方法，从单个细胞的改变开始^20,21控制特定脑结构中的基因活性^22,23然而，利用细胞类型特异性启动子活性来精确操纵哺乳动物大脑中的神经元亚群仍然是一个挑战。通常，在目标神经元群体中转录的基因在其他大脑区域表现出重叠的表达模式，或者在发育过程中表现出动态调节，这可能会混淆它们在成熟大脑中的使用。

除了通过分子标记的靶向表达研究单个细胞的能力外，绘制啮齿动物大脑内源性基因表达模式的大规模努力也为神经科学界提供了丰富的数据（例如GENSAT、，www.gensat.org（英文）和艾伦脑图谱，网址：www.brain-map.org)²⁴。这些开放资源现在使得单个实验室没有必要进行详尽的基因表达实验，因为这些数据可以通过艾伦大脑图谱参考几乎任何神经元类型或大脑结构。然而，大多数表达数据仍然局限于健康成年动物。艾伦大脑研究所目前正在收集更完整的数据集，包括发育中的小鼠大脑、小鼠脊髓和人类皮层中的基因表达(网址：www.brain-map.org). 当所有基因的空间和时间模式在生命周期、不同物种、特定突变或疾病状态的背景下可用时，可以预见未来。

遗传电路解剖

神经科学的一个基本原理是，信息是由神经元的特性及其相互之间的联系来存储和编码的。因此，识别神经元连接模式是理解大脑功能的必要条件。为了拼凑这些模式，描述电路解剖和神经元活动流的信息是必不可少的。最近出现了几种优雅的技术，可以进行跨突触电路分析和精确控制神经元放电¹²包括使用逆转录病毒载体^25,26,27光基因工具，如光激活离子通道^28,29,30和异源受体激活^28,31,32.

病毒载体工程的进展利用嗜神经病毒颗粒作为研究突触连接的工具³³(图1). 例如，可以修改工程伪狂犬病载体以表达FPs，从而通过逆行跨突触将病毒颗粒转移到突触前细胞来标记相互连接的神经元²⁵使用伪狂犬病病毒的一个限制是其多突触传播。由于完整电路中神经元的高度互连性，多突触扩散使得很难明确分配突触偶联的伴侣。为了避免这个问题，Wickersham等人设计了一种新的外壳蛋白互补策略，通过使用狂犬病病毒颗粒表达GFP来单突触追踪神经连接²⁷(图1).

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图1

用于跨突触标记的病毒载体

一些病毒表现出跨突触传播，包括伪狂犬病病毒（PRV）和狂犬病毒（RV）^25,26,27,33PRV可以通过表达不同颜色的FP（A）来区别追踪完整的脑回路。复制病毒载体（如PRV）的一个缺点是它们继续在细胞间传播，使得很难区分单突触和多突触连接模式。另一种方法依赖于产生编码G蛋白外壳颗粒的基因缺失的重组RV，该基因被EGFP报告子取代²⁶为了将EGFP表达的RV靶向所需的神经元亚群，RV颗粒可以用EnvA外壳蛋白进行假分型，EnvA外套蛋白特异性结合TVA类受体。通过靶向神经元进行TVA表达，RV感染可以仅限于那些神经元（B）。Wickersham等人对这种方法进行了巧妙的改进，包括引入了一种质粒，该质粒编码野生型RV G蛋白，使解除保护的EGFP表达病毒能够对TVA靶向神经元的突触前伙伴进行一轮后续感染²⁷由于只有最初感染的神经元含有野生型RV G蛋白，病毒在一轮单突触跳跃后传播停止。添加编码红色FP的质粒可以在GFP标记的细胞（C）的单突触网络中识别最初的感染靶细胞。绿色加号代表单突触病毒转移的景象；红色交叉代表由于缺乏野生型G蛋白而缺乏病毒转移的多突触位点。

除了能够对解剖结构和突触连接进行更详细的分析外，目前正在利用遗传方法来促进哺乳动物大脑中相互连接的神经元群体之间活动的选择性控制。除了神经科学中新的分支学科恰当地创造了光遗传学（见K.Deisseroth的附带评论）之外，开发新型异源受体表达系统的努力现在提供了使用化学遗传方法调节神经元活动的替代性和潜在的非侵入性手段。修饰的阿片受体的异源表达提供了一个初步的证据，即小鼠大脑中的神经元亚群可以通过合成的外源配体被基因靶向激活³⁴其他研究利用内源性受体的过度表达来放大神经元亚型特异性神经传递。例如，在多巴胺能神经元中植入高亲和力乙酰胆碱受体（nAChRs）的小鼠在低剂量服用尼古丁后表现出高多巴胺能行为³⁵此外，大鼠辣椒素受体TRPV1在小鼠大脑中的遗传靶向神经元亚群中的条件表达和激活提供了以条件依赖性Cre方式刺激所需神经元群的能力²⁸对这些策略的补充是设计不同的G蛋白偶联受体（GPCR）家族来对合成类药物化合物作出反应³⁶.

在许多应用中，需要抑制而不是激发基因定义的神经元群体。为此，已经开发了许多方法用于体内实验。其中一个模型利用了野生型GABA_A类受体对变构调节剂唑吡坦的敏感性，通常会增强受体功能。在这个设计中，产生了一个条件小鼠模型，该模型在GABA中包含一个点突变_A类受体γ2亚单位使其对唑吡坦不敏感。在Cre介导的重组后，野生型受体活性恢复到基因靶向的神经元亚群，使这些细胞对唑吡坦的药物抑制敏感³⁷正交模型已被用于驱动神经元超极化，并通过异源表达秀丽线虫伊维菌素门控氯离子通道³¹，或果蝇属allostatin受体，通过开放G蛋白偶联向内调节K来使神经元失活⁺通道³²另一种策略是阻断突触传递，而不是诱导超极化。用于失活突触传递的小分子的基因表达，或梭菌属毒素片段，使靶向突触选择性失活^38,39,40.

这些方法都有其独特的局限性。例如，伊维菌素门控氯离子通道的受控抑制依赖于多个亚单位的可用性，其功能需要适当的化学计量。另一方面，小分子介导的突触抑制³⁹诱导突触前蛋白基因修饰形式的二聚体形成，表明长时间暴露在高浓度的二聚物下具有毒性。此外，神经元激活的配体应用需要通过血脑屏障（BBB）进行转运，并且依赖于浓度。有趣的是，通过条件TRPV1表达对神经元活性进行遗传控制的小鼠模型系统可以消除其中的一些限制。多种TRPV1激动剂和拮抗剂具有一系列不同的结合亲和力、溶解度和BBB渗透性，为以潜在的非侵入性方式对深部和分散的神经元群进行药物遗传学操作提供了潜力。激活工程GPCR的化合物在BBB渗透性方面也有类似优势³⁶.

动态突触

将大脑细胞连接成功能网络的基本元素是突触。突触的基本输入/输出关系取决于有限数量的分子元素，尤其是突触前终末释放神经递质的特征以及突触后受体的数量和性质。突触作为“计算引擎”协同作用，将离散树突状区域的输入汇总、转换和中继为特定的神经元输出⁴¹因此，能够可视化突触，以及识别和操纵其属性，对理解电路功能至关重要。

在可预见的未来，一个重要而现实的目标是通过简单描述神经递质表型来超越对突触的分类，而常规地定义和可视化其功能状态。实现这一目标有助于回答有关突触网络特性的基本问题，包括：相邻突触之间的相对强度如何？给定的突触有多可塑？一个特定的突触是相对活跃的还是基本安静的？在树突的特定区域内，突触是如何一起发挥作用的？哪些突触释放概率高或低？突触是新的还是旧的？最近突触增强或减弱了吗？可视化这些突触状态参数最终将需要特定功能状态的可预测分子签名。

利用从荧光延时成像和光开关到单粒子追踪等技术，现在可以直接可视化单个突触并监测其中单个分子的运动^42,43已经发展了许多方法，通过标记FPs分子的靶向表达来追踪突触上的蛋白质。这种方法可以直接可视化神经递质的释放^44,45,46神经递质受体和突触后支架蛋白的动态运动⁴³FP融合子的表达可用于测量光漂白后的荧光恢复以及特定细胞域中光活化后荧光损失的补充技术。这些方法已广泛应用于测量突触微域内的表观扩散率和蛋白质交换^47,48超黄道pHfluorin在中性pH下发出荧光，但在细胞内隔间的酸性pH下熄灭，可以直接成像表面横向扩散、突触受体的胞吐和胞吞以及神经递质的释放体外或体内^{44,45,46,49,50,51}通过揭示特定突触对的信息，在FP报告技术的基础上跨突触伙伴重建GFP⁵²通过连接单个GFP片段以分离突触前和突触后蛋白质，当基因靶向细胞形成突触对时，可以观察到GFP荧光的重建。这种方法的一个可能局限性是在突触蛋白融合过度表达时诱导表型的可能性，突触蛋白的融合本身可能诱导新的突触或改变突触功能。促进内源性位点报告者表达的基因靶向等位基因可能会缓解这种担忧。用于可视化突触功能的FP报告人的范围不断扩大，最近使用Förster共振能量转移（FRET）报告人的研究已经开始揭示伴随突触可塑性的动态蛋白质激活事件和蛋白质相互作用^53,54.

作为对标记和追踪突触分子群体的遗传表达方法的补充，单粒子追踪（SPT）可以实时揭示单个突触分子的动力学。SPT通过计算单个分子的扩散、交换和停留时间，为单分子跟踪提供了高空间和时间分辨率。SPT的一个重要发展是使用了非常明亮的半导体量子点（QD），这有助于对树突微域中的受体进行精确的空间跟踪，并允许跨树突片段对受体进行长期跟踪⁵⁵SPT已被用于跟踪PSD离散域内纳米分辨率的单个AMPA受体³⁸以及最近在神经传递过程中监测单个突触囊泡融合事件^56,57QD技术本身不断改进，出现了更小的QD、单价标记和改进的可瞄准性⁵⁸.

在组织层面，活脑中的多光子成像可以直接显示突触蛋白动力学⁵⁹以及完整电路内的脊椎形态和突触可塑性^16,17,60,61.尽管体内成像为活体大脑中的神经元动力学提供了丰富的信息，这种方法仍然受到靶细胞深度的限制，对于研究大脑浅表区域最为有用。标记单个神经元、识别神经元上的特定突触以及监测单个蛋白质动态的多种技术的融合，迅速扩展了我们对突触组织和功能的理解。最终，通过使用这些新方法来研究动态突触体内，我们将开始了解电路元件在完整大脑的自然环境中的行为以及对感官体验的响应。

纳米审问

EM提供了神经元特征的精细空间分辨率，但不允许对活组织中的细胞进行动态成像。共焦和双光子光学显微镜以降低空间分辨率为代价提供动态信息。使用荧光显微镜的超分辨率成像技术的出现提供了连接两个世界的能力⁶²这些在活细胞中进行纳米级成像的新方法通过改变收集光的点扩散函数来绕过经典的光学限制。这些光学技巧使树突和脊椎的超分辨率成像接近串行EM提供的分辨率^18,63,64.

提高光学显微镜分辨率的第一个主要步骤是在20世纪90年代，当时致力于提高轴向分辨率。4Pi、I等方法⁵M显微镜^65,66以完善灯光聚焦为基础z（z）-轴，尽管仍然受到x个-和年-飞机。通过在空间上混合样本照明的频率模式，结构照明显微镜将分辨率提高了两倍^67,68受激发射耗尽（STED）显微术是实现超分辨率的首批方法之一，其原理是通过对非耗尽感兴趣区域周围的环状荧光分子进行非线性去激发来形成点扩散函数⁶⁹(方框2). 最初，STED成像是与合成小分子染料一起使用的，因此对完整的神经组织或基因编码的报告者来说用处有限。然而，最近的改进使得能够在器官型切片中对FP表达的海马神经元进行STED成像，从而在成像脊椎颈宽和脊椎头部曲率的能力方面有了实质性的技术改进⁶⁴.

方框2超分辨率成像技术

超分辨率成像技术现在允许光学显微镜获得低于光衍射极限的信息。标准共焦成像的分辨率受到阿贝极限（<λ/2n sinα）（A，左）定义的波长的限制，与此相反，超分辨率成像能够实现纳米级分辨率（A，右）。

通过靶向荧光团耗竭进行纳米成像。在受激发射耗尽（STED）显微术中，使用两个激光器来产生缩小的焦距。激发激光用于将荧光分子激发到高能激发态，另一个偏置激光用于耗尽激发态而不产生荧光。光学结构产生一个区域，其中分子可以被激发，但不会发出荧光（B）。这是允许STED等技术的基本原则⁶⁹，基态耗尽（GSD）⁸²饱和模式激发和饱和结构照明显微镜（SPEM/SSIM）⁸³和可逆饱和光学线性荧光转换（RESOLFT）显微镜，以在纳米尺度上成像和定位分子。尽管这项技术正在迅速发展，但通用应用仍然受到一些实际限制。对于这些方法中的许多，光学元件的组装相对复杂或购买成本较高，目前可用的荧光灯数量有限，有待开发具有不同光谱特性、生物物理特性和兼容性的新变体作为蛋白质融合物。

随机荧光开关纳米成像。通过在用高速数码相机成像的同时对样品进行广泛照明，可以连续成像稀疏且随机光激活的单个荧光分子。通过记录单个开关状态并结合质心分析，可以在空间中区分这些分子发射的光子⁸⁴这种方法允许人们从不同的坐标记录许多不同分子的位置，因为每个光激活分子在相机（C）上呈现不同的、可分辨的点。这就是PALM技术背后的原理⁷⁰，FPALM⁷¹，风暴⁷²、GSDIM⁸⁵和油漆⁸⁶.3D-STORM现在允许分辨率接近衍射极限的10倍（20–30 nm）^87,88，而使用干涉光激活定位显微镜（iPALM）可以获得更高的分辨率（亚20 nm）⁸⁹通过随机荧光团开关进行超分辨率成像的一个明显优点是其相对简单，并且每个分子都不会像使用RESOLFT那样被迫经历许多光开关循环，而光漂白是一个重要问题。一个主要缺点是捕获单分子光子发射的随机事件需要较长的捕获时间。然而，将这些新形式的超分辨率成像技术结合在一起，可以对细胞进行以前不可能的视觉探测。

进一步扩大超分辨率光学显微镜的储备，开发了几种新形式的单分子成像。通过将多个发射光子的荧光信号拟合为二维高斯函数，可以以纳米精度确定单个荧光物体的位置。由于光激活分子的数量可以由激活光的强度和持续时间控制，因此光转换蛋白的表达允许在密集的总群体中检测单个荧光分子。在这种方法中，称为光活化定位显微镜（PALM）⁷⁰，荧光光激活定位显微镜（FPALM）⁷¹或随机光学重建显微镜（STORM）⁷²每个分子的质心是在连续几轮随机激活和激发中计算出来的。最终，通过构建顺序激活分子的空间地图来实现超分辨率(方框2). 总之，这些方法开辟了一个实验可能性的新领域，现在允许光学显微镜定义纳米级的细胞结构。

神经科学通过在纳米尺度上成像分子解剖可以获得什么？突触的组成和功能决定了许多关键的神经元和电路特性。单分子分析对神经科学来说并不陌生；从单通道记录中获得的丰富的生物物理信息深刻影响了神经科学和可兴奋组织的研究⁷³与单通道记录一样，纳米成像可以将突触和电路功能的标准测量从宏观群体测量转移到单个神经元精确位置的随机概率测量。通过揭示突触中存在的分子的生物物理特性，我们可以开始为不同类型的神经元连接指定离散的身份或“状态”，从而更准确地确定它们对电路功能的贡献。换句话说，将分子标识符标记到给定的突触上，最终可能有助于预测定义神经回路的连接的功能性质。目前，突触状态的分子标签在很大程度上仍是科幻小说，但新兴技术正在为未来定义和探测突触电路的工具奠定基础。

功能电路分析的未来

“连接体”被定义为生物体神经系统内全套神经元和突触连接的详细地图¹.可用连接体的当前状态是什么，以及它们最终将如何实现^74,75? 在模型系统中组装解剖电路图方面取得了显著进展，包括完成⁴到正在进行¹。此信息将揭示什么？

尽管有线虫的蓝图秀丽线虫20多年来，这张地图更多地是蠕虫神经系统的详细图谱，而不是驱动行为的电路中的信息流图。然而，有争议的是，这一参考对于描述特定神经元及其突触的特征以及作为目标转基因操作的指南是不可或缺的。实现任何给定电路图的全部潜力的一个缺失环节是关于功能连通性的信息。现有的数据集并没有揭示电路的功能信号特性，也没有揭示突触可塑性等动态过程。也许最重要的是，当前的模型是连接数据仅用作快照，我们需要了解神经电路的变化性质，尤其是在更复杂和更具可塑性的神经系统中。

怀疑论一直追随着类似的大规模信息类项目，包括人类基因组测序、高通量结晶学和通过可搜索的蛋白质“相互作用体”绘制蛋白质相互作用图。到目前为止，这些大规模的（经常衍生为缺乏想象力的）方法把我们带到了哪里？虽然结构基因组学和相互作用体还处于初级阶段，但大规模基因组测序显然取得了成功⁷⁴.

在缺乏模型生物的情况下，正在寻求建立功能性脑回路模型的替代方法。例如，蓝色大脑项目的目标之一(http://bluebrain.epfl.ch/page17871.html)是通过组装已知的细胞、分子和计算信息来重建电路的解剖和信号特性，以生成详细的大脑模型，从而了解大脑功能生物信息学动物实验最终会被计算和计算机辅助建模所取代吗？如何验证这些模型？哪些神经回路应该被充分阐明？虽然单独理解神经电路的功能还不够，但完整的神经元接线图一定会提供一个重要的参考框架。

未来的神经解剖学实验和功能电路分析必将依赖于遗传学、高分辨率成像、电路追踪和电生理学的综合方法。作为组装解剖和功能电路信息的单个实验，这些技术将越来越多地交叉。例如，Brainbow技术允许使用Cre/LoxP重组系统的多通道随机着色方案来标记大脑中的神经元(图2)⁷⁶这种方法的一个缺点是它不能揭示不同颜色神经元之间的功能性突触联系。实现这一点的一种方法是将不同的突触标记方法结合到有条件的类似脑波的工程组织中。代替使用标准FP进行随机条件表达，替代报道者可能包括具有不同光谱特性的突触靶向FP。

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图2

使用Brainbow系统的条件解剖学

Brainbow小鼠可通过条件激活荧光报告物来鉴定神经元亚群⁷⁶Cre介导的loxP序列之间的重组具有方向依赖性。如果loxP位点位于相同的5′-3′方向，重组会导致侧翼DNA序列被切除。当loxP位点位于相反方向时，重组驱动侧翼DNA的反转。A） 基于包含成对突变loxP位点和多个荧光蛋白的转基因等位基因的Cre介导的切除策略，以生成不同颜色的细胞。黑色、灰色和白色箭头代表不同的loxP序列突变。重组只发生在突变对之间，根据相似对之间的随机重组事件，导致细胞具有不同的色码。标记为1-4的事件对应于右侧显示的FP表达模式。B） 基于等位基因的Cre介导的反转策略，该等位基因在两个方向上都含有多个相同类型的loxP位点。反转对之间的随机复合事件导致不同的颜色可能性（1–4，结果颜色代码在右侧）。底部，细胞可以表达不同Brainbow等位基因和重组事件的颜色谱。C–E）Cre介导重组后的脑波组织图像，随机标记不同类型的神经元。图像最初发布于Nat Rev神经科学，2008年9月9日，作者：J.W.Lichtman、J.Livet和J.R.Sanes。C） 支配耳朵的运动神经的纤维。D） 轴突束穿过脑干。E） 海马齿状回的细胞。

最终，能够可视化功能连接将特别有价值。通过将小鼠的条件遗传学与最近描述的跨突触体病毒标记方法相结合，可以实现特定回路的基因切割。这可能包括FP光谱变异体的跨突触动员、光遗传学报告、基因编码钙⁺²传感器，甚至Cre在突触间隙重组。通过以跨突触方式通过电路动员Cre，可以基于解剖学而非基因表达在突触伙伴之间实现条件突变。这类技术将允许细胞和电路依赖性基因敲除，激活floxed基因编码的神经元激活物，并触发floxed荧光报告物，如Brainbow系统(方框3).

方框3研究神经系统的组合电路遗传学

利用病毒技术对神经回路进行跨动力学追踪，可以对连接的细胞进行基因组修饰。病毒工程的进展现在允许病毒表达载体的基因靶向精确的神经元亚群；人们可以设想使用类似于Wickersham等人描述的策略来修改相互连接神经元的基因组²⁷.A）说明表达Cre的RV载体对含有条件等位基因的小鼠特定神经元进行跨突触突变的基因靶向的方案。原发性RV感染的细胞将被重组，那些突触前细胞也将被重组为最初感染的神经元。电路中的所有其他神经元将保持不变。如中所示图1，绿色加号表示单突触病毒转移；由于缺乏野生型G蛋白，红十字代表一个缺乏病毒转移的多突触位点。B–C）跨突触突变可能与各种条件等位基因一起使用。这些可能包括依赖于Cre的条件功能丧失（B）或功能丧失报告（C）。通道视紫红质-2；PA-FP，光活化荧光蛋白。

视角

通过创造性的FP表达策略、条件遗传学、跨突触追踪、体积EM和定义突触的分子状态，神经系统的功能解剖正在被更全面地解剖。再加上细胞和电路水平的基因表达分析，目前的工作有望为组成神经系统关键电路的全套神经元和突触绘制一张详细的地图。一个完整的突触连接图谱将扩展我们探测复杂电路功能的能力，使我们能够对从记忆、行为到疾病的过程获得更深入的生物学见解。然而，随着静态连接图的到来，我们对不断变化的大脑的理解保持不变是至关重要的。

并非所有用于探测细胞和电路的新兴技术都有助于我们理解大脑的整体功能。可以想象，这些新技术将继续生成零散的数据，这些数据必须纳入更大的框架中，以便在概念上取得重大进展。但这个更大的框架是什么？未来的挑战将是从描述性观察转向提供复杂大脑功能预测模型的解释性理论。似乎有理由相信，这种预测模型将出现在微电路的中尺度。当然，对局部微电路的分子和结构组成部分的充分了解是不够的，必须结合远程交互作用和输入。显然，大脑处理依赖于这两者，尽管迄今为止技术的局限性迫使人们集中精力于空间上最接近的连通性。也许未来会将细胞和电路技术与更大规模的成像技术（如fMRI）相结合，将微体系结构的知识与宏电路功能相结合。最终，需要将这些方法结合起来，以提高我们对大脑的认识。最终确定哺乳动物大脑的精确蓝图仍是未来一个雄心勃勃的目标，但进化中的遗传和成像技术为制定预测模型和验证现有理论提供了基础，以开始这项任务。我们现在可以更清楚地看到这座山；虽然它很高，但攀登正在加快。

致谢

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