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方法分子生物学。作者手稿；PMC 2010年6月8日发布。
以最终编辑形式发布为：
方法分子生物学。2000; 126: 535–563.
数字对象标识：10.1385/1-59259-684-3:535
预防性维修识别码：项目经理2882091
NIHMSID公司：尼姆斯183851
PMID：10685434

电子显微镜在肾上腺素能受体检测中的应用

韭菜青木,萨里娜·罗德里格斯、和黑泽仁
版权和许可信息 PMC免责声明

1.简介

1.1. 肾上腺素能受体的生理功能

肾上腺素能受体（AR）属于G蛋白偶联受体的超家族，根据其与内源性儿茶酚胺（即去甲肾上腺素和肾上腺素）的结合来分类。肾上腺素能受体分为三类（α1-, α2和β-AR），每一种都进一步分为三个亚型。α1-(α1安培-, α1B年-、和α一维-AR）与G耦合q个G蛋白家族（G11，G14，G15、和G16)并激活磷脂酶C-βs，释放两个第二信使，即二酰甘油和肌醇，4,5-三磷酸。α的三种亚型2AR被指定为α2安培-, α2B型-、和α2摄氏度cAR公司。与激动剂结合，α2-AR抑制腺苷酸环化酶和钙通道，但通过与G偶联激活钾通道我G蛋白家族i1号机组，Gi2类，Gi3类、和G0). 最后，三组β-AR被指定为β1-, β2-、和β三-AR：通过激活G增加细胞内cAMP含量秒与腺苷酸环化酶偶联(1).

肾上腺素能受体在体外和体内的功能主要通过给药亚型选择性激动剂或拮抗剂进行分析(2). 然而，尽管有三种主要肾上腺素能受体类型的特异性配体，并且已经获得了许多有用的信息，但目前可用的大多数配体没有表现出足够的特异性来区分亚型（例如α2-AR）。因此，鉴定亚型功能的另一种方法是敲除特定受体亚型的基因编码。这种方法也并不总是成功的，可能是因为儿茶酚胺能受体的其他亚型可以补偿敲除。这就是为什么我们对儿茶酚胺能受体亚型的许多了解都来源于免疫细胞化学的原因之一。特别是对于大脑研究，免疫细胞化学方法是有用的。这是因为大脑功能严重依赖于神经元之间形成的连接。因此，脑内儿茶酚胺的作用可能因神经递质的作用部位和神经递质释放附近的受体亚型而异。儿茶酚胺的作用部位可能因区域（例如，视觉、听觉和多模态路径）、区域内的细胞类型（例如，使用兴奋性递质进行远距离投射的神经元与使用抑制性递质用于局部回路或非神经元细胞（例如星形胶质细胞）的神经元）而异，通过亚细胞隔室（树突轴，主要接收来自其他神经元的抑制性输入，树突棘，主要接收兴奋性输入，或轴突，通过释放神经递质传播和传递到其他神经元的输出）。例如，我们的研究使用了一种能够选择性识别αA亚型的抗血清2-AR显示这些发生在突触前(图.1A、B)其中一些被阳性鉴定为去甲肾上腺素能轴突终末(三). 这一结果是意料之中的，因为早期的生理学研究表明α2-AR作为自身受体发挥作用，抑制去甲肾上腺素或肾上腺素的释放(4). 然而，我们也观察到这些受体出现在非儿茶酚胺能性轴突终末，这表明这些受体也可能作为异受体作用，调节除去甲肾上腺素和肾上腺素以外的递质的释放。此外，在大脑皮层的突触后观察到这种受体(5,6;图1)和海马体(7)尽管电生理研究表明α缺乏2-AR在这些前脑结构中介导的突触后效应(8). 这些结果的差异表明α2-这些结构中的AR与脑干中的AR不同，可能激活细胞内的第二信使级联，而不激活钾通道。

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从猴前额叶皮层获得的EM使用α免疫标记2安培-AR抗血清和HRP-DAB作为免疫标记物。(A类)受体直接出现在标记终端（LT中的小箭头）的突触前质膜上，与树突轴发出的脊椎形成突触连接（开放箭头）（箭头和D；sa=脊椎装置）。(B类)受体也位于末端T的突触区以外，而位于静脉曲张间的部分（大箭头和两个小箭头之间）。箭头指向一片正在进行内吞作用的质膜。(C类)突触末端T，与两个树突同时形成突触连接，其中一个树突在突触后膜（LD，箭头）上显示免疫反应，另一个树突起未标记（UD）。用丙烯醛和多聚甲醛的混合物经心灌注固定组织，然后用四氧化锇在ICC程序后固定。所有面板的校准棒=500 nm（从裁判。 6经牛津大学出版社许可复制）。

类似地，一系列针对β-AR不同结构域的抗血清研究显示，受体在发育状态和完整大脑皮层组织内的细胞类型之间的构象存在有趣的差异。第一个可用于超微结构研究的多克隆抗血清是由Joh用Strader及其同事从青蛙红细胞膜中提取的抗原制备的(9). 这种抗血清对神经元的各个部分进行了免疫标记，包括胞体周围和轴突，但主要是远端树突。使用此抗血清对星形细胞过程进行免疫标记(9,10). 与此结果形成鲜明对比的是，针对细胞内第三环区域的多克隆抗血清和单克隆抗体（MAbs）主要对神经元的核周区域进行了免疫标记(11)，尽管远端树突、脊椎(11)和轴突，包括轴突的突触前部分(12)，也呈免疫反应。最后，另一种针对β-AR的C末端的多克隆抗血清主要识别成年期的星形细胞过程(13-16;图2)而且还免疫标记了新生儿皮层内最早形成的突触(17;图3). 这些免疫标记模式中的每一种都被证实是特异性的，因为在第一抗体的预吸附后，抗原性被消除了(看见 注释1和2). 进一步研究β-AR与已知与其相互作用的分子的关系，如β-arrestin、β-AR激酶和G秒蛋白质在生理特定条件下有望提供详细的知识，以了解肾上腺素和去甲肾上腺素对细胞生理的动态调节。

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从连续收集的组织超薄切片中获得的EM经儿茶酚胺能末端（CT）标记物、酪氨酸羟化酶和β-AR的C末端双重免疫标记后，通过HRP-DAB标记进行鉴定。β-AR发生在围绕神经突的精细星形细胞突起（β-A）中，包括一个儿茶酚胺能终末（CT）和三个未标记终末（uT1、uT2和uT3）。uT2和uT3与树突棘形成不对称的突触连接（开放箭头指向突触后密度较厚），表明它们利用谷氨酸进行兴奋性突触传递。这种β-A插入CT和兴奋性突触之间的安排支持了激活的β-A通过减少星形胶质细胞摄取我-谷氨酸。面板中的箭头对A类指向两个β-As之间形成的间隙连接。校准棒=500 nm。（来自裁判。 13经神经科学学会许可复制）。

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从出生后第10天大鼠视皮层获得的EMs，使用HRP-DAB标记和针对受体C末端的抗血清显示β-AR免疫反应。(A类)树突轴从未标记的轴突终末（T）接收两个突触输入，其中一个在突触后密度上进行免疫标记（弯曲箭头），另一个未标记（开放箭头指向突触后浓度）。箭头指向未标记的光滑球囊，表明伴随成熟过程的细胞膜翻转强劲。另一个侧面，沿着质膜显示出免疫反应性：从其不规则轮廓（星号）判断，很可能是胶质突起（LG）。(B类)突触前终末（LT）中相同的抗血清β-AR，通过小的透明小泡的聚集进行鉴定（弯曲箭头）。同一终末包含一个致密的囊泡（箭头）。（答：，C类)突触后部位的β-AR免疫反应不仅发生在突触后密度上，而且发生在相邻的细胞膜和质膜上（小箭头）。校准棒=500 nm（从裁判。 17经剑桥大学出版社许可复制）。

免疫细胞化学也有助于研究单个细胞内共表达的不同受体亚型的亚细胞分隔。例如，脂肪细胞和心脏细胞表达β我-和β三-β-ARs的AR亚型。然而，有趣的是，这种共表达不允许功能补偿，即使这两种亚型都与G结合秒和腺苷酸环化酶(18,19). 由于信号分子和第二信使不可能在细胞内自由扩散，因此每个细胞内受体的差异定位（即分隔）可能会影响反应。在另一个例子中，Jurevicus和Fischmeister(20)报告了β1-AR-介导的cAMP积累对通过心脏L型钙通道增加钙电流很重要，表明β1-AR，但不是β三-AR与效应分子密切相关。在另一个例子中，据报道α2摄氏度-和α1安培-AR主要定位于细胞内(21,22). 这种分隔可以促进从受体到细胞反应的有效信号转导，避免不利反应。在像神经元和神经胶质这样极化的细胞中，关于受体定位的精确知识变得越来越重要，因为第二信使的扩散变得局限于单个树突棘、树突轴或轴突曲张。

受体、G蛋白和效应分子正确定位的细胞机制尚不清楚。显然，要想阐明这种细胞机制，就需要对受体和相关元素的亚细胞定位有准确的了解，为此需要识别受体的特定抗体。

1.2. 儿茶酚胺能受体检测方法综述

通过在生理上“无关”的细胞系中表达受体，也了解了许多有关信号转导机制的知识，即那些来源于细胞类型的细胞系，当在完整组织中时，没有特定的受体。然而，与内源性表达受体（通常为10-200 fmol/mg蛋白）相比，外源性转染受体的表达水平往往较高（高于pmol/mg蛋白）。尽管这种差异对测量信号有好处，但在检查天然和完整细胞中受体的行为时仍需谨慎，其中受体介导的效应的微调可能严重依赖于受体相对于其他调节和竞争的生物化学途径的确切位置。

能够识别翻译后修饰受体的抗体有望成为分析翻译后修饰的生理条件和后果的有力工具。翻译后修饰的类型包括与受体脱敏相关的特定细胞内结构域的磷酸化、细胞外结构域的糖基化以及细胞内转运过程中棕榈酰和肉豆蔻酰基团的添加。

电子显微镜免疫细胞化学（EM-ICC）对于确定特定受体、受体亚单位、神经递质或第二信使生成相关酶的精细过程中的存在和共存非常有用。精细细胞器的可视化对于区分星形细胞、轴突或棘状的精细突起尤其有用，其中许多突起的直径通常小于一微米。最重要的是，电子显微镜（EM）对于识别突触连接的形态特征至关重要。相反，EM有助于识别儿茶酚胺能受体在缺乏突触连接形态学特征的部位的存在，从而有力支持儿茶酚酚胺能神经调节可以通过体积传递发生的观点，除了更传统的传递方式外，轴突末端释放的传送器仍位于连接间隙内(23). 因此，EM-ICC选择的方法旨在优化组织保存，同时避免过度组织保存导致的抗原性损失。

1.3. 本章描述的EM-ICC技术概述

在本章中，我们将描述用于可视化EM-ICC抗体-抗原复合物的各种技术，以及它们的优点和局限性。这一讨论将限于免疫标记完整脑组织，作者对此有直接经验，并取得了有益的结果。生产多克隆抗血清遇到的问题以及这些问题的可能解决方案也包括在下面副标题4。(看见 注释1-7).

2.材料

此处列出的来源已被作者使用，并显示出可产生有用的数据。另一方面，其他来源也可能提供足够纯度或特异性的试剂。

2.1. 组织来源

脑组织可以从各种动物身上获得。在我们手中，从两栖动物（例如青蛙）到非人类灵长类的脊椎动物在使用多克隆抗血清时获得了有用的数据。通过快速经心灌注固定剂来保存组织时，有助于进行超微结构分析，详情如下副标题3。

2.2. 固定剂

用于EM的所有固定剂都是挥发性的，并且与组织高度反应。因此，这些材料，尤其是溶液必须在良好的工作罩下处理。使用后可能还需要收集一些固定剂。应与当地管理人员核实危险废物处理情况。

使用了以下来源，并对超微结构进行了良好保存：

  1. 多聚甲醛（粒状）和戊二醛，均为EM级，来自电子显微镜科学公司（宾夕法尼亚州华盛顿港），丙烯醛，来自Polysciences（宾夕法尼亚州沃林顿）或EM公司（马萨诸塞州栗子山）。
  2. 与戊二醛相比，丙烯醛的保质期更为有限，并且极易挥发。出于这个原因，应该计划将小瓶存放在防爆冰箱中（如果玻璃瓶破裂，这有助于控制气体泄漏）。由于交付过程中需要特殊处理，Polysciences对这种化学品收取交付费和“中毒费”。这些固定剂可以通过心脏输送，使用0.1M（M）磷酸盐缓冲液，pH 7.4，作为溶剂。

2.3. EM试剂

重金属、四氧化锇和Lowicryl可从EM Sciences（宾夕法尼亚州华盛顿堡）、EM Corp.或Ted Pella（加利福尼亚州雷丁）购买。

  1. 用于EM的重金属，如四氧化锇、乙酸铀酰和柠檬酸铅，都是生物危害物质。应戴手套进行处理，并按照处理危险废物的当地管理员的指示进行处理。
  2. 四氧化二锇也是挥发性的，因此只能在发动机罩下操作。
  3. 嵌入树脂可能会引起过敏：也应使用手套进行处理。Lowicryl是一种用于包埋后免疫细胞化学的包埋树脂，必须使用非乳胶手套（建议使用乙烯基）进行处理。
  4. 乙醇，200证据，来自Quantum Chemicals（伊利诺伊州塔斯科拉）。
  5. Allied Signal Plastics（宾夕法尼亚州波茨维尔）生产的Aclar板材。
  6. 帕拉-来自西格玛（密苏里州圣路易斯）的苯二胺。
  7. Pfaltz和Bauer（Saterbury，CT）生产的四溴化铱，用量为0.5%，使用前一天在马来酸盐缓冲液（MB）中搅拌。
  8. 1%的单宁酸在使用前立即溶解，单位为MB。
  9. 乙酸铀酰的浓度为1%，在MB中溶解过夜用于无锇组织处理，或在70%乙醇中溶解4%用于含锇组织。

2.4. 玻璃器皿和塑料器皿

  1. 瓷坩埚（容量为13-、18-、24-和40-mL）。
  2. 玻璃斑点盘子。
  3. 0.22微米微孔注射器“Acrodisc”由尼龙或塔夫林制成，可从Gelman Sciences或Fisher Scientific获得。
  4. 蜂胶胶囊可从EM Scientific获得，用于包埋振动体切片和免疫标记切片。

2.5. 二级抗体（抗兔lgG或抗鼠lgG）

  1. 与胶体金结合的抗体，来自Amersham（伊利诺伊州阿灵顿）或Goldmark Biologicals（新泽西州菲利普斯堡），大小从1 nm到30 nm不等：这些抗体分为两个等级，一个用于组织学，另一个用于Western blots。我们尝试只使用组织学等级的品种。
  2. 来自Vector Labs（加利福尼亚州伯林盖姆）或Jackson ImmunoResearch（宾夕法尼亚州西格罗夫）的生物素化抗体。
  3. 来自Jackson ImmunoResearch的未标记二级抗体（抗兔IgG、抗鼠IgG）。这些可在有或没有亲和纯化的情况下获得。前者需要在更高浓度下使用，但预计会产生更大的特异性。也可以从Vector Labs购买质量上乘的生物素标记二级抗体。

2.6. 股票解决方案

  1. 0.2M（M）磷酸盐缓冲液（PB），pH 7.4。
  2. 25%戊二醛，安瓿包装（EM Scientific）。
  3. 100%丙烯醛，包装在橡胶瓶中（Polysciences）。
  4. 4%四氧化二锇，装在安瓿中（EM Scientific）。

2.7. 缓冲器及其用途

  1. 0.1M（M）PB，pH 7.4：等渗，强缓冲液。
  2. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01M（M）PB，0.9%NaCl，pH 7.4：最广泛用于脑切片冲洗和短期存储的缓冲液(看见 分标题3.3。).
  3. PBS牛血清白蛋白（BSA）：PBS，1%BSA（来自Sigma）：用于最小化非特异性免疫标记的缓冲液(看见 副标题3.3。).
  4. PBS叠氮化：PBS，0.05%叠氮化钠：用于冷藏室长期保存切片的有用缓冲液(看见 副标题3.1.7。).
  5. 0.1M（M）柠檬酸缓冲液，pH 6.5（5.4 g三钠盐，使用柠檬酸的一水盐将pH调节至6.5）。这种缓冲液与免疫金标签的银强化相兼容(看见 副标题3.4。).
  6. TBST:0.05M（M）Tris缓冲盐水，0.1%Triton X-lOO：该缓冲液用于植入后免疫金标记(看见 副标题3.5。).
  7. 0.1M（M）MB，pH 6.0：该缓冲液用于处理EM段，无需使用四氧化锇(看见 副标题3.6。).

2.8. 其他解决方案

  1. 肝素，抗凝，来自Elkins Sinn（新泽西州Cherry Hill）：用于经心灌注(看见 副标题3.1.3.，步骤4).
  2. 防冻剂：0.05M（M）PB，25%蔗糖，10%甘油。用于组织的冻融渗透，以增强免疫标记(看见 副标题3.1.6.，步骤3).
  3. 银增感试剂，用于放大用于免疫标记的l-nm胶体金颗粒：可从Amersham购买一种光敏品种(看见 副标题3.4。).
  4. 溶解于盐水中的50%二乙基二硫代氨基甲酸钠：一种锌螯合剂，可最大限度地减少与胶体金颗粒银强化相关的背景(看见 副标题3.4。).

3.方法

3.1. 组织制备和储存

3. 1. 1.组织固定方法的选择：经心灌注与浸泡

为了最佳保存细胞形态和细胞内分子分布，需要使用固定剂进行心内灌注。然而，有时需要分析未经心内灌注的组织的超微结构。其中一个例子是需要分析活检样本或组织块的超微结构。甚至是大脑。用固定剂经心灌注的患者可能需要用浸入式支架进行固定，以进一步改善结构。在这种情况下，可以通过浸泡固定组织。由于固定剂通过组织的渗透是一个缓慢的过程，相对于缺氧引起的超微结构恶化的速度，浸入固定必然会导致超微结构分析的次优条件，特别是在从组织表面移除的部分组织内。另一方面，这种组织的大多数表面部分可能是可用的，因为固定剂到达这些部分的时间最短。不建议使用固定前经过冷冻的组织：这种组织在结冰过程中由于水的膨胀而导致膜严重破坏。即使在固定后冷冻，在冻融过程中也不能完全避免质膜的破坏。受损质膜的问题是，通过EM识别单个细胞过程的边界变得困难。这种限制反过来又阻止了抗原亚细胞分布的分析。

3. 1.2. 固定剂的选择

多聚甲醛（最广泛用于光学显微镜）和丙酮（更多用于培养细胞）不足以保存超微结构，因为这些固定剂不能充分保存细胞内细胞器或质膜的膜以供分析。最广泛使用的EM固定剂是戊二醛。这种醛已被电子显微镜使用，浓度从0.05到5%不等。尽管随着戊二醛浓度的增加，超微结构的保存得到了改善，但浓度>0.1%的戊二醛导致儿茶酚胺能受体的免疫反应性显著降低（未发表的观察结果）。另一方面，组织短暂（<7分钟）暴露于另一种高度反应的小醛，即丙烯醛(24)浓度在3.0到3.75%之间时，可以很好地保存儿茶酚胺能受体的超微结构和抗原性(三,5-7,10-17,图。​图11–三). 因此，本章作者和其他使用针对儿茶酚胺能受体抗血清的人经常使用以下固定剂组合：0.05或0.1%戊二醛与4%多聚甲醛或3-3.75%丙烯醛与2-4%多聚醛组合。

3.1.3. EM经心灌注的详细描述

经心灌注固定剂是成功保存组织超微结构的最关键步骤之一。经心灌注的目的是在缺氧引起组织形态（可能是化学）改变之前实现超微结构的保存。为了尽量减少组织的人为改变，可以通过在经心灌注期间维持人工通气来减少缺氧。成功的另一个关键是速度，也就是说，从缺氧开始（从隔膜切开进入心脏的那一刻开始）到组织固定（也就是说必须先采取步骤，使固定剂从血管腔扩散到周围的神经膜），这段时间要尽可能缩短。速度由许多因素决定。这些包括固定剂的扩散速度、通过解剖进入心脏的效率以及固定剂通过心血管系统的流速。为了使固定剂在组织内的扩散速度最大化，我们建议使用小的、高活性的醛类，例如丙烯醛。关于快速进入心脏，只需练习解剖程序即可获得专业知识。固定剂的流速最好用蠕动泵控制。这确保了该比率保持在较高水平，但不会过高而导致血管破裂。对于大多数哺乳动物的成人大脑，建议将流速设置为70 mL/min。为了避免凝血和醛固定的血细胞堵塞血管，在灌注固定剂之前，应使用肝素化生理盐水（100–1000 U/mL肝素，加入0.9%氯化钠）冲洗心血管。然而，这种盐水冲洗应保持在最低限度，以尽量减少固定剂灌注的延迟。

为了制备组织以进行儿茶酚胺受体的免疫细胞化学检测，我们和其他人发现以下醛类适合保留抗原性和超微结构：3%丙烯醛和4%多聚甲醛的混合物，用0.1缓冲M（M）磷酸盐缓冲液（pH 7.4），灌注3-7分钟，然后在不含丙烯醛的磷酸盐缓冲液中灌注4%多聚甲醛(三,5–7,10–17). 或者，在30分钟内灌注0.1%戊二醛和4%多聚甲醛的混合物是有用的(10).

具体而言，建议采用以下步骤进行经心灌注：

  1. 对动物进行深度麻醉（对于需要SIG作为免疫标记物的实验，在注射前15分钟注射二乙基二硫代氨基甲酸酯[1 g/kg，ip]第二步： 看见 副标题3.4。更多详细信息）。
  2. 打开胸腔。记录隔膜被切割的时间。
  3. 使用连接至蠕动泵管的金属套管进入左心室。将金属套管尖端插入升主动脉。
  4. 使用肝素盐水开始灌注。
  5. 继续灌注醛混合物。

3.1.4. 用于预埋与后埋EM-ICC的组织切片

到目前为止，EM-ICC检测抗原最有利的切片程序是使用振动器。这一过程避免了组织的冻融，而冻融又会因大冰晶的形成而导致形态损伤。可控震源可以很容易地从适度固定的大脑中产生30μm的薄片。固定越牢固，切片越薄。相反，固定较弱的组织，如出生后早期组织或固定剂浓度低或体积小的组织（如2%多聚甲醛），需要以更大的厚度切片，例如出生后d3大鼠脑切片的厚度为100μm，振幅更大，叶片冲程较慢。

组织切片的替代选择包括使用冷冻切片机或低温恒温器。然而，这些替代品不太理想，因为即使采取了预防措施来冷冻保护组织，冻融步骤也会不可避免地造成组织损伤。当必须在冷冻状态下切片时，必须采取一切预防措施，避免形成大冰晶，损坏膜：最好将尽可能小的冰块浸入冷冻保护剂中，例如蔗糖（25%）和甘油（10%）的混合物，用0.05缓冲M（M）磷酸盐缓冲液，然后使用氟利昂或异丁醇快速冷冻，使用液氮冷却至低于−70°C的温度。有关冷冻超微切片的更多详细信息，请参阅德川昭等人、Liou等人和Sitte的手稿(25,26)因为对这种技术的讨论超出了本章的范围。

3.1.5. 固定的终止

为了获得特异性免疫标记，需要控制固定的终止和开始。使用高活性醛（如戊二醛和丙烯醛）固定的组织，即使在组织切片并通过冲洗去除所有多余的醛后，仍会继续与蛋白质的初级胺基形成共价键。为了终止醛的交联作用，需要用还原剂（如硼氢化钠）处理部分(27)通过将醛基团转化为醇基团或处理过量的伯胺基团，使醛基团不起反应。厚度约为40μm的丙烯醛和戊二醛固定部分需要在1%硼氢化钠溶液中浸泡30分钟，用0.1缓冲M（M）磷酸盐缓冲液。此溶液必须在使用前立即配制。30分钟孵育期后，应在0.1分钟内冲洗切片M（M）磷酸盐缓冲液，直到气泡停止出现。

3.1.6. 组织渗透

组织通透性是为了增加免疫物质，特别是抗体进入组织的渗透性而采取的一个步骤。对于细胞器内嵌入的抗原位点，如小泡内的抗原位点来说，这一步似乎是必不可少的。对于可溶性抗原，如胞质溶胶中的抗原，以及膜蛋白的细胞内结构域，包括肾上腺素能受体，可将透化保持在最低限度。对于EM-ICC，涉及从质膜中提取脂质的渗透方法，例如在非离子洗涤剂（例如Triton X-lOO）中培养，会干扰超微结构分析。因此，应避免使用洗涤剂处理。在需要组织渗透的情况下，与EM兼容的方法包括以下三种：

  1. 将低浓度的Triton X-100（<0.06%）或Photo-flo（0.1–0.3%）添加到初级抗体溶液中（参考中所示的EM裁判。 28查看膜损坏的程度）。
  2. 在初级抗体溶液中孵育之前，在含有低浓度Triton X-100（0.1%或更低）的缓冲液中短暂孵育切片（<30分钟）(29).
  3. 低温保护后快速冷冻-解冻。这是超微结构分析的最佳方法，因为可将膜的破坏降至最低。这种治疗有很多方法。一种有效的方法是将切片在25%蔗糖和10%甘油的0.05溶液中培养至少1小时以进行低温保护M（M）磷酸盐缓冲液并使用液态氟利昂进行快速冷冻，然后使用液氮(30). 通过在这些切片上浇上温热的冷冻保护剂来解冻这些切片。另一种冷冻保护剂是二甲基亚砜（DMSO）(31). 其渗透可以通过在培养段中增加DMSO浓度（每种浓度为5、10、20%，10分钟）来实现，每个培养段缓冲0.1M（M）磷酸盐缓冲液。在冻结和解冻过程中，通过将其平放在尼龙网上，可以最大限度地减少截面开裂。

3. 1. 7.分段存放

切片可以在4-6°C下保存数月，超微结构细节或抗原性损失最小。建议使用PBS-叠氮化物作为存储缓冲液。

3.2. EM-ICC标签的选择

3.2.1. 马萝卜过氧化物酶-3,3′-二氨基联苯胺（HRP-DAB）

突触分子最容易用酶放大法检测，即亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物，以DAB为底物（HRP-DAB）。我们以前使用这种标记的经验表明，如果使用得当（即过氧化物酶反应时间最短），HRP-DAB可以提供精确的抗原亚细胞定位，以区分树突的标记部分和未标记部分(看见 图。 ​1摄氏度1摄氏度和​和3A）：3A级)：用于。例如，我们(三,5,6,10–17)和其他(7,32)用这个标签来区分免疫标记的突触膜和相邻的未标记突触膜。

使用HRP-DAB的优点是，该标签与传统树脂兼容，并对膜（如四氧化锇）具有较强的固定作用。这些试剂能够很好地保存组织，这一因素对于识别各种类型的突触是有用的，尽管不是绝对必要的，例如发育中组织内的新生突触和对称突触连接。我们注意到，通过儿茶酚胺能受体的存在识别的儿茶酚酚胺能突触连接与谷氨酸能突触不同，因为前者通常缺乏突触的常规形态特征。如果所分析的标本因超微结构保存不理想而困难重重，例如失去（而非缺乏）突触的常规形态特征，则无法得出这一结论。

HRP-DAB与预包埋银增敏金免疫标记兼容(图2（详见下文），从而允许在单个精细过程中识别两种抗原。此外，HRP-DAB允许在EM处理之前进行光学显微镜检查，从而可以通过比较预期（以前报告的）免疫反应在细胞类型和大脑区域的分布模式来评估免疫标记的特异性。

然而，HRP-DAB标记并非没有限制。尽管此方法提供的酶扩增允许出色地检测抗原，但HRP-DAB标签的扩散排除了将抗原位点识别为膜性与细胞溶质，也不可能进行定量测量，例如单个免疫标记图谱中的抗原浓度。对于需要这种分辨率和量化水平的问题，建议分别使用埋置前和埋置后黄金方法(参见下文). 此外，当HRP-DAB标签变弱时，很难与传统的反染柠檬酸铅区分开来。因此，人们可能希望省略柠檬酸铅复染，以优化HRP-DAB标签的检测。

3.2.2. 含银预埋胶体金（SIG）

另一种标记受体的方法是SIG法(看见 附注8). 通过使用小尺寸的共轭胶体金优化二级抗体的渗透性。商用单纳米胶体金颗粒。根据我们的经验，这种最小尺寸的胶体金对于检测精细过程中的抗原是必要的，例如树突棘和轴突。由于1nm低于电子显微镜的分辨率极限，这些胶体金颗粒需要进行银增浓处理，以用于EM和免疫标记物的光学显微镜检测。为了检测较大轮廓的抗原，如细胞体和树突，可以使用较大尺寸的胶体金，如5纳米和10纳米的胶体金，而无需对EM进行银强化。然而，这些较大尺寸的胶体金仍需要对光学显微镜进行银强化。

这些胶体金标记物将提供比HRP-DAB更大的亚细胞定位，例如膜定位与胞质定位，因为标记物是不可扩散的(图4). 与HRP-DAB一样，SIG免疫标记的切片可以通过光和电镜检查，从而可以根据细胞和区域分布模式评估特异性免疫标记。此外，SIG标签与膜的锇固定相兼容，因此可以与HRP-DAB结合（需要锇处理才能使DAB反应产物电子致密）。

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EMs揭示了SIG对成人视皮层星形胶质细胞和神经元中β-AR的差异定位及其与GABA免疫活性的关系(A类)成年大鼠视皮层5/6a层的树突显示出大量的SIG颗粒（如箭头），反映了细胞溶质（β-AR）的存在(A类)SIG颗粒靠近质膜。星号表示星形细胞的不规则轮廓。同一枝晶显示出大量的1O-nm胶体金颗粒，这是用PEG作为标记物，通过EM-ICC检测GABA得到的（例如，圆形颗粒）。接触树枝晶的终端GT显示出高密度的PEG标记，表明它是GABA能终端。(B类)高倍镜下，大鼠视皮层2/3层的神经膜显示出五个星形细胞突起（A1–A5）。A1–A4紧邻不对称突触连接（可能是兴奋性的）。A1、A3和A5主要沿着质膜表现出强烈的β-AR免疫反应性（小箭头），但A2和A4的β-AR免疫反应水平较低，且位于远离质膜的位置。请注意，A4为GABA-免疫反应。相反，树突状突起在远离质膜位置（如箭头所示（βD））对β-AR表现出强烈的免疫反应。A1接触一个未标记的末端UT，也包裹一个树突GD，根据PEG标记（圆圈）的普遍性确定为GABA能，并与UT突触相关（弯曲箭头指向突触后密度）。校准棒=500 nm。

SIG方法的缺点是标签没有酶促扩增。因此，根据达到等效免疫标记所需的抗体浓度（估计为十分之一）判断，使用SIG标签的程序不如使用HRP-DAB标签的程序敏感。其他人也注意到，免疫金标记很少直接出现在突触后密度上，即使是假定的突触分子，例如受体。相反，免疫标记往往发生在突触特化的边缘(33)可能是由于胶体金颗粒引起的空间位阻，即使在使用最小可用尺寸（1nm）的情况下也是如此。然而，预包埋SIG程序仍然是与HRP-DAB结合以及区分抗原定位到胞浆或膜上的良好标记。

3.2.3. 后埋入胶体金（PEG）

最后，PEG程序将有助于解决需要最精确定位抗原的问题，例如单个PSD内两个分子的潜在共存，或它们沿非突触质膜或细胞质的同一斑块共存。例如，已经证明β-AR调节N个-甲基-d日-天冬氨酸（NMDA）受体，表明这两种受体与单个树突共存，从而允许它们在去甲肾上腺素能和谷氨酸能纤维几乎同步去极化后相互作用(34). PEG方法结合预嵌入标签，可以很容易地确定这两个受体是否在单个精细过程中共存(图5). PEG的另一个有用应用是比较不同突触类型（例如，在锥体神经元上形成的去甲肾上腺素能突触与抑制性中间神经元上形成）的PSD之间的抗原浓度。

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成人视觉皮层神经膜的EM，显示三种抗原在一个树突内共存。通过结合SIG和免疫标记的NMDA型谷氨酸受体NR2A亚单位（圆圈）、β-AR的30 nm胶体金-PEG（小箭头）和抑制性神经递质GABA的10 nm胶体金-PEG（箭头），实现了三重EM-ICC。这一结果表明，GABA能抑制中间神经元可接受去甲肾上腺素和我-谷氨酸。树突也接受GABA，因为它与两个GABA能终末（T）形成接触，其中一个与形态学上可识别的突触有关（开放箭头指向突触后膜）。两个受体远离质膜的定位可能表明，由于在组织固定期间或之前发生的突触传递，受体处于脱敏状态。校准棒=500 nm。

通过使用两种尺寸的胶体金作为PEG标签和/或将PEG与SIG结合，成功地将两个受体亚单位定位到单个PSD和远离突触的位置(35). 这些研究表明，PEG可用于神经递质受体的精确定位。此外，在某些情况下，PEG程序可以应用于锇固定组织以与HRP-DAB结合（HRP-DAB需要锇处理以使EM的标记电子致密）（Erisir等人，未发表的观察结果）。这些研究的结果表明，通过结合SIG、HRP-DAB和一个或两个PEG标签，EM-ICC不仅可以是双重的，也可以是三重的。

如果感兴趣的分子不能耐受预先嵌入的锇固定，则需要在用单宁酸与醋酸铀酰和四溴化铱结合的方案替代膜锇固定的组织上进行PEG(35–39). 膜的保存不如四氧化锇完整，但仍有助于获得有关受体亚细胞分布的信息。通过比较可以看出这一点图。 1–三，使用四氧化锇图。 ​44和​和5，5，在不使用四氧化锇的情况下保存。

如果感兴趣的抗原不能耐受聚合传统树脂所需的热量（Epon和Epon-Spurr为60°C），则可以使用替代树脂Lowicryl，因为该树脂可以在低于−40°C的温度下聚合。近年来，使用这种树脂获得的结果揭示了谷氨酸受体精细、高度定位的分布(38,39). 由于锇会干扰Lowicryl聚合所需的紫外线照射，因此使用Lowicrill包埋的组织不能被锇固定。

简而言之，通过结合多种EM-ICC技术，人们可以最大限度地分析突触的细胞和分子细节，同时还可以弥补每种方法众所周知的缺点。

3.3. HRP-DAB作为免疫标记物的应用程序

如上所述，目前可用于EM-ICC的最灵敏方法使用DAB作为HRP的底物，而HRP又通过亲和素-生物素链（ABC）与抗体-抗原复合物相连。替代性的基于过氧化物酶的EM-ICC程序，即过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP），已被详细描述，并且也适用于肾上腺素能受体的检测(10). 然而，由于该程序不如ABC-DAB程序敏感，因此此处不作描述。

通过ABC方法开发HRP-DAB免疫标记涉及生物素化二级抗体（抗兔IgG）与生物素化HRP的连接。亲和素上的四个结合位点作为桥。具体而言，建议按照制造商（Vector Labs）的说明执行以下程序：

  1. 将切片在含有1%BSA的pH 7.4的PBS缓冲液中培养至少30分钟（阻止非特异性免疫标记）。
  2. 在室温下培养过夜（或在4°C下培养3天），放置在含有经验确定的一级抗体稀释液的封闭缓冲液中。
  3. 在PBS中以5分钟的间隔（3×5分钟）冲洗切片三次。
  4. 在含有经经验确定的生物素化抗兔IgG稀释液的封闭缓冲液中培养。Vector的生物素化二级抗体通常在1:100到1:200的稀释液中工作良好，需要30分钟的培养，而Jackson ImmunoResearch的亲和纯化生物素化的二级抗体需要大约1:50的稀释液和1小时的培养期。
  5. 准备ABC溶液（Vector’s Elite试剂盒中的两滴溶液A和两滴溶液B以及PBS作为稀释剂），并在使用前让溶液静置30分钟。
  6. 在PBS中冲洗段3×5 min。
  7. 在ABC溶液中培养30分钟。
  8. 在PBS中冲洗段3×5 min。
  9. 将切片浸入HRP基质中，其中包括11 mg DAB盐酸盐和5μl 30%H202反应时间可能从几分钟到10分钟或更长，具体取决于一级抗体孵育条件和抗体滴度。
  10. 通过光学显微镜检查切片，将其临时安装在干净的载玻片上，以确认已达到预期的染色模式。
  11. 安装光学显微镜或其他部件时，请遵循以下步骤子标题3.5。用于EM处理切片。或者，如果在PBS中保持4°C的温度，切片可以在不丢失DAB免疫标签的情况下保存至少1周
  12. 遵循以下步骤副标题3.6。用于EM的处理段。

3.4. SIG作为免疫标记物的过程

二级抗体可与不同大小的胶体金缀合。为了在精细过程（即直径<1μm）中观察免疫反应性，我们选择使用直径为1-1.4 nm的胶体金。尽管这种大小的胶体金需要银增强才能进行EM可视化，但银增强所需的额外步骤非常值得，因为这些步骤可以检测树突棘和轴突内的抗原。相反，与较大尺寸（>5nm）胶体金结合的二级抗体不需要银增强来进行EM可视化，但无法分析小轮廓，如轴突、棘或星形细胞突起。

用于银增敏胶体金标记的组织应具有内源性锌螯合物，因为锌与胶体金一起成为银增敏的，产生与银增敏胶质金颗粒无法区分的颗粒(40). 这是通过注入二乙基钠来实现的。二硫代氨基甲酸酯，ip（1 g/kg），在动物经心灌注前15分钟。

获得有用数据的方案如下，采用四氧化锇作为膜的固定剂。或者，可以在不使用四氧化锇处理的情况下对切片进行EM处理，以避免银密集型金颗粒的任何损失。EM截面无锇处理程序概述如下第3.6子目，步骤2。

  1. 遵循中描述的步骤副标题3.3。，但一级抗体稀释液的制备浓度是HRP-DAB所用浓度的4–10倍（较高浓度的抗体可补偿SIG方法相对较弱的灵敏度）。
  2. 在室温下将切片培养在1:50稀释的1 nm金共轭抗体IgG中3-4小时。稀释剂应为封闭缓冲液，由含有1%BSA的PBS组成。
  3. 在PBS中冲洗3×5分钟。
  4. 使用含有2%戊二醛的PBS对切片进行后期修复。
  5. 在PBS中冲洗3×5分钟。
  6. 在0.2中冲洗1分钟M（M）柠檬酸缓冲液（柠檬酸三钠盐调节至pH 6.5，使用柠檬酸的一水盐，使用超纯水或双蒸馏水新鲜制备）。在这一步切换缓冲区的原因是氯离子干扰了银的增密步骤。Amersham的Silver IntensEM试剂盒建议在银强化之前将各部分浸入水中。然而，浸水会导致超微结构恶化。因此，我们倾向于使用如上所述的等渗柠檬酸缓冲液。
  7. 通过将部分浸入Silver IntensEM试剂盒中3–15分钟，使胶体金颗粒呈银色致密（按照Amersham的指示，溶液A和溶液B的体积相等）。使用非金属仪器在不同的缓冲区之间转移部分，因为金属会干扰银的强化。
  8. 通过在柠檬酸盐缓冲液中冲洗部分，然后在PBS中冲洗，终止银强化。
  9. 遵循下列步骤副标题3.6。

3.5. 聚乙二醇作为免疫标记物的应用程序

PEG是通过直接在树脂包埋组织制备的超薄切片上应用初级和次级抗血清来实现的。因此，必须考虑在树脂中包埋部分所需的整个过程中保持分子的抗原性（这通常涉及脱水和加热[约60°C]或紫外线照射几天）。此外，在缓冲液中培养超薄切片以进行PEG标记的步骤中，预计抗原性会进一步丧失。因此，应在准备超薄切片后立即执行PEG程序。此外，使用可能最强的固定剂进行经心灌注是有利的，例如高浓度戊二醛，以尽量减少超薄切片中抗原的浸出。当然，固定剂的选择可能会因强力固定导致分子变性而导致抗原性的潜在损失而受到进一步限制。

有几种埋入树脂的选择。对于涉及非热敏分子或抗原表位的研究，EMBED 812（Epon）或Epon Spurr将是首选树脂。在这两者中，Epon Spurr更具亲水性，从而允许免疫试剂对超薄切片进行更大的渗透。如果抗原对热敏感，则需要使用不需要加热聚合的包埋树脂。Lowicryl就是这样一种树脂，因为它可以通过紫外线照射在冷冻温度下聚合。Lowicryl的另一个优点是，它是一种亲水性树脂，可以使免疫剂极好地穿透超薄切片的厚度。然而，紫外线辐射也可能导致抗原性丧失。

一般来说，除抗血清外，下面列出的所有溶液都应使用O.22-μm Millipore过滤器进行过滤。适用于注射器尖端的小尺寸过滤器可用于此目的。网格是通过将它们面朝上浸入水滴中来孵化的。最好是通过将格栅侧向滑动成液滴来浸没格栅，液滴形成在格栅的副膜或硅胶垫表面。根据Phend等人优化的程序，具体步骤如下(37).

  1. 0.05清洗格栅M（M）Tris缓冲液，用0.9%氯化钠等渗制成，pH调节至7.6，并添加0.1%Triton X-100以增强免疫剂的穿透力（TBST，pH 7.6）。
  2. 在初级抗血清溶液中培养，用TBST稀释，pH 7.6。对于大多数抗血清，在室温下隔夜培养就足够了。应根据经验测定抗血清的稀释度，以在该培养时间内产生免疫标记。对于大多数抗血清，浓度需要大约是HRP-DAB标签所需浓度的10倍。无需将BSA添加到TBST中。
  3. 在pH 7.6的TBST中清洗2×5 min。
  4. 在pH 7.6的TBST中清洗30分钟。
  5. 将格栅在pH 8.2的TBST中调节5分钟。
  6. 将二级抗血清（例如抗兔IgG）与胶体金（市场上可买到的5至25nm大小）结合，以1:25至1:35的稀释度培养1h，使用TBST稀释，pH 8.2。
  7. 在pH 7.6的TBST中清洗2×5 min。
  8. 在蒸馏水中清洗2×5分钟。
  9. 空气干燥
  10. 使用5%乙酸铀酰溶解液和100%甲醇进行5-10 mm的反染色（可跳过可选步骤，以防止模糊弱HRP-DAB标签）。
  11. 将垂直固定的格栅反复浸入一个小烧杯中，快速冲洗，烧杯边缘填充100%甲醇。
  12. 空气干燥。
  13. 用蒸馏水冲洗。
  14. 用2%柠檬酸铅反染0.5–2分钟（可选）。
  15. 用蒸馏水冲洗。
  16. 空气干燥。

3.6. EM振动部分的处理

下面描述的程序包括固定后、平包埋、包膜包埋，然后制备超薄切片。概述了两个程序：一个用于HRP-DAB和SIG(步骤1,3-7)，和另一个不含锇的(2–7)-SIG和PEG免疫标记可能需要遵循这一点，这取决于抗原对化学和热处理引起的变性的敏感性。不含锇的方法如Phend et al(37).

  1. 四氧化锇后固定。将节返回到0.1M（M）磷酸盐缓冲液。用四氧化锇在室温下固定1-2小时。这一步对膜的保存很重要。如果怀疑经心固定仅实现了组织的弱固定，那么四氧化锇固定之前可以进行另一次固定，包括在室温下使用2%戊二醛稀释PBS，持续10分钟。

    四氧化锇的建议浓度为1–2%，用0.1稀释M（M）磷酸盐缓冲液。建议在这种后固定条件下放置节段的井尽可能平坦，以避免在节段上产生弯曲。此外，为了容纳高度挥发性的重金属溶液，应将井盖好并置于良好的工作罩下。固定步骤以0.1的冲洗结束M（M）PB。

  2. 不含四氧化锇的后蒸馏：所有步骤都在冰上进行，直到丙酮步骤。截面应始终保持平整。
    1. 在0.1中冲洗2×5分钟M（M）马来酸盐缓冲液，pH 6.0（MB）。
    2. 在1%单宁酸中培养40分钟，使用前立即溶解在MB中。
    3. 用MB冲洗2×3 min。
    4. 在1%乙酸铀酰中孵育40分钟，在MB中溶解过夜，同时避光（可以使用铝箔遮住溶液）。
    5. 用MB冲洗2×3 min。
    6. 在0.5%四溴化铱中孵育20分钟，前天在MB中搅拌。
    7. 用MB冲洗2×3 min。
  3. 使用增加系列的乙醇进行脱水，从30%到70%开始。对于无锇组织，按照此步骤在1%中培养15分钟对位-盐酸苯二胺，新鲜制作，使用70%乙醇避光。对于固定锇和不含锇的组织，接下来1–4小时整体用溶于70%乙醇中的1-4%乙酸铀酰染色。这一步骤不仅可以反染色，而且有助于超微结构的保存。按照此步骤进行进一步脱水，最高可达100%乙醇。从这一点开始，切片应保存在密封的小瓶中，以避免受潮。乙醇脱水后，浸入100%丙酮或100%环氧丙烷中，然后浸入50%丙酮（或环氧丙烷）和50%树脂（例如EMBED 812或Epon-Spurr）组成的溶液中4–20小时。
  4. 将其浸入丙酮和树脂的比例为1:3的溶液中4–20小时，然后进行100%的浸泡。
  5. 平铺：首先将部分平铺在用100%乙醇擦洗干净的Ac1ar塑料板表面。这些部分使用另一块较小的Aclar塑料片覆盖。挤出多余的树脂，就像光学显微镜的盖子滑动一样。治疗Aclar-sandwiched部分。对于EMBED 812和Epon Spurr，这需要将Aclar夹层部分放置在60°C的烘箱中12-20小时。对于Epon Spurr，37°C就足够了。为聚乙二醇设计的树脂，如Lowicryl，要求将Aclar-sandwiched部分置于无氧室内的紫外线下（因为氧气抑制树脂聚合）。通过使用干冰置换空气并使用Saran包裹物密封腔室，可以很容易地准备好这种腔室。这种腔室应内衬铝箔，以最大限度地利用反射紫外线辐射聚合树脂。此外，试验箱需要置于温度为−20至−30°C的冷冻柜中，以避免聚合过程中抗原变性。一旦固化，这种平埋的切片可以在室温下无限期保存，也可以用光学显微镜进行检查和拍照。
  6. 胶囊嵌入了部分所需的部分。这是通过首先剥离两片Aclar塑料板中的一片，同时保持该部分与剩余的一片Aclar塑料板粘连来实现的。部分切片仍然粘附在一片Aclar上，可以用剪刀或剃须刀片切割到足够小的尺寸，以便放入EM Beem胶囊中。用剃须刀片切下蜜蜂胶囊的锥形尖端。将平嵌入部分放在盖的平面内表面上，使Aclar板面向底部。将Beem胶囊（在另一端打开）装入盖中。用新鲜的嵌入树脂将胶囊填充到剃须刀刀片切割边缘。在烤箱中再固化12–20小时。
  7. 用超薄切片机制备超薄切片。用柠檬酸铅对超薄切片进行反染色（可选）。用四氧化锇和乙酸铀固定的组织在EMs下通常显示出足够的对比度，铅副染色有时会模糊弱的HRP-DAB免疫标记。

4.注意事项

  1. 与单克隆抗体相比，多克隆抗体显示出一些优势。多克隆抗体通常：
    1. 可以识别变性抗原。
    2. 在蛋白印迹上显示出良好的特异性。
    3. 由于识别相同抗原的抗体的多价相互作用，是免疫沉淀的优良试剂。
    4. 产生强烈的细胞染色信号。然而，主要问题是非特异性结合和有限供应。
  2. 当饲养针对人类肾上腺素能受体的兔抗体时，我们发现抗体的质量在兔和抗原之间各不相同。此外，人们应该意识到，即使产生良好抗血清的兔子也不能产生无限量的良好抗血清，因为滴度会随着年龄的增长而下降。
  3. 随着抗原长度的增加，溶解度降低。当谷胱甘肽-S公司-转移酶（GST）融合蛋白不能在裂解后的上清液中恢复大肠杆菌。大肠杆菌，我们建议制造新的融合蛋白结构，而不是试图增加溶解度。一般来说，生产新的融合蛋白并不十分耗时（即聚合酶链反应和测序）。有报道表明融合蛋白的溶解度增加。一种是与硫氧还蛋白基因的蛋白共转染或融合(41,42). 另一种方法是添加2.0%沙棘糖来溶解包涵体中的融合蛋白(43). 在我们的实验中，硫氧还蛋白基因的共转染对提高融合蛋白的溶解度没有太大帮助，并且来自包涵体的溶于肌氨酸钠的融合蛋白即使在加入Triton X-100清除肌氨酸后也不能很好地与谷胱甘肽-糖珠结合。在我们看来，只有在对GST融合所需的蛋白质部分没有选择的情况下，才应该采用这些替代方法。
  4. 当使用Bio-Rad的Affi凝胶时，我们建议将融合蛋白与Affi凝胶10和15融合，因为这些柱的质量不确定。关于柱洗脱条件，通常使用酸性和碱性pH缓冲液。请注意，即使使用不同的融合蛋白构建物，也不能消除所有非特异性结合。在某些情况下，克氏菌比亲和纯化抗血清更有效地进行免疫沉淀。
  5. 背景染色或非特异性结合经常出现在蛋白质印迹上。为了减少背景，我们发现以下方法单独或结合使用都有帮助：
    1. 降低一级和二级抗体的浓度，并将抗体的孵育时间从1小时增加到隔夜。这将增加灵敏度并减少非特异性染色。
    2. 用RIPA缓冲液封闭和清洗膜，并培养抗体。RIPA缓冲器由150 m组成M（M）氯化钠、1.0%诺奈德P-40、0.5%脱氧胆酸盐、0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）、50 mM（M）Tris（pH 8.0）。
    3. 在吐温-PBS中使用不同的缓冲液，例如5%的干奶，或在RIPA缓冲液中使用干奶。包含从用于产生二级抗体的动物物种获得的血清也可能有帮助。
    4. 用从已知不表达抗原的组织或细胞中获得的总蛋白预吸附抗血清。
    5. 亲和-使用抗原的肽片段而不是整个融合蛋白纯化多克隆抗体。
  6. 糖基化受体的Western blots检测限约为10 fmol/样品。这种限制在一定程度上是由于受体的异源糖基化，导致分子的分子量发生变化，从而导致蛋白质印迹上出现扩散带。因此，去糖基化可能有助于通过锐化带来提高检测灵敏度。

    另一个限制因素是可用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶槽的蛋白质数量。对于大多数SDS-PAGE凝胶，上限约为200μg/车道。如果受体表达水平高于100 fmol/mg蛋白质，则可以通过SDS-PAGE进行检测。然而，当表达水平为10–20 fmol/mg蛋白质时，检测几乎不可能，正如大多数完整细胞中所发现的那样。

    必须始终测试蛋白质印迹上的免疫反应带的特异性。这可以通过在印迹培养期间将肽片段与抗血清结合来实现。或者，可以在与抗血清孵育之前预先吸附抗血清。从基因敲除小鼠制备的组织或细胞是获得阴性对照的极好来源。

    增强化学发光（ECL）是一种广泛使用的蛋白质印迹检测方法，因为它具有极高的灵敏度。然而，灵敏度的提高也可能导致涂片染色。通过更加严格和反复地清洗膜以及使用更严格的条件，可以克服这个问题。

  7. G蛋白相关受体有聚集的趋势。当含有受体的蛋白质悬浮液煮沸时，这种趋势会增加，这通常是在装入聚丙烯酰胺凝胶之前进行的。这种聚集的受体分子往往停留在堆积凝胶中，而不是进入分离凝胶。由于无需煮沸即可成功电泳受体蛋白，因此煮沸步骤应省略。
  8. 有关SIG程序单独应用以及与HRP-DAB结合应用的更多详细信息和示例，请参阅裁判。 44.

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