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实验Gerontol。作者手稿;PMC 2011年8月1日发布。
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NIHMSID公司:美国国立卫生研究院172773
PMID:20064600

线粒体超氧化物产生的位点和拓扑结构

摘要

线粒体超氧化物的产生是细胞内活性氧物种的重要来源,可能导致或促成衰老和衰老疾病。哺乳动物线粒体中七个主要的超氧化物产生位点是已知的,并被广泛接受。按最大容量的降序排列,它们是复合物I(位点IQ)和复合物III(位点IIIQo)中的泛醌结合位点、甘油3-磷酸脱氢酶、复合物I中的黄素(位点IF)、脂肪酸β氧化的电子传递黄素蛋白:Q氧化还原酶(ETFQOR)、丙酮酸脱氢酶和2-酮戊二酸脱氢酶。这些网站都没有完整的特征,对于一些网站,我们只有粗略的信息。位点的拓扑结构很重要,因为它决定了一个位点是否会在线粒体基质中产生超氧物,并能够损伤线粒体DNA。所有部位都在基质中产生超氧物;位点IIIQo和甘油3-磷酸脱氢酶也向膜间隙产生超氧物。在没有电子传递抑制剂的情况下,每个位点对线粒体活性氧物种生成的相对贡献在孤立的线粒体、细胞或体内尚不清楚,并且可能因物种、组织、底物、能量需求和氧张力而有很大差异。

关键词:活性氧、活性氧、电子传递、半醌、络合物I、络合物III、磷酸甘油脱氢酶、ETFQOR

1.简介

在线粒体衰老自由基理论中(哈曼,1972年)线粒体活性氧(ROS)的产生是氧化性ATP生成的必然结果,也是大分子损伤的主要原因。一些损伤得不到修复,导致细胞机械的渐进性故障、与衰老相关的疾病和衰老。有大量证据支持和反对这一理论(贝克曼和艾姆斯,1998年;芬克尔和霍尔布鲁克,2000年;Golden等人,2002年;Muller等人,2007年;Sanz等人,2006年). 大多数作者认为线粒体产生的氧化应激很重要,特别是在与年龄相关的疾病中,但不是导致衰老的唯一原因。根据最近的审查(Muller等人,2007年)线粒体活性氧令人信服地决定了真菌的寿命(菌丝衰老波多孢属和年代老化酵母菌属)并且令人信服地秀丽隐杆线虫.该案件在年为暂定案件果蝇属但在老鼠和人类身上没有结论,需要更好的测试。

使用电子传递链抑制剂在分离的哺乳动物线粒体中确定了7个参与活性氧生成的特异位点(Andreyev等人,2005年;Brand等人,2004年;杰泽克和拉瓦塔,2005年;墨菲,2009;拉哈和罗宾逊,2000年;图伦斯,2003),但在没有此类抑制剂的情况下,我们缺乏对其速率的可靠测量,并且对其相对重要性没有达成共识。在细胞中,我们对哪些位点是重要的了解更为糟糕。它主要基于使用电子传输抑制剂的测量。通常,如果鱼藤酮(一种复合I抑制剂)提高细胞内的ROS生成,则推断内源性ROS生成来自复合I,但这种推断是不合理的,需要新的方法。

2.线粒体自由基衰老理论

线粒体活性氧的产生与年龄相关疾病之间的联系已被普遍接受,尽管也同意线粒体自由基理论对衰老的解释是不完整的(贝克曼和艾姆斯,1998年;芬克尔和霍尔布鲁克,2000年;Golden等人,2002年;Muller等人,2007年;Sanz等人,2006年). 由于年龄是许多疾病的主要风险因素,了解老龄化的机制可以使我们大大减轻疾病负担,增加人类健康寿命。因此,必须充分了解线粒体活性氧的产生,以评估其在年龄相关疾病和衰老中的作用,并最终合理设计有益的治疗方法。

与年龄相关的疾病可能是由超氧物的过度生产引起的,从而导致分子损伤。线粒体超氧化物解毒为H2O(运行)2通过超氧化物歧化酶(基质Mn-SOD,胞质Cu/Zn-SOD),然后转化为O2和H2抗氧化防御,包括过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶。然而,这些抗氧化剂并不完美,避免它们的超氧化物会损害蛋白质、脂质和DNA。H(H)2O(运行)2相对不活泼,但在铁(III)的存在下,它会形成活性羟基自由基,引发膜脂过氧化(Halliwell和Gutteridge,1999年). 糖、蛋白质和脂质氧化产物对蛋白质造成二次损伤(Shigenaga等人,1994年;Sohal和Weindruch,1996年). 因此,线粒体超氧化物会导致“氧化应激”。Mn-SOD基因敲除小鼠显示了基质超氧化物的毒性,即使存在抗氧化剂,它们也只能存活10-20天(Lebovitz等人,1996年;Li等人,1995年). 相反,在Cu/ZnSOD基因敲除小鼠中,细胞内的超氧物不是致命的(尽管它们对氧化应激很敏感(Ho等人,1998年))表明线粒体外超氧化物毒性较小。许多病理学与氧化应激有关,包括动脉粥样硬化、高血压、缺血再灌注、炎症、癌症、糖尿病、帕金森病和阿尔茨海默病(哈里维尔和古特里奇,1999年).

在衰老过程中,有很好的证据表明线粒体ROS生成的重要性(卡德纳斯和戴维斯,2000年).贝克曼和艾姆斯(1998)讨论自由基理论的14行证据,其中最涉及线粒体活性氧。然而,许多都是相关的,并没有证明因果关系。不同物种通过复合物I反向电子传输过程中,最大寿命与线粒体ROS生成之间存在一个有趣的负相关(Barja等人,1994年;Ku等人,1993年;Lambert等人,2007年)很难解释复杂的活性氧生成是否不会导致衰老。更直接的测试包括改变抗氧化防御,但结果不明确。Cu/Zn-SOD在果蝇属两者都没有效果(Seto等人,1990年),或延长寿命(Sun等人,2002年). SOD/过氧化氢酶模拟物可延长线虫(Melov等人,2000年),但仅在特定条件下(基尼和杰姆斯,2003年). 小鼠抗氧化防御系统的过度表达通常不会延长寿命(Perez等人,2009年). 原则上,最好的测试是证明线粒体ROS生成减少减缓衰老。RNAi筛选的一个显著结果是,大多数线粒体电子传递蛋白的敲除延长了秀丽线虫(Dillin等人,2002年;Lee等人,2003年). 然而,由于我们不知道电子传输链中哪些位点产生的ROS最多,因此很难知道如何在不改变ATP合成的情况下改变ROS的产生。

3.线粒体是活性氧的来源

当单电子泄漏到O时,呼吸链会产生超氧化物2当电子对沿着链条向下流动时(Chance等人,1979年). 对线粒体活性氧的兴趣始于40多年前(Boveris and Chance,1973年;Boveris等人,1972年;Hinkle等人,1967年;延森,1966年)并且得到了很好的评价(Andreyev等人,2005年;Brand等人,2004年;杰泽克和拉瓦塔,2005年;墨菲,2009;拉哈和罗宾逊,2000年;图伦斯,2003). 目前,哺乳动物线粒体ROS产生的七个独立位点已被确定并被广泛接受(图1)下面将更深入地讨论这些问题。产生ROS的最大容量最大的站点位于复合体I(站点IQ)和复合体III(站点IIIQo)(Barja,1999年;Chen等人,2003年;Kudin等人,2004年;刘等人,2002;拉哈和罗宾逊,2000年;St-Pierre等人,2002年;Votyakova和Reynolds,2001年),尽管其他五个站点也有显著的最大速率(Andreyev等人,2005年) (图1). 鉴于线粒体DNA在基质中的位置及其对氧化损伤的敏感性,这种拓扑结构可能至关重要。络合物I向基质产生超氧物,而络合物III在去能量条件下以大约相等的速率向基质和膜间空间产生超氧(图1) (Han等人,2003年;Han等人,2001年;Miwa和Brand,2005年;Miwa等人,2003年;Muller等人,2004年;圣皮埃尔等人,2002年).

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线粒体超氧化物产生的位点和拓扑结构

线粒体中已确定的七个超氧化物产生位点如上图所示,并指示了其底物结合位点的位置和超氧化物产生的拓扑结构。PDH、丙酮酸脱氢酶;OGDH,2-酮戊二酸脱氢酶;位点IF,复合物I的含有FMN的NADH结合位点;位点IQ,辅酶I泛醌还原位点;ETFQOR,电子传递黄素蛋白泛醌氧化还原酶——电子传递链中通过ETF(电子传递黄素蛋白质)将脂肪酸的黄素连接β氧化为泛醌的电子进入点;GPDH,3-磷酸甘油脱氢酶;位点IIIQo,复合体III中Q循环的外醌结合位点。PDH和OGDH也可能直接产生过氧化氢。

下部面板显示了每个位置以及SDH(琥珀酸脱氢酶;复合物II)和IV(复合物IV)的最大超氧物生成速率的代表值。比率是大鼠骨骼肌线粒体的Lambert等人,2007年;兰伯特和布兰德,2004a,b条;Lambert等人,2008年a;Lambert等人,2008b;St-Pierre等人,2002年和Jason Treberg、Casey Quinlan和Martin D Brand(未发表的观察结果),从站点IQ和IIIQo来看是最大的,其次是GPDH,然后是站点IF、EFTQOR、PDH和OGDH。复合物II和复合物IV(或池Q和细胞色素c,未显示)产生的超氧物微不足道。

在分离的细胞或体内,线粒体被认为会产生大量的活性氧(斯科拉切夫,1996年)尽管证据并不完全令人信服。主要间接证据来自Mn-SOD基因敲除对小鼠寿命的缩短作用(Lebovitz等人,1996年;Li等人,1995年). 荧光探针如二氯二氢荧光素或二氢罗丹明已被用于数百项研究,以推断细胞中线粒体活性氧的产生,但存在解释问题(沃德曼,2007年). 氢乙硫胺及其线粒体靶向形式(mitoSOX)可能更可靠(Jekabsons和Nicholls,2006年;Johnson-Cadwell等人,2007年;Mukhopadhyay等人,2007年;Song等人,2007年).

经常断言线粒体O的1-4%2体内的消耗被转移到活性氧上是错误的。它是基于线粒体中复合物III在抗霉素存在下,在饱和底物和O2(Chance等人,1979年). 不太现实的条件预测值较低,只有0.15%(Hansford等人,1997年;圣皮埃尔等人,2002年). 在缺乏电子传递链抑制剂的情况下,线粒体ROS生成的哪个特定位点在细胞中最为活跃尚不清楚。

4.分离线粒体ROS生成的测量

超氧化物不会穿过线粒体内膜,因此使用分离线粒体的体相分析无法记录基质超氧化物。然而,基质Mn-SOD将大部分基质超氧化物转化为H2O(运行)2,扩散到介质中进行分析。线粒体外H的标准测定2O(运行)2是添加辣根过氧化物酶(以减少H2O(运行)2至H2O) 以及被氧化为荧光产物(resorufin)的底物(例如amplex red)。如果基质中有大量锰-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)被逃避,或者如果基质中存在大量氢,则该方法低估了基质超氧化物的生成2O(运行)2被谷胱甘肽过氧化物酶或过氧化氢酶等过氧化物酶清除。早期工作使用高香草酸进行检测(Barja,2002年). 然而,这受到高背景速率和低准确度的影响,骨骼肌或心脏线粒体丙酮酸和苹果酸氧化过程中自然产生的超氧物速率处于或低于检测极限(St-Pierre等人,2002年). 安培红或安培超红是更好的探针,可以提供更大的信号和较低的背景,尽管仍有必要控制荧光猝灭并仔细校准(Lambert等人,2007年;Lambert等人,2008年a;Lambert等人,2008b). 使用amplex红,超氧物的自然生成速率小于0.1 nmol.min−1.(mg蛋白质)−1可以测量(Lambert等人,2007年). 这与3至6 nmol.min相比−1.(mg蛋白质)−1在哺乳动物心脏或骨骼肌线粒体或果蝇线粒体中的反向电子传递或正向电子传递加上抗霉素(兰伯特和布兰德,2004b;Lambert等人,2008b;Miwa等人,2003年). 基质乌头酸酶也可用于在不同条件下测定基质超氧化物(Talbot等人,2004年). 乌头糖具有不稳定的活性部位Fe-S中心,对超氧物敏感。如果使用已知的超氧化物生成速率进行校准,例如从站点If校准,乌头酸酶失活动力学可以以绝对单位报告基质ROS生成(Miwa和Brand,2005年).

5.线粒体ROS产生的位点

在分离的线粒体中,每个位点对总超氧化物产生的相对重要性存在争议,部分原因是不同的分析、不同的底物和不同的线粒体来源。大多数对特定位点的超氧化物产生进行的分析测定了超氧化物的最大产生能力,在没有抑制剂的情况下,每个位点的实际速率未知。在从琥珀酸到NAD的反向电子传输过程中±,复合物I可以高速产生超氧化物(Han等人,2003年;Hansford等人,1997年;Kushnareva等人,2002年;Lambert和Brand,2004年a,b条;刘等人,2002;Turrens和Boveris,1980年;Votyakova和Reynolds,2001年)尽管生理相关性尚不清楚(Muller等人,2008年). 在NAD结合底物(可能更生理化)的正向电子传输过程中,大多数线粒体在添加诸如鱼藤酮等抑制剂(用于复合物I)后以高速生成超氧物(Han等人,2003年;Hansford等人,1997年;兰伯特和布兰德,2004a,b条;刘等人,2002;St-Pierre等人,2002年;Votyakova和Reynolds,2001年)或抗霉素A(用于复合物III)(Chen等人,2003年;Gyulkhandanyan和Pennefather,2004年;Herrero和Barja,1997年;Kwong和Sohal,1998年;刘等人,2002;McLennan和Degli Esposti,2000年;Raha等人,2000年;St-Pierre等人,2002年;Turrens等人,1985年). 其他生理相关底物,如脂肪酸和3-磷酸甘油,可能会导致丙酮酸氧化过程中活性较低的部位产生超氧物,如ETF–Q氧化还原酶和3-磷酸丙三醇脱氢酶。

5.1. 综合设施I的ROS生产:中心IF

几种病理学与缺陷复合物I的超氧物生成增加有关(拉哈和罗宾逊,2000年)在这个大型多亚单位复合体中,确定超氧化物产生的位置非常重要。氧化还原中心为黄素单核苷酸(FMN)、八个Fe-S簇(N1a、N1b、N2、N3、N4、N5、N6a和N6b)和Q。该复合物具有疏水臂和基质突出的亲水臂(包含FMN和Fe-S团簇)。Q结合位点位于臂之间的接合处。电子转移如何与质子泵耦合是一个尚未解决的主要问题(Sharma等人,2009年).

在分离的复合物I中,完全还原的黄素(位点IF)主导着超氧化物的产生(库斯茅和赫斯特,2006年). 在分离的线粒体中,供给复合物I(例如丙酮酸和苹果酸)的正向电子传递底物产生超氧物的速率较低(Gyulkhandanyan和Pennefather,2004年;Hansford等人,1997年;库丁等人,2004年;Kushnareva等人,2002年;Kwong和Sohal,1998年;兰伯特和布兰德,2004b;Liu等人,2002年;Votyakova和Reynolds,2001年). 在这些“生理”条件下,IF位点被相对氧化,来自该位点的超氧物与电子传递链中剩余位点之间的平衡目前尚不清楚。鱼藤酮阻断络合物I的奎宁结合位点,导致电子备份并完全减少上游氧化还原中心。这使低速率增加了几倍,表明复合物I在鱼藤酮块上游位置的正向电子传输过程中有能力以显著速率产生超氧化物。该位点通常被识别为IF位点。然而,它也可能包括基质脱氢酶(丙酮酸脱氢酶和氧戊二酸脱氢酶)(Chinta等人,2009年;Gazaryan等人,2002年;Starkov等人,2004年;Tretter和Adam-Vizi,2004年). 抑制剂研究支持现场IF(Johnson等人,2003年;刘等人,2002;Young等人,2002年)基于热力学原理(Kudin等人,2004年). Fe-S簇(Herrero和Barja,2000年)特别是N1a(Kushnareva等人,2002年)或N2(Genova等人,2001年),也已提出。然而,现在普遍认为,在存在降低基质NAD的底物的情况下,鱼藤酮抑制的线粒体产生的超氧物主要来自位点IF(和上游脱氢酶)。

5.2. 综合体I的ROS生产:中心IQ

线粒体中复合物I产生超氧物的最大速率变化很大。琥珀酸或甘油3-磷酸的比率最高(Gyulkhandanyan和Pennefather,2004年;Hansford等人,1997年;Kushnareva等人,2002年;兰伯特和布兰德,2004b;刘等人,2002;Miwa等人,2003年;Ohnishi等人,2005年;Votyakova和Reynolds,2001年). 这些底物将泛醌(Q)还原为QH2并产生质子动力,在热力学上驱动电子向上通过复合物I以减少NAD±至NADH。鱼藤酮(复杂的IQ位点抑制剂)显著减少超氧化物的产生(Gyulkhandanyan和Pennefather,2004年;Hansford等人,1997年;Kushnareva等人,2002年;兰伯特和布兰德,2004b;刘等人,2002;Ohnishi等人,2005年;Votyakova和Reynolds,2001年),表明在QH的反向电子传输过程中,复合物I产生了大量超氧物2至NAD±。这种超氧物似乎来自复合物I(位点IQ)中的奎宁结合位点。复合物I在反向电子传输过程中的最大超氧物生成速率远快于黄素在正向电子传输过程的最大速率,因此,站点IF具有较低的最大容量,对反向电子传输期间的高速率几乎没有贡献(图1).

关于复合物I中存在两个单独的超氧化物产生位点(位点IF和IQ)而不是一个位点,存在一些争议(Hirst等人,2008年;Lambert等人,2008年a;Lambert等人,2008b),需要做更多的工作才能完全解决这个问题。使分析复杂化的是,用于识别复合物I中位点的一些抑制剂的特征很差。它们包括“FMN-specific”二苯碘铵、Fe-S中心抑制剂,如第页-氯汞苯甲酸盐和乙氧基甲酸酐,以及各种Q位抑制剂(Degli Esposti,1998年). 在我们手中,(鱼藤酮和副蓖麻素除外)这些抑制剂也会解偶联,缺乏位点特异性,这使得它们在识别ROS位点方面不可靠。在我们目前的逆向电子传输过程中的超氧物生成模型中,大多数来源于位点智商。位点IF以适度的速率生成超氧物,仅在位点智商不活跃且黄素完全减少时才占主导地位,例如在鱼藤酮存在且缺乏pH梯度的正向电子传输期间(兰伯特和布兰德,2004a). 在正向电子传输过程中,站点智商通常不是很活跃。当满足非常特殊的条件时,它仅在正向电子传输过程中生成ROS:存在较大的pH梯度和Q结合位点的特定抑制剂,如粘液噻唑,这可能会扭曲位点以允许ROS生成并模拟反向电子传输期间发生的状态(兰伯特和布兰德,2004a). 鱼藤酮在存在pH梯度的情况下具有类似但不太显著的效果。在没有pH梯度的情况下,它产生的ROS与豆甾醇(一种复杂的III抑制剂)相同,因此在鱼藤酮或豆甾酮存在的正向电子传输过程中,ROS产生来自IF位点(加上上游位点)。

我们已经测试了线粒体中IQ和IF的这些分配。以前的证据表明,在逆向电子传递过程中,基于使用“黄素位点特异性”抑制剂二苯碘铵,位点IF参与了这一过程,但这一证据是有缺陷的,因为在短期孵育中,抑制剂不在位点IF起作用,而是在线粒体中的位点IQ起作用(Lambert等人,2008年a). 我们还反驳了这样的说法,即在逆向电子传输过程中,复合体I产生的ROS来自位点IF(或上游),并可以通过在这些条件下黄素的过度还原来解释。我们发现,在逆向电子传递过程中,NAD(P)H池(报告黄素氧化还原状态)并不多,但比用鱼藤酮进行正向电子传输时减少得少(Lambert等人,2008b).

这些问题提出了一个问题,即主要复合物I ROS产生位点(IQ)在体内是否活跃。答案尚不清楚,但对于测试和全面阐述线粒体自由基衰老理论至关重要。一些体外证据表明它可能具有活性(Muller等人,2008年;圣皮埃尔等人,2002年). 证明该位点具有生理活性的最有力间接证据是,位点IQ的活性与不同物种线粒体的寿命呈负相关(Barja等人,1994年;Ku等人,1993年)即使消除了体重的混杂影响(Lambert等人,2007年). 然而,首先是线粒体氧化“生理”底物,其次是细胞,需要更好和更直接的证据来证明位点智商的重要性(或不重要性),实际上是所有线粒体位点的重要性。

质子动力的成分(尤其是pH梯度(兰伯特和布兰德,2004b))通过站点智商显著影响超氧化物生成(Gyulkhandanyan和Pennefather,2004年;Hansford等人,1997年;Korshunov等人,1997年;兰伯特和布兰德,2004a,b条;刘,1997;刘等人,2002;Votyakova和Reynolds,2001年). 因此,轻微的解偶联会略微降低两种组分,从而大大降低反向电子传输过程中的高超氧物生成。轻微的解偶联也会氧化其他电子载体,降低局部氧张力,并减少其他部位的超氧物生成。这导致了“解偶联以生存”的概念,该概念提出通过温和解偶联降低质子动力可以降低超氧化物的生成,同时允许足够的ATP生成。这可能会降低氧化损伤并延长寿命(品牌,2000;斯科拉切夫,1996年).

5.3. 综合体III的ROS生产:中心IIIQo

超氧化物是由O的单电子还原产生的2通过电子载体。在复合物III中,这些是细胞色素b条566,b条562c(c)1、Rieske Fe-S中心和中心的醌'和'o(o)’ (Zhang等人,2000年). 主要还原剂是中间的半醌o(o)(三季度)(Boveris and Chance,1973年;Cadenas等人,1977年;Turrens等人,1985年),符合Q循环机制(图伦斯,2003). 在线粒体中,复合物III只有在抗霉素存在的情况下才能高速产生超氧化物(Chen等人,2003年;Gyulkhandanyan和Pennefather,2004年;Herrero和Barja,1997年;Kwong和Sohal,1998年;刘等人,2002;McLennan和Degli Esposti,2000年;Raha等人,2000年;St-Pierre等人,2002年;Turrens等人,1985年). 该抑制剂阻止电子从b条566到中间的醌导致中间有少量半醌积聚o(o),容易减少O2到超氧化物(Cape等人,2007年). 中心o(o)复合物III抑制剂(例如粘液噻唑或豆甾醇),阻止电子进入中心o(o)并防止这些高利率(Ksenzenko等人,1983年;Raha等人,2000年;Turrens等人,1985年)表明复合物III的主要超氧化物位点是位于中心的半醌o(o)几乎没有来自邻近地点,如中心,池泛醌(QH2/Q) 或复合物II(Miwa等人,2003年;St-Pierre等人,2002年). IIIQo位点的过度还原降低了中心活性半醌的浓度o(o),并将该位置的超氧化物生成量降低到略高于氧化条件下可获得的最大速率以下(Drose和Brandt,2008年;埃雷琴斯卡和威尔逊,1976年).

在没有抗霉素的情况下,耦合线粒体氧化NAD结合底物的IIIQo位点的超氧物生成速率尚不清楚,因为添加粘液噻唑或豆甾醇来阻断该位点,也会通过破坏质子运动力和改变Q和NAD池的氧化还原状态,间接干扰复合物I位点。一些作者认为IIIQo位点是生理条件下的主要位点(Chen等人,2003年); 其他人则认为其作用不大(Kushnareva等人,2002年;Lambert和Brand,2004年a;刘等人,2002;Votyakova和Reynolds,2001年). 需要进行明确的实验。

5.4. 其他线粒体位点ROS的产生

复杂II突变和由此导致的活性氧过量生产导致人类疾病(Rustin等人,2002年)和秀丽线虫(Senoo-Matsuda等人,2001年). 与配合物I或III的最大超氧物生成速率相比,配合物II(琥珀酸脱氢酶)的速率通常可以忽略不计(Chen等人,2003年;Gyulkhandanyan和Pennefather,2004年;Hansford等人,1997年;McLennan和Degli Esposti,2000年;Miwa等人,2003年;Turrens等人,1985年) (图1)因为这种酶抑制活性部位黄素自由基的形成。富马酸还原酶在琥珀酸氧化过程中的速率,富马酸还原酶催化了大肠杆菌并且缺乏这种机制(Messner和Imlay,2002年).

3-磷酸甘油脱氢酶在线粒体中生成活性氧(Drahota等人,2002年;Gyulkhandanyan和Pennefather,2004年;Kwong和Sohal,1998年;Miwa等人,2003年;Sekhar等人,1987年;Tretter等人,2007年). 拓扑测量表明,超氧化物在膜的两侧产生(Miwa等人,2003年). 由于晶体结构显示黄素位于膜平面外(膜间空间)(Yeh等人,2008年)这种脱氢酶的膜埋醌结合位点可能是产生超氧物的主要位点。需要对此网站进行进一步研究。

在脂肪酸氧化过程中,电子传递黄素蛋白Q氧化还原酶(ETFQOR)可能以显著速率向膜基质侧产生超氧物(St-Pierre等人,2002年),但该站点的特征仍然很差。

复合物III(细胞色素)下游站点的活性氧生成c(c),络合物IV)可通过添加氰化物(从上游减去测量速率)完全还原这些位置时的差值进行测量;他们贡献甚微(Miwa等人,2003年).

其他线粒体位点可以产生ROS(Andreyev等人,2005年),包括2-酮戊二酸和丙酮酸脱氢酶(Chinta等人,2009年;Gazaryan等人,2002年;Starkov等人,2004年;Tretter和Adam Vizi,2004年)和非哺乳动物NADH-Q氧化还原酶(Fang和Beattie,2003年). 他们的活性氧生产特征不佳,值得进一步研究。

6.线粒体超氧化物生成的拓扑结构

活性氧产生的拓扑结构对于哪些位点可能对线粒体DNA造成最大损伤至关重要。在完整的线粒体中,基质Mn-SOD将生成到基质中的超氧化物转化为H2O(运行)2扩散并在线粒体外培养基中进行检测。然而,向膜间空间产生的超氧化物需要添加SOD才能完全转化为H2O(运行)2用于化验,所以H2O(运行)2依赖于添加的SOD的产物被产生到膜间空间而不是基质。该分析准确地识别了特定部位的外部超氧物生成,并能够估计超氧物产生的拓扑结构,虽然由于内源性外部歧化酶和内部过氧化物酶的影响,对侧性的定量估计是粗略的(Miwa和Brand,2005年;Miwa等人,2003年;St-Pierre等人,2002年;Muller等人,2004年). 利用该分析,确定了每个电子传递链位点产生超氧物的拓扑结构(图1). 由于它们的基质定位,丙酮酸脱氢酶和氧戊二酸脱氢酶被认为在基质中只产生超氧物。除了复合物III和3-磷酸甘油脱氢酶外,所有的电子传递链位点也只向基质产生超氧物质(Miwa和Brand,2005年;Miwa等人,2003年;St-Pierre等人,2002年).

最初的观点是,复合体III产生的活性氧直接指向基质,但晶体结构(岩手等人,1998年)显示IIIQo位点面向细胞膜的细胞质侧,因此不清楚该位点如何生成基质超氧化物。我们发现IIIQo的活性氧部分在线粒体外部分在线粒体内生成(St-Pierre等人,2002年). 果蝇线粒体也是如此,IIIQo位点的超氧物和3-磷酸甘油脱氢酶都被均匀地导向膜的两侧(Miwa和Brand,2005年;Miwa等人,2003年). 一项关于哺乳动物线粒体的优雅研究也显示,细胞膜两侧的位点IIIQo超氧化物的产生量大致相等(Muller等人,2004年). 这些位点向膜两侧生成超氧物的机制尚未完全解决,但可能涉及在膜双层内释放半醌或氢过氧化物自由基,然后扩散和反应(分别与氧气或脱质子反应)以形成溢出到膜两侧的超氧化物(Muller等人,2004年).

7.细胞线粒体产生活性氧

线粒体经常被认为是细胞内活性氧的主要产生者(Skulachev,1996年)但这一结论尚未得到彻底证实。在一些细胞中,其他来源,如细胞色素P450(Caro和Cederbaum,2004年)或质膜NADPH氧化酶(Babior等人,2002年)产生大量ROS(杰泽克和拉瓦塔,2005年)线粒体在不同细胞中所占的细胞活性氧生成比例尚待确定。由于线粒体活性氧的产生可能在双曲线上依赖于氧张力,不同部位的氧亲和力不同(霍夫曼和布鲁克斯,2009年),随着细胞内氧张力的上升和下降,不同部位的贡献可能不同。

两个问题阻碍了对细胞内ROS产生的特定线粒体位点的鉴定。第一个是量化活性氧生成的方法。荧光探针,如二氯二氢荧光素或二氢罗丹明,存在解释问题-其特异性通常不清楚,它们本身可能导致活性氧的产生(沃德曼,2007年). 氢乙硫胺和丝裂霉素可能更可靠(Jekabsons和Nicholls,2006年;Johnson-Cadwell等人,2007年;Mukhopadhyay等人,2007年;Song等人,2007年). 第二种是使用电子传递抑制剂来识别ROS产生的位点,这与孤立线粒体的问题相同。尚不清楚细胞中是否存在反向电子传递和相关的高超氧物产生。一些研究(Aon等人,2003年;Chandel等人,1998年;李和特鲁什,1998年;Parthasarathi等人,2002年;Quillet-Mari等人,1997年;Schuchmann和Heinemann,2000年;Vrablic等人,2001年;Zamzami等人,1995年)发现鱼藤酮降低细胞活性氧的形成,表明细胞中的位点智商(或IIIQo)是活跃的。相反,许多研究报告鱼藤酮增加细胞内ROS的生成(Barrientos and Moraes,1999年;Li等人,2003年;Nakamura等人,2001年;Siraki等人,2002年). 后一个结果通常被认为暗示细胞中存在位点IF,然而,这一结论是错误的,因为鱼藤酮的添加减少了位点IF并增加了ROS的产生,而不管它在抑制前是否被充分减少以产生显著的ROS。因此,添加鱼藤酮后细胞内ROS生成增加的观察结果不能用于推断ROS生成的天然线粒体位点的身份,需要开发其他方法。

8.结论

线粒体活性氧的产生显然与衰老和衰老疾病有关,但其确切作用和重要性仍不明确。我们现在知道线粒体中产生超氧化物的七个位点的身份,并对它们的拓扑结构及其相对最大容量有了很好的了解(图1). 我们不知道的是,在分离的线粒体、完整的细胞和体内,这些位点在底物供应和能量需求的不同生理条件下运行的速率。制定出进行此类测量的方法是未来的一项重要挑战,但如果我们要充分了解线粒体活性氧的产生及其在衰老和疾病中的作用,这是非常必要的。

致谢

由美国国立卫生研究院(P01 AG025901、PL1 AG032118、P30 AG025708和R01 AG033542)和凯克基金会的资助。

脚注

出版商免责声明:这是一份未经编辑的手稿的PDF文件,已被接受出版。作为对客户的服务,我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前,将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意,在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误,适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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