记忆的获得、保持和更新依赖于中枢神经系统中的细胞机制，这种机制将经历激发的突触活动与突触强度的改变结合起来(马利诺和马伦卡，2002年;马伦卡和熊，2004年). 相反，有强有力的证据表明，与阿尔茨海默病（AD）相关的记忆障碍是由神经元丧失之前的突触生理学缓慢但渐进的变化引起的(Selkoe，2002年;Selkoe和Schenk，2003年). 最近，我们发现AD动物模型显示海马棘内AMPA受体水平降低，同时空间记忆缺陷，突触生理损伤，淀粉样β（Ab）斑块沉积(Chang等人，2006年). AD病理学，包括海马突触后棘内AMPA受体亚单位的减少，在第14个月时已明显可见，但病理学的某些方面可能会提前几个月出现。我们试图确定在疾病发作时对突触可塑性施加的限制。为此，我们在AD病理学相关联的突触和行为缺陷出现之前，观察了突触后棘内的化学和分子变化。
我们在先前研究和本研究中使用的家族性AD（FAD）动物模型是通过靶向敲除两个基因（2xKI）生成的，一个基因编码突变的淀粉样前体蛋白（APP；K670N/M671L，带有人源化淀粉样β序列的瑞典突变），另一个基因则编码突变的早老素-1（P264L；Flood等人，2002年). 这种基因靶向技术确保突变基因的表达由内源性启动子控制，因此不会过度表达，也不会缺少内源性野生型（WT）基因。因此，研究表明，从6个月开始，抗体斑块呈线性增加(Chang等人，2006年). 同样的研究也描述了这种2xKI模型中AD-like病理的出现和进展。根据这项研究，我们现在知道，到出生后第二个月，在脑匀浆上清液中可以检测到抗体的可溶性形式（sAb42和sAb40），并且在6-9个月时增加了四倍。LTP表达不足在7-9个月后才明显，而空间记忆缺陷和海马AMPA受体mEPSCs减少在9-12个月后才能测量到。我们推断，6个月是识别突触变化的理想年龄，突触变化是由sAb升高引起的，而sAb的升高开始对突触生理学产生限制。
越来越多的研究表明，突触可塑性与突触后棘的结构变化密切相关。Kasai等人已经表明，较大的棘在形态上是稳定的，而较小的棘在LTP诱导后更容易扩大。根据这些观察结果，Kasai等人认为较小的棘是记忆获取的场所，而较大的棘是存储记忆的场所(松崎等人，2001年,2004;Kasai等人，2003年). 这些想法使我们假设，2xKI小鼠的突触可能在突触活动与突触后棘结构变化之间的机制中受损。
一种被提议参与突触活动和脊椎形态之间联系的蛋白质是F-actin结合蛋白，drebrin(Shirao和Sekino，2001年;Shiraishi等人，2003年;Takahashi等人，2003年,2005;Fujisawa等人，2006年;小岛，2007;Sekino等人，2007年). 这种蛋白质在兴奋性突触的突触后侧富集(青木等人，2005年). drebrin有两种亚型：drebrinE，在胚胎期的多种细胞类型中表达；drebrinA，是神经元特异性的，在成年期成为主要亚型。当drebrin A在非神经元细胞中表达时，会出现类似神经突的过程(Shirao等人，1992年)而培养的海马神经元中drebrin A基因的下调会导致脊椎密度降低、脊椎宽度减小以及靶向脊椎的NMDA受体受到抑制(Takahashi等人，2005年). AD患者大脑皮层和海马内Drebrin（A或E亚型）减少(Harigaya等人，1996年;Hatanpaa等人，1999年;Shim和Lubec，2002年;Calon等人，2004年)并开始在患者被诊断为轻度认知障碍的阶段显示出区域特定水平的变化(Counts等人，2006年). 在大鼠的新皮层和小鼠的边缘皮层中，含有drebrin A的棘更大(Fujisawa等人，2006年;小林等，2007年). 这些想法和以前的观察结果使我们预测，在2xKI小鼠海马体中可测得的AMPA电流减少9个月后，drebrin A的丢失可能先于空间记忆缺陷、突触可塑性受损和AMPA电流降低。因此，我们比较了含有drebrin A的2xKI大脑样本与与大脑区域和年龄相匹配的WT样本中脊柱的比例。
在被诊断患有AD的患者的大脑中，边缘皮层和海马体相对于初级运动皮层和初级感觉皮层更早发生退化和化学变化(Braak和Braak，1991年;Counts等人，2006年). 我们之前对2xKI大脑初级体感皮层的超微结构检查表明，即使在18个月或更大的年龄，也没有兴奋性突触丢失或脊髓内drebrin A减少的迹象(Mahadomrongkul，2005年). 在本研究中，我们分析了海马的突触神经膜，以便将超微结构数据与之前从2xKI小鼠海马收集的电生理数据联系起来。为了确定FAD模型小鼠的皮层是否也表现出与AD相关的病理学区域差异，我们将分析扩展到内嗅皮层，即皮层的边缘区域之一。
我们在这两个区域的测量结果与我们关于2xKI大脑中drebrin A多刺水平的预测一致。我们还观察到两个大脑区域的drebrin A水平和脊柱大小的变化方式存在细微差异。我们讨论了这些变化如何导致活动依赖性突触受体水平微调减少和记忆功能障碍。
材料和方法
动物
实验中使用的所有小鼠均为雄性。本研究中使用的FAD小鼠模型是纯合的2xKI小鼠，表达携带家族性AD突变的APP和早老素-1（PS1）基因（APP荷兰荷兰语和PS1第264页). 为了与WT小鼠进行比较，我们使用了相同背景菌株（129/CD-1）的小鼠。Cephalon（宾夕法尼亚州西切斯特）慷慨地为我们提供了2xKI突变小鼠和年龄和背景相匹配的WT小鼠。这些动物被安置在纽约大学（NYU）的动物设施中，为期1天至18个月。在到达设施之前和之后，按照国家卫生院的规定，对动物进行12:12小时的光/暗循环饲养、自由喂食和照顾实验动物护理和使用指南以及纽约大学动物护理和使用委员会批准的指南。
我们收集了三个年龄组的大脑样本。2xKI小鼠的数量和年龄如下：4只3-4个月龄，2只6个月龄和3只18个月及以上（>18个月）龄。两只WT动物的年龄为3-4个月，两只为6个月，三只大于18个月（>18个月）。首先用戊巴比妥（70 mg/kg）深度麻醉动物，然后用4%多聚甲醛和1%戊二醛的混合物经心灌注，以制备这六个年龄基因型组的脑样本。
drebrin A抗体
兔抗德勒布林A抗体DAS2是针对成年型德勒布林特异性肽（残基325–336）产生的，该肽在小鼠、大鼠和人类中是相同的。该抗体由抗原肽亲和纯化；以前的蛋白质印迹显示，可以识别与drebrin a相对应的单一条带，但不能识别与胚胎异型drebrinE相对应的条带(青木等人，2005年). 通过消除大鼠脑组织中的免疫反应性，当血红素A被用于产生抗血清的合成肽预先吸附时，以及将其应用于血红素A类敲除动物的脑组织时，没有免疫标记，证明了血红素A在醛固定组织中的特异性标记(青木等人，2005年).
drebrin A的免疫细胞化学检测及电镜观察
组织的制备
根据Franklin和Paxinos（2001）小鼠图谱确定，使用振动棒在Bregma−2 mm处制备海马和内嗅皮层的冠状切片。
drebrin A的组织制备细节免疫细胞化学和电子显微镜完全如前所述(青木等人，2005年;Mahadomrongkul，2005年). 使用了两种免疫标记物：HRP-DAB，用于最佳检测树突内的drebrin A，以及银增敏胶体金（SIG），用于定量单个树突内dreblin A的水平。按照免疫细胞化学步骤，HRP-DAB标记的切片用四氧化锇后固定，用Epon 812包埋；用Phend的无锇法对SIG标记的切片进行后固定(Phend等人，1995年)以避免由于四氧化锇的强烈氧化而导致SIG颗粒的损失。用Epon 812包埋SIG标记的组织。
突触后棘取样程序
超薄切片取自位于海马CA1区放射层或内嗅皮层1层的振动体切片的表面大部分区域。放射层是本研究选择的区域，因为早先的一项研究显示，2xKI小鼠大脑中的这一区域对AMPA受体和AMPA受体电流的免疫反应降低(Chang等人，2006年). 我们选择分析内嗅皮层第1层有四个原因。形成兴奋性突触的轴突和树突是最异质的，密度最高(马林·帕迪拉，1984年)从而使我们能够最有效地将我们的发现推广到由多种途径形成的兴奋性突触。因为兴奋性突触在这一层最早形成，并在整个发育过程中保持(Chun和Shatz，1988年)，我们推断，在这里我们最有可能检测到兴奋性突触传递的累积效应。最后，之前对2xKI小鼠体感皮层的研究分析了第1层(Mahadomrongkul等人，2005年). 我们想分析内嗅皮层的相应区域，以便最直接地比较两个皮层区域。
图像是通过JEOL 1200EXII电子显微镜（马萨诸塞州皮博迪）和AMT（丹弗斯，马萨诸塞）配备哈马松CCD相机（新泽西州布里奇沃特）的数字采集系统采集的。SIG-标记组织和HRP-DAB-免疫标记组织的图像捕获放大倍数分别为40000倍和25000倍。脊椎通过不对称突触的存在来识别，即，基于多个小泡的存在，突触后密度较厚，与被识别为轴突末端的轮廓相对。线粒体和微管的缺失是区分树突棘与树突轴和蘑菇棘的额外线索。
含血红素A脊柱比例的评估
对于每个年龄基因型组，测定海马体中含有drebrin A的棘的比例。该值通过以下方式获得。使用HRP-DAB作为标记物，从每个大脑样本中采集至少30张海马体显微照片，这些大脑样本被免疫标记为drebrin A。每个显微照片跨度为29μm2突触神经膜（即不包括细胞体和血管的灰质）。对于每组25个随机遇到的脊椎，计算含有HRP-DAB标记的比例。通过这些重复测量，确定了平均百分比和SEM值。
内嗅皮层的分析仅限于6个月大的组。通过使用两种组织来源评估含有drebrin A的脊柱比例：HRP-DAB程序免疫标记的组织来源和SIG程序免疫标记的组织来源。HRP-DAB程序标记的脊椎的分析与上述海马的分析相同。为了分析SIG标记的组织，至少采集了35张数字图像，并计算了每组10个随机遇到的含有SIG标记脊椎的比例。通过这些重复测量，确定了平均百分比和SEM值。
突触神经膜脊柱密度的评估
使用从HRP-DAB标记的组织中捕获的同一组显微照片来计算每一显微照片中标记的drebrin A与未标记的dreprin A棘的密度。为了分析6个月大时内嗅皮层的脊椎密度，我们还使用了未进行drebrin A免疫标记的组织。
海马和内嗅皮层的脊柱剖面区域
这些区域也通过使用HRP-DAB标记组织的同一组显微照片（用于测定脊柱密度（单位面积））和Image J软件（NIH）进行测量。
内嗅皮质内侧面面积与drebrin A免疫反应水平的相关性评价
为了比较脊柱内drebrin A水平与脊柱大小，我们使用了一组从SIG标记组织中捕获的图像。面积，单位为nm2被drebrin A标记的和未标记的脊椎占据，所有这些脊椎都是随机出现在振动体截面的表面区域。还使用图像J测量了每个脊椎细胞质内所有SIG颗粒所占的面积。
统计分析
使用Statistica软件（Statsoft，Tulsa，OK）进行所有统计分析。当我们比较两种基因型的数据时，使用了Student t检验。当我们比较多组数据时，进行单因素或双向方差分析，然后进行事后Fisher最小二乘设计（LSD）检验。重要性已被接受P（P）< 0.05. 采用Spearman秩次相关分析确定6个月大时内嗅皮质棘内（定量为SIG颗粒所占区域）drebrin A免疫反应性与棘区之间的相关程度。重要性已被接受P（P）< 0.05.
电子显微数字图像图形的制备
这些数字电子显微图像最初是使用滨松CCD相机和AMT生产的软件拍摄的，然后使用Adobe Photoshop（7.0版；加利福尼亚州圣何塞市Adobe Systems）进行调整。进行调整的目的是使一幅数字图像的对比度和亮度与单个图形中的另一幅图像相匹配。Adobe Photoshop还用于裁剪图像以及添加文本和箭头。没有对数字图像进行闪避或复制。
讨论
我们之前对2xKI小鼠的研究表明，它们在9-12个月左右无法更新空间记忆，而在7-8个月左右可以检测到突触可塑性下降的最早迹象(Chang等人，2006年). 这项研究试图确定突触和行为可塑性的这些减退是否可能是由两个被认为对学习和记忆特别重要的大脑区域（海马体和内嗅皮层）内突触结构的局限性决定的。到6个月时，可以在这两个脑区的突触后棘内检测到drebrin A免疫反应性水平的变化（可能还有drebrinA蛋白水平的变化）。下文讨论了这些变化的意义。
树突中drebrin A分布的区域差异
尽管2xKI动物的海马和内嗅皮层的棘内drebrin A免疫反应水平低于年龄匹配的WT动物，但使用电子显微镜进行的仔细检查表明，这两个区域的dreblin A减少模式略有不同。在海马体中，drebrin A的减少表现为drebrinA免疫反应性棘的比例降低。相比之下，内嗅皮层在对drebrin A免疫反应的棘的比例上没有可检测到的差异。然而，使用离散的银强化金颗粒（SIG）使我们能够在单个棘内检测到较低水平的drebrinA免疫反应。6个月时内嗅皮层基因型之间更细微的差异表明，棘状沉渣蛋白A的变化首先表现为下降（或未能增加水平），而不是完全丧失。在海马体中，drebrin A的丢失可能更为剧烈，导致脊椎出现，这些脊椎“清空”了dreblin A，达到了无法检测到的水平，即使使用目前可用于免疫检测的最灵敏的标记方法，即以HRP-DAB为标记的亲和素-生物素复合物。我们在3到6个月期间测量的海马体未标记棘的密度增加支持了这一观点。2xKI海马体中标记的棘密度较低，这表明棘不仅失去了drebrin A，而且可能正在完全消失。或者，sAb可能最早在3个月内开始发挥作用，方法是抑制通常在3到6个月内使用drebrin A增加脊椎的程序。未来的研究将把drebrin A水平与脊椎的半衰期和运动性联系起来，从而能够测试dreblin A是否有助于脊椎的结构稳定性。
我们用于内嗅皮层的基于SIG的标记程序显示，2xKI小鼠脊柱内drebrin A平均水平的降低反映了具有极高DREBRINA水平的脊柱的丢失（即超过检测阈值的40倍）同时，较小的脊椎数量也随之增加，但drebrin a水平较低。内嗅皮层脊椎密度测量结果表明，这里的脊椎与海马不同，因为它们尚未消失。然而，随着动物进入明显无法更新空间记忆的年龄，这些脊椎可能会显示出导致其消失的迹象。正如对海马体的研究所建议的那样，sAb可能通过抑制正常程序来增加单个脊椎内的drebrin A水平，从而在3个月内开始在内嗅皮层显示其作用。
尽管2xKI小鼠的海马和内嗅皮层在6个月内树突棘部内的drebrin A均出现减少，但这并非全球观察到的模式。在我们的手上，6个月时的体感皮层显示，含有drebrin A的脊柱密度或单个脊柱内drebrin A免疫反应水平没有降低(Mahadomrongkul，2005年). 最近，研究人员注意到，大脑不同区域的drebrin A水平存在差异Counts等人（2006年）他比较了轻度认知障碍（MCI）患者和AD末期患者大脑各区域的drebrin A水平。以前的研究也指出，与皮层的体感和运动区域相比，边缘区更容易发生早期和更严重的退化(Braak和Braak，1991年). 我们对2xKI模型的分析表明，先前从匀浆中测得的drebrin A水平的变化与突触后棘的特异性水平有关，并且可能早于棘的丢失。
目前尚不清楚为什么某些区域比其他区域退化得更快或更早，但有一种假设是，疾病的罪魁祸首单抗与含有α7亚单位的烟碱乙酰胆碱受体结合，然后在其附近积聚，而α7亚基在边缘皮质和海马中比其他皮质区域更为丰富(D'Andrea和Nagele，2006年). 即使在健康阶段，这些受体也可能更多地出现在兴奋性突触附近的边缘皮层和海马体中，相对于那些在晚年之前不会退化的区域而言。一项电子显微镜免疫细胞化学研究系统地比较了烟碱受体在大脑区域与兴奋性突触的定位，这将是检验这一想法有效性的一种方法。了解sAb是在细胞外还是在细胞内发生也很重要。
