艾滋病Res-Hum逆转录病毒。2009年2月；25(2): 207–212.
强效HDAC抑制剂Suberoylanilide Hydroxamic Acid诱导潜伏性HIV的表达
,1 ,2 ,1 ,1 ,2和
1 南西·M·阿尔金
1北卡罗来纳大学教堂山分校，北卡罗来纳州教堂山27599。
艾米·埃斯佩塞思
2默克研究实验室，西点军校，宾夕法尼亚州，19486。
丹尼尔帕克
1北卡罗来纳大学教堂山分校，教堂山，北卡罗来那州27599。
曼祖尔干酪
1北卡罗来纳大学教堂山分校，教堂山，北卡罗来那州27599。
达里亚·哈祖达
2默克研究实验室，西点军校，宾夕法尼亚州，19486。
大卫·M·马戈利斯
1北卡罗来纳大学教堂山分校，教堂山，北卡罗来那州27599。
1北卡罗来纳大学教堂山分校，教堂山，北卡罗来那州27599。
2默克研究实验室，西点军校，宾夕法尼亚州，19486。
通讯作者。 将转载请求发送至：David Margolis，北卡罗来纳大学教堂山分校，3302 Michael Hooker研究中心，教堂山，北卡罗莱纳州27599-7435。电子邮件：ude.cnu.dem@ogramd 摘要
组蛋白去乙酰化酶（HDAC）作用于人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）核小体结合启动子内的组蛋白，以维持前病毒潜伏期。HDAC抑制导致启动子表达和HIV逃避潜伏期。我们评估了最近获准用于肿瘤学的有效抑制剂亚甲酰苯胺羟肟酸（SAHA；Vorinostat）的能力，该抑制剂对I类HDAC具有选择性，可诱导细胞系中HIV启动子的表达和静止CD4产生病毒+抗逆转录病毒治疗的禽流感病毒感染患者的T细胞。在J89中，一个Jurkat T细胞系感染了一个HIV基因组，该基因组编码HIV基因组内增强型绿色荧光蛋白（EGFP），SAHA在染色质免疫沉淀（ChIP）分析中诱导HIV启动子的核小体1发生变化，与EGFP表达一致。在静止的CD4中+经抗逆转录病毒治疗的禽流感病毒感染患者的T细胞临床上可以接触SAHA诱导的病毒生长体外这些结果表明，有效、选择性的HDAC抑制剂可以改善对持续性前病毒感染的靶向性，并为体内使用SAHA的研究。
介绍
U型pon人类免疫缺陷病毒型1（HIV-1）感染，一种潜伏感染的静息CD4细胞+T细胞的建立使得目前的抗逆转录病毒治疗（ART）无法根除HIV感染。1–三病毒DNA整合到细胞基因组后，HIV长末端重复序列（LTR）启动子以核小体结合构象存在，在没有刺激的情况下转录沉默。4–6HIV LTR的转录激活涉及HIV调节蛋白和细胞转录因子之间的复杂相互作用。
真核DNA浓缩成染色质，其基本单位核小体由包裹在组蛋白八聚体上的DNA组成。组蛋白的翻译后修饰对基因表达的调控至关重要。组蛋白的氨基酸尾部可以在赖氨酸残基上乙酰化、酰化和泛素化，在赖氨或精氨酸残基上甲基化，在丝氨酸/苏氨酸残基上磷酸化。7–14这些不同的修饰有助于将特定的调节复合物募集到DNA中，从而上调或下调基因表达。
一些研究证明组蛋白脱乙酰酶（HDAC）是HIV潜伏期的关键调节因子。人类转录因子将I类HDAC组蛋白去乙酰化酶1招募到LTR。HDAC1介导染色质重塑，导致LTR启动子表达和病毒生成受到抑制。当HDAC抑制导致LTR激活时，HDAC1在HIV-1上的作用需要维持前病毒平静。15–18
HDAC1可通过至少四种机制被招募到LTR中：通过包含转录因子YY1和LSF的复合物、包含c-Myc和Sp1的复合物，通过CBF-1，或通过NF-κB p50同源二聚体。17–21阻断HDAC1对LTR的补充或用弱HDAC抑制剂丙戊酸（VPA）抑制该酶可诱导静止CD4的病毒生长+抗逆转录病毒疗法治疗的艾滋病病毒感染者的T细胞。22–24
这些观察结果导致了HDAC抑制剂作为一种潜在的治疗手段来阻断潜在的HIV感染的探索。将丙戊酸钠与强化ART联合应用于经ART治疗的禽流感病毒感染者，导致四分之三的患者的静息细胞感染（RCI）减少。25然而，我们小组和其他人的进一步研究26–28发现接受丙戊酸钠治疗的标准抗逆转录病毒治疗的患者中，RCI很少出现中度耗竭。由于丙戊酸是一种弱且非特异性的HDAC抑制剂，我们探索了一种更有效且选择性更强的HDAC抑制物的潜力，将其用作针对持续性HIV感染的治疗工具。
亚甲酰苯胺羟肟酸（SAHA；vorinostat）是HDAC抑制剂羟肟酸类的成员。29这种有效的HDAC抑制剂最近被FDA批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤。30,31SAHA对1类HDAC 1、2、3和8具有选择性，对II类HDAC 6、10和11具有一定活性，但在临床可达到的浓度下，对II级HDAC 4、5、7和9没有活性。
I类HDAC调节HIV LTR表达。17–21,32因此，SAHA可能提供了调节HIV基因表达的可能性，但与全局非选择性HDAC抑制相比，SAHA对宿主基因的影响较小。我们评估了SAHA重塑HIV启动子染色质的能力，在细胞系中诱导HIV启动子表达，并允许病毒从静止的CD4中恢复+禽流感病毒感染者的T细胞。我们的研究结果为研究SAHA联合ART对禽流感病毒感染患者持续感染HIV的影响提供了理论依据。
材料和方法
细胞培养和染色质免疫沉淀（ChIP）
J89电池33和外周血单个核细胞（PBMC）按所述进行培养。27,34400万个J89细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗，并用3 mM VPA（西格玛，圣路易斯MO）或500 nM SAHA（密歇根州西点军校默克研究实验室的礼物）或单独在培养基中培养4小时34进行了以下修改。将超声细胞裂解物离心，并将80–100μg可溶性染色质与5μl抗乙酰组蛋白3或抗乙酰组分4（Ac-H3、Ac-H4、Milipore）或5μl反HDAC-1（Abcam，Cambridge，MA）或兔免疫前免疫球蛋白g（Sigma）孵育过夜。用以下引物进行PCR：LTR-109F（5′-TACAAGGGACTTTCCGCTGG-3′）和LTR+82R（5′-AGCTTTATTAGGCTTAAGC-3′）。ChIP产物的实时定量PCR分析20使用以下引物：LTRrt9 forward（5′-AGCCCTCAGATGCTAATAAGCA-3′）和LTRrt8（5′-TAGCCAGAGCTCCACACTAGA-3′）验证HDAC1和乙酰化组蛋白在HIV-1 LTR区域的占有率变化的意义。通过将每个反应的周期阈值与输入DNA生成的标准曲线进行比较，确定输入HIV LTR DNA的百分比。减去用非特异性IgG测量的背景免疫沉淀后，计算LTR处乙酰化组蛋白和HDAC1占位相对于未处理对照组的折叠变化。
LTR驱动的GFP mRNA测量
将J89细胞与选定的药物浓度孵育4–5小时。将细胞洗涤并在乙醇干冰浴中快速冷冻，并在−80°C下储存直至使用。根据制造商的方案，在冰上解冻细胞，并使用RNeasy RNA分离试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚的齐亚根）分离RNA。使用上标II（Invitrogen）合成cDNA。如前所述，使用一组引物对EGFP进行半定量PCR。35使用以下引物在相同的cDNA样品上测量内源性GAPDH：GAPDH-RT-FOR，5′-CAAGTGAAGGCTGGGG-3′和GAPDH-RT-REV，5′-CAAAGTCATGGACC-3′。PCR产物在8%琼脂糖凝胶中进行解析，通过溴化乙锭染色进行可视化，并通过GeneTools进行分析。通过归一化GAPDH和差异来确定折叠GFP的富集(n个-倍数）。
为了测量PBMC和J89细胞在药物存在下的增殖和生存能力，按照制造商的说明，使用细胞增殖试剂盒对细胞进行MTT分析（印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）。从无药培养基中培养的细胞计算细胞增殖百分比。
限制潜在感染CD4的稀释培养+HIV感染供体的T细胞
通过连续流白细胞减少法获得淋巴细胞。静息CD4的分离+对T细胞和具有复制能力的病毒进行回收和定量。简言之，通过Ficoll梯度和静止CD4从脱水产物中分离出PBMC+如前所述，通过阴性选择纯化T细胞。23,25,27流式细胞术检测分离的静止T细胞的纯度；细胞常规>98%CD4+表达活化标记的不到0.5%。
纯化后，静止的CD4+将T细胞与HIV整合酶抑制剂L-870812和依法韦伦或阿巴卡韦培养2天。27然后将细胞置于250万、50万和10万的重复稀释液中，以估算RCI的频率。最大有丝分裂原刺激被广泛用于量化静息细胞感染的频率，因此用1μg/ml PHA-L（Remel）、5倍于血清阴性供体的异基因辐照PBMC和100 U/ml IL-2刺激细胞。为了测量HDAC抑制后的生长频率，将细胞暴露于40μM VPA或250–335 nM SAHA。SAHA和VPA的浓度是在测量组织培养条件下的游离药物浓度（数据未显示）后选择的，选择的浓度与患者可达到的游离药物的浓度相当。
此外，为了确保细胞外生长不会归因于可能存在于如此大量细胞中的罕见的未复发感染细胞，细胞在20 U/ml的IL-2存在下并行培养。如果IL-2的“存活”浓度在0.3 log以内，则细胞外生长的频率10在VPA或SAHA存在下的外生长频率中，HDAC抑制剂存在时的外生长被认为是非特异性和不显著的。这种情况很少发生，只有在静息细胞感染频率很低的患者中才会发生。如前所述，27在PHA刺激后筛选出CCR5充分表达的HIV血清阴性PBMC通过白细胞减少法收集并保存在等分样品中，并使用匹配的患者样本对或等分样品对进行分析，以减少分析间的差异。使用最大似然法计算每十亿静止CD4的感染单位+接触PHA或SAHA后的T细胞。36
结果
SAHA诱导HIV LTR染色质改变导致LTR表达
由于HIV整合物在患者细胞中太少，无法研究染色质，我们研究了SAHA在J89细胞LTR处诱导的修饰，J89细胞是一种潜在感染的Jurkat T细胞系，具有完整的前病毒基因组。33病毒基因组还编码EGFP作为HIV-LTR表达的标记。我们比较了SAHA和VPA诱导Nuc1乙酰化的能力，以及通过ChIP测量改变HDAC1向Nuc1区域募集的能力。仅在处理4小时后对细胞进行检测，以避免由于宿主细胞循环或宿主基因表达的二次变化而产生的检测效应。
在培养基、3 mM VPA或500 nM至1μM SAHA中培养4 h后，采集J89细胞进行ChIP，并通过实时PCR定量DNA产物。代表性分析如所示SAHA和VPA均诱导HIV-LTR Nuc-1组蛋白3乙酰化增加（SAHA为10.1倍）。类似地，HDAC1的占用率下降（SAHA为31.3倍），正如我们之前描述的VPA暴露后。18测量组蛋白4的乙酰化时也得到了类似的结果（数据未显示）。
与VPA一样，SAHA增加了Nuc 1的乙酰化，并降低了HDAC-1在HIV-1 LTR中的占有率。用培养基、3mM VPA或500nM SAHA处理4小时的J89细胞通过用抗乙酰化H3、抗HDAC-1的染色质免疫沉淀进行测定。为了证明这种半定量分析中明显的定量变化是显著的，通过实时PCR对ChIP的DNA产物进行了三次定量。分析是3个独立实验的代表，显示了相对于未处理对照的折叠变化的实时定量。
然后我们比较了经SAHA和VPA处理的J89细胞中LTR-driven GFP mRNA的表达。仅在治疗4小时后再次对细胞进行分析。提取总RNA，PCR检测GFP RNA表达。如所示暴露仅4小时后，SAHA和VPA均诱导LTR驱动的GFP mRNA表达。与SAHA的更大效力一致，GFP是由纳米摩尔浓度的SAHA诱导的，而不是由摩尔浓度的VPA诱导的。同样，SAHA和VPA均诱导LTR-驱动的GFP蛋白表达（未显示）。
SAHA激活HIV LTR转录。用指定浓度的SAHA或VPA处理J89细胞4小时。按照方法所述，对从处理和未处理细胞中分离的总RNA进行半定量RT-PCR。给出的数据是3个独立实验的平均值±SE。
SAHA诱导静止CD4的病毒生长+禽流感病毒感染者的T细胞
通过白细胞减少法从5名感染禽流感病毒的患者中获得淋巴细胞，CD4 T细胞计数为529至960个/μl。使用严格的分析来量化静止的CD4+我们检测了SAHA在患者静止T细胞中诱导HIV表达的能力。23
SAHA主要与白蛋白结合。在人类血浆中，71%的SAHA与蛋白质结合。当在含有10%FCS的组织培养基中测量时，只有5%的VPA与蛋白质结合（数据未显示）。虽然SAHA在培养基中没有此类数据，但我们保守地假设了类似的蛋白质结合程度。服用400 mg剂量的患者体内SAHA的蛋白结合峰值浓度估计为340 nM（Vorinostat Package Insert，Merck&Co.，2006）。为了近似这种暴露在体外，我们在组织培养中测试了250–335 nM SAHA（238–318 nM非结合药物浓度）。这些浓度不会显著影响J89细胞或PBMC的增殖(). SAHA的微摩尔浓度通常需要诱导肿瘤细胞凋亡在体外.37
SAHA对血清阴性供体PBMC和J89细胞的毒性。PBMC或J89细胞在指定浓度的SAHA或VPA存在或不存在的情况下培养。如方法中所述进行MTT测定。与标准培养基中培养的细胞相比，计算增殖细胞的百分比。数据表示3个独立实验的平均值±SE。
在这些条件下，检测了五分之四的患者中SAHA诱导的病毒生长，尽管并非总是在最大有丝分裂原刺激后出现的频率(). 患者1和3的RCI频率是在一个月或更长时间间隔的两个单独的时间点测量的，病毒在单独的检测中以可比较的频率恢复。考虑到我们分析的0.3 log方差，27患者2-4在接触SAHA后的HIV恢复与最大刺激24小时后的恢复相似，而患者1的恢复频率稍低。在通过最大有丝分裂原刺激测量的低RCI患者（患者5）中，在用于促进细胞存活的IL-2浓度（20U/ml）存在的情况下，病毒恢复不高于背景水平。
表1。
从静止的CD4中恢复HIV+暴露于SAHA、VPA或最大有丝分裂原激活后从禽流感、ART治疗的HIV感染个体中分离的T细胞
每十亿艾滋病毒感染单位+供者静止CD4+暴露于HDAC抑制剂或丝裂原后表达HIV的T细胞
|
|---|
| 患者 | SAHA（250–335 nM） | VPA（40微米） | 最大有丝分裂原一 |
|---|
| 1访问A | 3560 | >3560 | 17950 |
| 1访问B | 4540 | 3220 | 11340 |
| 2 | 543 | 703 | 1243 |
| 三访问A | 561 | 尚未完成 | 487 |
| 三访问B | 410 | 223 | 440 |
| 4 | 280 | 179b条 | 426 |
| 5 | 未恢复c（c） | 未恢复 | 45 |
此外，为了模拟临床剂量的SAHA可能产生的影响体内，我们测量了体外接触药物。SAHA的半衰期很短体内，并且当在喂食状态下接受400mg/天的多次剂量的癌症患者中测量时，为2小时（Vorinostat Package Insert，Merck&Co.，2006）。为了模拟临床暴露于SAHA的影响，我们测量了静息CD4类似脉动暴露后可恢复病毒的频率+HDAC抑制剂。另外两名患者的静止细胞暴露于SAHA中3或6小时。然后按照上述方法清洗细胞并与CD8-缺失的PBMC共培养。根据标准分析条件，将脉冲暴露后的病毒生长与持续暴露于有丝分裂原刺激24小时的细胞中的病毒恢复进行比较(). 在两个患者样本中，模拟临床剂量的SAHA脉冲暴露可使HIV从静止的CD4中恢复+T细胞。由于这些患者可获得的细胞较少，我们无法定量比较RCI的频率；其点估计不太准确。然而，短暂接触SAHA后病毒恢复的频率高于背景IL-2。
表2。
从静止的CD4中恢复HIV+与最大有丝分裂原激活24小时暴露相比，SAHA脉冲暴露3或6小时后从禽流感、ART治疗的HIV感染个体中分离的T细胞
每十亿静止CD4感染单位+T细胞
|
|---|
| 患者 | 撒哈拉沙漠一 | 最大有丝分裂原b条 |
|---|
| 6 | 162（3小时） | 1160（24小时） |
| 7 | 295（6小时） | 360（24小时） |
理想情况下，用于减少患者持续感染HIV的药物不得诱导激活标记物的表达或上调未感染细胞上HIV进入辅受体的表达，因为这会使这些细胞更容易受到从头开始感染。为了确定SAHA对细胞表面活化标记物的影响，PBMC暴露于有IL-2存在的静息细胞检测中使用的SAHA浓度，并检测细胞表面标记物。将结果与丝裂原和IL-2或IL-2单独刺激的细胞进行比较。与暴露于对照IL-2和有丝分裂原的细胞相比，暴露于335nM SAHA的PBMC并未显著改变CXCR4、CCR5、CD69和Ki67的表达（数据未显示）。最后，在SAHA存在或不存在的情况下，被感染的活化细胞或静止细胞中的HIV p24抗原输出没有差异（数据未显示）。
讨论
长期潜伏感染的静息记忆T细胞群在感染早期形成，不受免疫反应和抗逆转录病毒的影响。如果要根除艾滋病毒感染，就必须针对这种持续存在的蓄水池进行治疗。一种维持静止CD4前叶静止的机制+T细胞是HDAC在病毒启动子处的活性。
我们研究了SAHA（一种有效的HDAC抑制剂）在潜伏期细胞系模型中诱导LTR表达和从CD4诱导病毒的能力+禽流感病毒感染者的静止T细胞。我们的结果表明，SAHA暴露导致核小体1处的染色质乙酰化，并降低HDAC1占有率。这与已知的HDAC和组蛋白乙酰转移酶的反调节相互作用一致，38在慢性感染的转录静止细胞系中导致HIV转录和病毒生成。理想情况下，最好测量受感染的静止CD4的染色质变化+禽流感病毒感染者的T细胞。然而，考虑到这种细胞的低频率，这种测定在技术上是不可行的。
临床相关浓度的SAHA诱导病毒生长体外来自禽流感病毒静止T细胞+患者。事实上，鉴于SAHA的半衰期较短，值得注意的是，即使短暂接触HDAC抑制剂，也足以从患者细胞中恢复具有复制能力的HIV。SAHA对组蛋白乙酰化和病毒生长的影响是通过使用临床用药中持续达到的药物纳米摩尔浓度来实现的。
众所周知，SAHA可以改变转化细胞系中2–10%基因组的表达。29然而，SAHA对造血系细胞表面活化标记物表达的影响尚不清楚。用于清除持续HIV感染的理想药物不应使旁观者细胞更容易感染从头开始通过诱导细胞表面活化标记物的表达进行感染。SAHA暴露不会上调PBMC中激活的表面标记物或HIV感染受体。此外，病毒粒子的产生从头开始SAHA对感染没有影响。
在一些患者（但不是全部）的细胞中，SAHA暴露后HIV的恢复与最大有丝分裂原刺激后的恢复相当。这些研究还不能解决是否需要额外的信号，如激活NF-κB信号的信号，来完全清除静息CD4细胞中的感染。
消除艾滋病毒感染应该是一个治疗目标，尽管这可能是一个遥远的目标。慢性抑制性抗病毒治疗是一种复杂且充满毒性和成本的治疗方法。选择性诱导潜伏的艾滋病毒可能使抗逆转录病毒药物和免疫反应清除艾滋病毒感染。使用强效和选择性HDAC抑制剂（如SAHA）结合强化ART治疗可有效清除持续的HIV感染。
致谢
我们感谢A.Duff和N.Cheng、L.Ngo的研究协调、A.Kashuba、S.Fiscus、M.Kerkau、F.Ashton以及UNC CFAR药理学、病毒学、免疫学和临床核心设施，以及UNC血库的专职工作人员。该研究的资金由美国国立卫生研究院AI064074向D.M.M.提供，R00046向UNC GCRC提供，U54RR024383向UNC CTSA提供，AI50410向UNC CFAR提供，NIH T32AIO7151向N.M.A.提供。最重要的是，如果没有研究志愿者的无私贡献，这一努力是不可能实现的。
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