诱导多能干细胞与衰老：学习生物学以改进技术

摘要

请参见词汇表本文中使用的缩写。

iPSC：承诺与挑战

体细胞不同于其癌症衍生物，不能无限期分裂。这种有限的增殖潜能对于维持后代的完整性至关重要。相反，胚胎干细胞（ESC）具有自我更新的能力，可以经历多次细胞分裂，产生相同的未分化子细胞。ESCs也是多功能的，因为它们可以分化为胚胎的所有细胞类型。长期以来，人们一直在探索通过某种方式逆转发育过程中发生的自然分化过程，从体细胞中获得多能干细胞的想法。尽管从体细胞中转移细胞核——首先在青蛙中，然后在哺乳动物中(格登，1962年;Hochedlinger&Jaenisch，2002年;威尔穆特等, 1997)-和细胞融合研究(魏曼等, 2003;应等, 2002)我们了解了这些过程的生物学，这一领域的真正飞跃是诱导多能干细胞（iPSCs）的产生。四年前，Takahashi和Yamanaka报告称，通过表达四种与多能性相关的因子，即所谓的“Yamanaka因子”，可以对体细胞进行重新编程：OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC(高桥和山中，2006年). 这一发现表明，人们可以从任何选择的细胞（包括患者细胞）开始生成多能干细胞，这对相关细胞系统中的再生医学、疾病建模和药物筛选都具有重要意义。然而，iPSC的重新编程仍面临一些实际应用必须克服的障碍。其中，重新编程的效率需要提高，需要生成安全且理想情况下没有任何外源序列的iPSC。这些过程是内在联系的，例如，某些基因的沉默不足可能足以削弱假定的重组细胞的多能性潜力。类似地，插入iPSC基因组中的外源序列可导致插入突变或不完全转基因沉默导致致瘤性增加。此外，必须控制诱导多能干细胞的质量，即它们促进生殖系传播或分化为不同谱系的能力，因为使用不同方法获得的诱导多能干细胞之间似乎存在质量差异(汉族等, 2010). 在改进和理解重新编程过程方面付出了大量努力，这一主题在其他地方也得到了很好的回顾(冯等, 2009). 在这里，我们关注的事实是，肿瘤抑制机制在重编程过程中被激活，这表明衰老是iPSC生成的障碍。

微调重新编程

自从iPSC被发现以来，在提高其效率和安全性方面已经做出了重大改进。例如，已经探索了原始逆转录病毒载体的替代方法来传递重编程因子。其中包括减少或消除基因组永久性修改的方法，如多顺反子载体(卡吉等, 2009;沃尔琴等, 2009)，瞬时转染(冲田等, 2008)，转座子向量(卡吉等, 2009)，腺病毒载体(斯塔特菲尔德等, 2008)，上位向量(于等, 2009)，无细菌DNA元素的“小圆”载体(贾等, 2010)或重组蛋白(周等, 2009). 通过避免基因组的永久性改变，由于转基因沉默不足而导致的转化或不完全多能性的风险降低。

除了重编程因子的表达时间和沉默外，载体转导和因子化学计量学的效率也会影响重编程的效率(汉娜等, 2009;山中，2009). 这个问题已经通过使用表达四个因子的多顺反子载体得到解决(卡吉等, 2009)，或从iPSC衍生分化细胞生成“次级iPSC”的系统(图1). 在后一种策略中，纤维母细胞样细胞（或其他体细胞类型）是在在体外含有强力霉素诱导的Yamanaka因子的多能干细胞的分化，或者在小鼠细胞的情况下，通过产生嵌合小鼠进行分化(马赫拉利等, 2008;韦尼希等, 2008). 然后用多西环素处理分化细胞，诱导其重编程为次级iPSC。然而，尽管病毒转基因在大多数细胞中被重新激活，并且重编程效率提高了50-100倍，但重编程的总频率仍然很低，只有1-3%(马赫拉利等, 2008). 这可能是由于存在限制重新编程效率的附加障碍。

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图1

次级iPSC的生成。重编程因子由多西环素诱导的载体在原代体细胞中表达。通过多西环素治疗、菌落选择和退出治疗，诱导重编程为初级iPSCs。然后对产生的iPSC进行区分在体外携带DOX诱导因子的体细胞；或者，可以生产嵌合体动物，从中获得体细胞，例如B细胞或成纤维细胞。次生体细胞都含有整合的重编程因子，可以通过DOX诱导进行重编程，以更高效地产生次生iPSC。DOX，强力霉素；诱导多能干细胞；KLF4，类克鲁珀因子4；OCT4，八聚体4；SOX2，SRY-box 2。

了解重新编程

为了使重新编程成为一个更有效的过程，我们需要了解它的启用机制，并将其与我们对干细胞生物学和多能性的知识联系起来。这种策略的最好例子是Takahasi和Yamanaka的原始工作，他们在其中选择了24个与维持干细胞特性相关的因素作为重新编程实验的起点(高桥和山中，2006). 汤姆森小组设计了一个类似的策略，以ESCs中表达的15个与多能性相关的因子为起点，定义OCT4、SOX2、LIN28和NANOG的组合对人体体细胞进行重新编程(于等, 2007). 最近发现AID依赖的DNA去甲基化对原始生殖细胞（PGCs；不丹等, 2010). 毫不奇怪，AID依赖的DNA去甲基化对于单异核体向多能性的重编程也是必需的(波普等, 2010).

将体细胞重新编程为多功能样状态的机制目前尚不清楚。了解重编程如何运作的方法之一是生成iPSCs中基因表达和染色质状态的全基因组图谱，并将其与体细胞、ESCs和部分重编程iPSCs（前iPSCs；米克尔森等, 2008;斯里达兰等, 2009). 这些研究表明，独立或通过不同方案获得的不同来源的多能干细胞在分子水平上明显相似。重要的是，iPSCs和ESCs在基因表达谱、表观遗传状态方面相似(米克尔森等, 2008;斯里达兰等, 2009)甚至在组织特异性增强子的状态下(徐等, 2009)，尽管存在细微差异(下巴等, 2009). 也许更令人惊讶的是，在不同的前iPSC之间观察到的高度相似性，表明它们具有共同的中间起源。前iPSCs和iPSCs之间的差异之一是染色质重塑的程度；例如，前iPSCs中具有双价染色质结构域的基因数量（即那些既包含激活又包含抑制性表观遗传修饰的基因）低于iPSCs或ESCs，后者与更多的高甲基化启动子相关。在前iPSCs中显示异常甲基化模式的启动子中，有多潜能相关因子OCT4、NANOG和REX1的启动子(米克尔森等, 2008). 这些研究开始阐明重新编程的过程，并可用于合理改进技术。事实上，用DNA甲基化抑制剂（如AZA）治疗不仅可以提高iPSCs的重编程效率，而且可以将一定比例的前iPSCs转化为iPSCs(米克尔森等, 2008). 在用短发夹RNA抑制甲基转移酶DNMT1的表达后，获得了类似的结果(米克尔森等, 2008). 此外，使用其他影响染色质一般状态的药物，例如几种HDAC抑制剂，例如VPA、TSA或SAHA-or BIX-01294，G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂，也可以提高重编程的效率（参见冯等, 2009). 相反，一些前诱导多能干细胞不能抑制谱系特异性转录因子，因此，其中一些因子（如GATA6、PAX7、PAX3和SOX9）的联合沉默可以增加重编程(米克尔森等, 2008).

转录谱分析也揭示了参与DNA复制的基因的上调(POLI、RCF4和MCM5型)和细胞周期进展(CCND1号机组和CCND2号机组;米克尔森等, 2008)-除了几个抗增殖基因的上调外，如CDK抑制剂p21^{Cip1号机组}和第16页^墨水4a-在前iPSC中或作为对重编程因子表达的即时反应(米克尔森等, 2008;巴尼托等, 2009;斯里达兰等, 2009). 这些结果表明，在重新编程期间，抗增殖反应意外激活(图2;巴尼托等, 2009). 几个小组分析了重编程因子的表达是否足以直接触发抗增殖反应，并表明四种Yamanaka因子或OCT4、SOX2和KLF4的组合在人或小鼠成纤维细胞中的表达足以诱导p53和p21^{Cip1号机组}(商行等, 2009;巴尼托等, 2009;川村等, 2009). 单个因子的表达或OCT4和SOX2的组合似乎也足以触发p53和/或p21的激活^{Cip1号机组}(巴尼托等, 2009;川村等, 2009).

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图2

替代细胞命运限制了重编程效率。在成功的重编程过程中，体细胞中重编程因子的表达导致iPSC的产生。在某些情况下，重编程过程并不完整，可以获得经过不完全染色质重塑的部分重编程iPSC。或者，重编程因子的表达可以导致衰老（RIS）、凋亡，或有助于产生的细胞的致癌转化。ESC，胚胎干细胞；诱导多能干细胞；KLF4，类克鲁珀因子4；OCT4，倍频程4；RIS，重编程诱导衰老；SOX2，SRY-box 2。

重编程期间p53激活的主要决定因素尚未明确确定。p53激活方式的差异可能存在于人类和小鼠来源的细胞之间，如在肿瘤诱导衰老（OIS）期间发生的差异。例如，p19的角色^阿尔夫从最近的结果可以推断出MEF重编程期间p53的激活(川村等, 2009)，但是否p14^自动射频在人类细胞重编程期间，在激活p53方面也有类似的作用，尚待确定。然而，一些研究小组观察到，DNA损伤反应（DDR）与重编程因子的表达相一致(巴尼托等, 2009;川村等, 2009;马里恩等，2009年a). 这种DDR的触发因素尚不清楚，尽管有人认为，观察到的γH2AX染色的泛核模式与DNA复制诱导的DNA损伤相一致(马里恩等，2009年a). 这类似于OIS期间发生的情况，异常DNA复制导致DDR激活。然而，四种Yamanaka因子在人类成纤维细胞中的表达导致8-氧鸟嘌呤加合物的积累，这通常是氧化应激的结果，并且c-MYC在主要依赖于ROS的细胞中诱导DNA损伤(瓦法等, 2002)而不是DNA复制依赖方式(埃格莱等, 2005). 因此，重编程时发生的DNA损伤不仅可能是由异常的DNA复制引起的，还可能是由ROS的产生引起的，这将解释为什么在低氧条件下重编程更有效(尤蒂卡尔等, 2009;吉田等, 2009).

除了激活p53外，我们小组还观察到p16^INK4a公司在人类成纤维细胞中四种山中因子的早期表达诱导(巴尼托等, 2009). 尽管p16上调的机制^INK4a公司还需要进一步研究，它涉及染色质重塑，包括细胞周围H3K27met3标记的丢失墨水4b/自动射频/INK4a公司轨迹。重编程时观察到组蛋白脱甲基酶JMJD3的上调可能是这种表型的部分原因(巴尼托等, 2009)，这与RAS诱导衰老期间观察到的结果极为相似(阿格尔等, 2009;巴拉达等, 2009). 这个墨水4b/自动射频/INK4a公司iPSCs和ESCs中的Polycomb组蛋白表观遗传抑制该位点(巴尼托等, 2009;锂等, 2009)，提出了以下问题：墨水4b/自动射频/INK4a公司如果有压力积累突变或通过异常的DNA甲基化使其沉默，该位点在多能干细胞中会被正确地重新编程。在这方面，塞拉诺小组的工作表明，它经过了适当的重新编程；多能干细胞重设细胞的表观遗传状态墨水4b/自动射频/INK4a公司基因座，获得与ESCs中观察到的相似的表观遗传标记(锂等, 2009). 这种情况类似于重新编程过程中端粒的重置；与衍生iPSCs的体细胞的端粒相比，iPSCs端粒被拉长，并且还经历了表观遗传标记的重塑，以与ESC端粒相似(马里恩等2009年b). 尽管这些观察结果表明，在没有不可逾越的压力的情况下，重新编程是可能的，因为在对细胞增殖至关重要的基因座上积累遗传改变，有必要通过分析其表观遗传状态或在重组iPSC的较大样本中对其进行测序来确定在重编程期间激活的任何关键抗增殖肿瘤抑制基因是否发生突变。

在重编程过程中激活的一些标志性基因对不同的抗增殖反应是共同的，例如凋亡、衰老或其他形式的细胞周期阻滞，这就提出了重编程触发哪种抗增殖反应的问题。答案可能很复杂。表达重编程因子的小鼠和人类成纤维细胞发生细胞周期阻滞，表现出多种衰老特征，例如具有SA-β-Gal活性或SAHFs的细胞比例很高。此外，p16的上调^INK4a公司进一步表明，阻滞类似于衰老，如p16^INK4a公司在衰老过程中特异性上调，但在其他类型的细胞周期停滞中不上调。因此，我们认为谈论重编程诱导衰老（RIS；巴尼托等, 2009). 除了衰老外，重编程因子还可以触发细胞凋亡(图2); 例如，BAX因OCT4、SOX2和KLF4的表达而上调，其拮抗分子BCL2的表达可提高重编程效率(川村等, 2009). 其他报告表明，重编程因子的表达与诱导DNA损伤协同作用，从而触发凋亡，尤其是在端粒极短或因暴露于外源性DNA损伤剂（如紫外线或电离辐射）而致敏的细胞中。在这种情况下，BCL2的表达将这些细胞的重新编程能力恢复到与控制细胞类似的水平(马里恩等，2009年a). 因此，重编程受到肿瘤抑制过程中发生的抗增殖反应的限制，其中既涉及衰老，也涉及凋亡。

通过控制衰老调节重编程

衰老和凋亡在重编程过程中被触发的一个推论是，抑制这些反应可以提高重编程的效率。事实上，Park和他的同事是第一批描述人类成体细胞（例如成纤维细胞）通过使用四种Yamanaka因子结合SV40大T抗原（SV40 LT）和/或hTERT，重新编程为ESC样多能干细胞的人(公园等, 2008); 这两个附加因素都参与衰老控制。一些研究小组随后表明，敲低人类或小鼠细胞中的p53基因可以显著提高重新编程的效率(巴尼托等, 2009;商行等, 2009;川村等, 2009;马里恩等，2009年a;尤蒂卡尔等, 2009;赵等, 2008). MDM2或p53显性阴性突变的表达也会导致重编程增强，而通过不同策略激活p53则会降低重编程效率(川村等, 2009;马里恩等，2009年a)强调控制p53活性对调节重编程的重要性。同样，低水平-或p16缺失^INK4a公司或第21页^CIP1级表达导致小鼠和人类细胞中更高效、更快的重新编程(巴尼托等, 2009;锂等, 2009;尤蒂卡尔等, 2009).

Jaenisch小组最近表明，通过使用辅助iPSC系统，重新编程是一个可以加速的随机过程(图1)B细胞的克隆扩增(汉娜等, 2009). 他们得出结论，所有细胞都有可能被重新编程为多能性细胞。有趣的是，作者认为，通过抑制p53/p21轴来加速重编程严格取决于它们调节细胞周期进展的能力，这可能是次级iPSC重编程系统的情况(汉娜等, 2009). 然而，其他实验表明，这些细胞的长期增殖潜力，也许还有其他因素，也有助于这种效果，因为不含p53的MEF在0.5%血清中生长，比在15%血清中生长的野生型MEF产生更多的iPSC集落，尽管后者生长更旺盛(尤蒂卡尔等, 2009).

衰老和重编程是紧密交织在一起的过程：对年轻细胞和老年细胞重编程能力的直接比较表明，细胞越接近衰老的开始，因此p16的水平越高^INK4a公司和第21页^CIP1级他们表示，对其进行重新编程更为困难。老年小鼠的成纤维细胞，表达高水平的墨水4b/阿尔夫/墨水4a基因座产物生成iPSC的效率较低(锂等, 2009)，进一步将衰老与重新编程效率下降联系起来。类似地，在后期进行的实验Terc公司^−/−端粒极短的MEF强调了对已经老化或受到压力的细胞进行重新编程的困难(马里恩等，2009年b). 这些结果对从老年人身上获得用于治疗目的的iPSCs具有指导意义。端粒生物发生缺陷患者（如先天性角化不良（DC）患者）的细胞重新编程也效率低下(阿加瓦尔等, 2010). DC是由dyskerin基因的突变引起的，该基因对稳定TERC水平和维持端粒内环境稳定至关重要。令人惊讶的是，从DC细胞成功获得的iPSCs仍然可以上调TERC的表达，恢复端粒的伸长(阿加瓦尔等, 2010).

重编程和肿瘤抑制因子之间的关系在不同层面上都很有趣，并且突出了重编程过程对细胞的压力。尽管通过干扰关键的抗增殖基因可以显著提高重编程的效率，但破坏细胞内肿瘤抑制机制的后果太过不利，无法考虑，因为它会影响产生的iPSC的安全性。事实上，iPSC来源于第53页^−/−MEF增加了染色体不稳定性(马里恩等，2009年a). 复杂的小鼠模型表明，我们可以从理论上利用衰老在抑制肿瘤方面的积极作用，同时避免不必要的副作用，如过早衰老(Serrano&Blasco，2007年). 因此，还可能存在一种明智的替代方案，以从阻止衰老中获益，从而提高重编程效率，同时又不损害所产生iPSC的完整性和安全性。一种可能是通过使用小干扰RNA或化学化合物暂时抑制衰老。另一种可能性是在重新编程期间影响触发衰老的特定途径。在这方面，在低氧条件下对细胞进行重新编程(尤蒂卡尔等, 2009;吉田等, 2009)或在抗氧化剂（如维生素C）的存在下(埃斯特班等, 2010)-已经证明可以增强iPSC的生成。维生素C可以缓解RIS，这表明抗氧化剂或其他暂时抑制衰老而不会永久性抑制肿瘤的化合物可以用于安全地改善重编程。我们预计，在制定旨在加强重编程的补充战略的同时，避免重编程过程中出现的反扩散障碍将成为该领域深入研究的重点。

多能性、重编程和转化

除了技术含义之外，上述结果揭示了重编程和肿瘤发生之间的关系，阐明了有趣的生物过程。大多数肿瘤都有p53和p16缺陷^INK4a公司/RB通路，可以增强和加速重编程。因此，很容易推测这种能力对于肿瘤的启动或维持是必要的。人们相信，在许多癌症类型中，肿瘤的生长和繁殖是由所谓的癌症干细胞（CSC）维持的。CSC最初在白血病中被发现(拉皮多特等, 1994)后来证明对某些实体肿瘤至关重要(古普塔等, 2009)，尽管它们与黑色素瘤等其他肿瘤的相关性尚不清楚(金塔纳等, 2008). CSC是肿瘤细胞的一个亚群，具有自我更新和维持肿瘤生长的能力(克拉克等, 2006). 因此，p53或p16的改变似乎是合理的^INK4a公司/RB通路对肿瘤发生有影响，不仅影响增殖，而且有助于将体细胞重新编程到更去分化状态或增加CSC库。事实上，p53的缺失与CSC某些特性的获得有关，例如调节自我更新分裂的极性(奇卡莱塞等, 2009). 有趣的是，三种RB家族蛋白的缺失触发了MEF的重新编程，以生成CSC样细胞，而类似CSC的细胞甚至可以从只缺少RB的MEF中生成，如果它们被迫生长超过接触抑制(线路接口单元等, 2009).

多能性和肿瘤发生之间的关系错综复杂。胚胎干细胞来源于胚胎内细胞团的细胞，这些细胞在培养中被迫生长。因此，它们可以代表自然界中不存在的细胞类型；事实上，它们与肿瘤细胞具有相同的特征。胚胎干细胞（ESC）是一种致瘤细胞，其对应物是胚胎癌细胞，当将其注射到裸鼠体内时会导致畸胎瘤，这一测试被用作多能性的最终证据。c-MYC和KLF4是众所周知的致癌基因，与多能干细胞的生成和干细胞的自我更新有关，这进一步强调了多能干性和致瘤性之间的相似性。此外，其他重编程因子，如SOX2和LIN28，最近被证明分别是肺和食管鳞癌和细菌细胞肿瘤的致癌基因(低音的等, 2009;西部等, 2009). 侵袭性低分化肿瘤也表达高水平的ESC相关因子(Ben-Porath公司等, 2008). 上皮性肿瘤中某些癌基因（如c-MYC）的表达足以重新激活ESC样转录信号。综上所述，这些观察结果表明，在肿瘤进展过程中，会发生重新编程到更去分化状态(Wong（王）等, 2008)并且可能会受到关键肿瘤抑制因子的改变的青睐。如果干细胞样特性的获得与肿瘤的发生密切相关，那么有理由认为，由重编程因子表达触发的机制（最终导致重编程）会引发肿瘤抑制通路，从而保护细胞免受不受控制的生长。事实上，细胞对重编程因子或干细胞特异性基因表达的反应模拟了OIS期间观察到的衰老反应，强调了RIS和OIS之间的相似性(图3). 在我们完全了解多能性和致癌转化之间的这种有害联系之前，在治疗上使用多能干细胞显然是不安全的。

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图3

重编程到多能性和致癌转化之间的相似性。(A类)癌基因的异常表达会触发原代细胞的衰老（OIS），从而限制致癌转化。重编程因子的表达也会触发衰老（RIS），限制重编程的效率。(B类)因此，当衰老被禁用时，细胞更容易发生致癌转化或重新编程。OIS，肿瘤诱导衰老；RIS，重编程诱导的衰老。

结论

对直接细胞重编程到多能性的初步分析已经产生了一些关于该过程如何工作的机械线索，我们正开始使用这些线索来改进这项技术。巧合的是，对重编程过程的研究出人意料地揭示了新的信息，例如，多能性和转化之间的联系(提要栏A). 重新编程的研究可能也会增加我们对基础生物学关键方面的理解，而重新编程通常被视为一项具有广阔应用前景的显著人工技术(Ramalho-Santos，2009年). 事实上，驱动致癌进展的相同改变可以影响体细胞对CSC或iPSCs的重编程，这表明安全iPSCs可能会带来巨大挑战。

致谢

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