MYC对“预后不良”转移癌细胞状态的调节

摘要

在过去的十年中，使用基于DNA微阵列的基因表达谱分析，已经确定了13种不同的多基因“低结果”癌症特征(1 ——12)。原发性肿瘤中这些不同特征表达的定量增加与不同实体肿瘤类型向远处转移的可能性相关(图1A类)。其中一些预后特征，包括21基因Oncotype Dx和70基因MammaPrint基因集，来自乳腺肿瘤，已被部署为新诊断乳腺癌患者风险分层的生物标记物(6,9 ——11)。然而，许多其他此类特征最初是通过各种实验方法获得的，单独与癌症进展的不同方面（即转化、增殖、脱分化/干细胞、遗传不稳定性和转移）相关，是乳腺癌以外的恶性肿瘤的预后，并且在组成基因方面重叠最小(图S1和表S1)。因此，这13个不同的特征是否作为与转移相关的共同生物网络的集合链接尚不清楚。

在单独的窗口中打开

图1。

13种不良结果人类癌症特征的分子调控。(A类)据报道，与转移进展相关的不同生物学过程相关的13种不同特征（命名为s1–s13）在不同肿瘤类型中具有预后意义（绿色）。为了简化分析，我们首先创建了两个“后基因”，分别从每个多基因低结果癌症特征（s1–s13）中平均上调和下调基因。(B类——J型)以标准偏差单位显示从每个特征衍生的向上和向下变基因的图(B类)MCF7细胞中17β-雌二醇刺激（红圈）与对照（蓝钻石）(C类)MCF10A细胞中ERBB2过度表达（红圈）与对照（蓝钻石）(D类)MCF10A细胞中EGF刺激（红圈）与对照（蓝钻石）(E类)LNCaP细胞中的DHT刺激（红色圆圈）与对照（蓝色菱形）(F类)MCF7细胞中17β-雌二醇刺激和CHX治疗（红圈）与CHX单独治疗（蓝钻石）(G公司)MCF7细胞中MYC的过表达（红色圆圈）与载体对照（蓝色菱形）的对比(H（H）)在MCF7细胞中ZIP（红圈）与载体控制（蓝钻石）的过度表达(我)MCF7细胞内源性MYC（红圈）与载体控制（蓝钻石）的siRNA敲除，以及(J型)MDA-MB-231细胞中内源性MYC的siRNA敲除（红色圆圈）与载体对照（蓝色菱形）。圆形和菱形代表独立复制。s2、s7和s9是只有上调基因的单向信号。

结果

尽管这13个“预后不良”特征以各种方式得出，其中许多与乳腺癌无关，但大多数是不同乳腺癌表达数据集的预后。其中一些特征也在同一高危人类乳腺肿瘤中协调表达(13)。重要的是，许多预后不良的特征包含与乳腺癌中雌激素受体（ER）状态相关的基因，众所周知，雌激素信号可以从疾病的早期阶段驱动乳腺癌细胞的生长和存活(14)。这些观察结果导致了这样一种假设，即雌激素信号可能调节乳腺肿瘤和非乳腺癌环境中其他不同特征的表达。为了验证这一假设，我们使用Affymetrix微阵列在雌激素依赖性ERα中分析了13个不良结果肿瘤标志物的表达⁺/β⁻实验性调控雌激素信号后的MCF7乳腺癌细胞(15).

详细的统计分析表明，在这13个不同的转录特征中，每一个中都有相当大比例的基因确实由MCF7细胞表达，并且通过内质网的信号传导受到紧密协调的调控(图1B类,图S2和第3章、和表S2)。单个组分基因的不同特征重叠不超过10%(图S1)。此外，即使不同签名之间的这种最小重叠也无法解释我们观察到的坐标模式，这在使用随机和不相关的实验衍生签名集进行置换分析的基础上是不可能的(表S3)。总的来说，约40%的不良结果特征基因在MCF7细胞中受雌激素调节，个别特征的比例从30%到近100%不等(表S2)。这些在癌细胞自主实验系统中的初步发现表明，ER可以在功能上调节大多数预后较差信号的协调表达。

除ER外，我们还观察到其他癌基因的类似转录效应。例如，ERBB2过度表达和EGF刺激MCF10A乳腺上皮细胞（永生但未转化）均诱导所有13个不良结果标志的协同表达(图1C类和D类)，并且通过雄激素受体（AR）用二氢睾酮（DHT）刺激LNCaP前列腺癌细胞产生了类似的转录模式，尽管在来自不同特征的“DOWN”变基因方面比ERBB2或EGF信号弱一些(图1E类)。这些结果表明，已知在不同细胞环境中独立调节癌细胞生长和存活的四种不同致癌途径的活性增加可能会将不同的上皮细胞类型推向由13种不同不良结果特征的协调表达定义的共同转录状态。

接下来我们研究了不良结果信号调节是否反映了这些癌基因对转录的直接或间接影响。ERBB2和EGFR作为膜结合受体酪氨酸激酶，几乎可以肯定通过下游转录因子的信号转导间接诱导低结果信号表达。相反，ERα和AR是核激素受体，其转录活性可由EGFR和ERBB2途径调节，这增加了这些转录因子可能直接调节不良结果特征表达的可能性。但在环己酰亚胺（CHX）存在下，17β-雌二醇对MCF7细胞的治疗破坏了雌激素的协同信号诱导(图1F类) (16)。这些结果表明，ERα可能间接地调节不良结果信号的表达，至少部分通过ERα、ERBB2、EGFR和AR通路下游的共同转录调控因子进行调节。

因此，我们进一步详细分析了ERα-、ERBB2-、EGFR-和AR调节的转录谱，以从13个不良结果特征中识别候选基因，这些基因的表达通常是由这四种不同刺激诱导的。总的来说，大约50%的不良结果特征基因是由这些跨不同细胞环境的不同途径调节的。尽管一些不良结果基因是由其中一条通路唯一调节的，但其他基因通常是由多条通路调节的。尤其是，ERα、ERBB2、EGFR和AR通常诱导20个不良结果基因的“核心基因集”的表达，这远远超出了随机范围(P（P）= 1.6 × 10⁻¹²) (图2A类).

在单独的窗口中打开

图2。

以MYC为中心的核心相互作用组。(A类)说明核心基因集推导的维恩图。(B类)核心基因集中的20个基因（橙色）和使用IPA算法识别的13个相关基因的高度连接网络(17)。MYC以红色突出显示(C类)17β-雌二醇刺激MCF7细胞后获得的全基因组MYC结合位点数据的统计分析，使用ChIP芯片（染色质免疫沉淀和横跨整个非复制性人类基因组的平铺微阵列）生成(26)。UP和DOWN为至少一个MYC结合位点在其转录起始位点（橙色）±5 kb范围内的不良结果特征基因，而平铺阵列上的所有其他基因（绿色）为相同的。

尽管该核心基因集不包含任何明显的候选转录调控因子，但该集中的所有基因都使用IPA算法和基于文献的分子相互作用数据库链接到一个单一且高度连接的“核心相互作用组”中(图2B类) (17)。该核心相互作用组与MYC转录因子高度相关，MYC转录因子不是任何不良结果标志的成员，因此不在核心基因组中。这种相关性与20个核心相互作用组基因中至少10个是已知的MYC直接靶点的观察结果相吻合(www.myccancergene.org)。这也与先前报道的MYC作为乳腺癌预后不良特征表达的调节器相一致(18 ——22)。综上所述，这一证据提出了一个假设，即位于ERα、ERBB2、EGFR和AR通路下游的MYC可能是我们研究的13种不同不良结果特征表达的共同转录调节器。

与此假设一致，MCF7细胞中MYC的过度表达足以诱导协调的预后不良特征表达(图1G公司) (23)。相反，在MCF7细胞中过度表达ZIP（一种缺乏两个N末端反式激活域的MYC突变体）未能诱导这种表达模式(图1H（H）)。此外，MCF7（ER）内源性MYC的siRNA敲除⁺)颠倒了签名表达式的这种协调模式(图1我) (24,25)。总的来说，这些转录变化涉及MCF7细胞中20%的不良结果特征基因，从10%到40%不等(表S4)。此外，对17β-雌二醇治疗后从MCF7细胞获得的全基因组MYC染色质免疫沉淀微阵列（ChIP-ChIP）分析数据进行分析(26)，在上调的不良结果标志基因转录起始位点的5kb内，MYC结合高度显著富集(P（P）= 6 × 10⁻⁸) (图2C类)。相反，我们发现下调的不良结果基因的MYC结合没有类似的富集，这表明许多下调的基因实际上是MYC的间接靶点。最后，在MDA-MB-231（ER）中内源性MYC的siRNA敲除⁻公共关系⁻ERBB2号机组⁻)乳腺癌细胞也逆转了协同特征表达(图1J型)。这些结果表明，MYC能够有力地调节乳腺癌细胞中来自13种不同不良结果转录特征的许多但不是全部基因的协调表达。

众所周知，MYC可以调节广泛的癌细胞行为，包括增殖、存活、分化和遗传稳定性，这些是肿瘤发生的一般特征(27)。因此，对我们的研究结果的一种解释是，癌症细胞内的MYC活性，如预后较差的特征表达所反映的，可能会间接影响癌细胞的转移倾向（例如通过促进细胞增殖和存活）。另一种可能性是，MYC实际上可能调节转移细胞行为的更具体方面。为了验证这一假设，我们将重点放在MDA-MB-231细胞系上，该细胞系具有高转移性，当注射到免疫缺陷小鼠体内时，通常会形成远处的肺转移。这一可靠的模型已被用于实验性识别和操纵调节转移细胞行为各个方面的分子途径(28)。此外，这些转移性乳腺癌细胞中MYC的敲除导致13种不同不良结果转录特征的协同下调，支持了该模型系统与人类癌症转移的相关性(图1J型)。因此，我们研究了抑制MYC活性是否会特异性抑制MDA-MB-231细胞的转移行为。

使用慢病毒载体引入两种不同的短发夹RNA稳定地敲除MYC，[发夹1（HP1）≈95%；发夹2（HP2）≈70%]在体外连续传代后，并没有显著改变MDA-MB-231细胞的生长动力学(图3A类和B类)。然而，必须注意的是，在MYC敲除后，HP1和HP2细胞确实表现出轻微的增殖下降，在传代1-2周后恢复正常，这表明这些细胞在一定程度上依赖MYC进行增殖，但在面对稳定的MYC抑制时，仍然能够保持其增殖动力，大概是通过补偿性变化。重要的是，在免疫功能低下的NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫中原位注射MYC后，稳定的MYC敲除也没有显著影响原发性肿瘤形成的动力学(图3C类)。注射8周后，10只对照小鼠中的9只和10只实验小鼠中的8只出现了相似大小的肿瘤，而其余的动物没有形成肿瘤。

在单独的窗口中打开

图3。

MDA-MB-231体内原发性肿瘤发生和转移，MYC敲除稳定。(A类)在MDA-MB-231细胞中连续传代后，与pLKO空载体对照相比，用两种不同的MYC发夹（HP1和HP2）稳定、慢病毒介导的敲除后的MYC蛋白的蛋白质印迹。(B类)连续传代4天后，空载体控制（pLKO）、HP1和HP2细胞的增殖曲线，表明吸光度是衡量细胞数量的指标(n个=95%CI）。(C类)NOD/SCID小鼠（pLKO，n个= 9; HP1，n个= 7; 95%置信区间）。(D类)对照组和MYC HP1敲除荷瘤小鼠（pLKO，n个= 9; MYC HP1，n个= 7;P（P）双侧双样本Wilcoxon检验计算的值）。(E类)MYC HP1敲除组中异常动物的原发性和转移性肿瘤切片中MYC蛋白表达的代表性免疫组化。(F类)pLKO控制和MYC HP1敲除原发性肿瘤中的代表性光学显微镜（H&E）和免疫组织化学（MKI67、TUNEL、波形蛋白和E-cadherin）。（比例尺：20μm）

相反，MYC敲除大大抑制了远处肺转移的形成(图3D类)。虽然两只动物没有肺转移，但与对照动物相比，其他四只动物在8周时有少量转移。另一只MYC敲除动物在5.5周时死于未知原因，因此无法完全评估，但尸检时只有一个小的原发肿瘤，没有肉眼可见的转移迹象。奇怪的是，最后一只MYC基因敲除动物是一个离群值，在形成大量肺转移方面与对照组动物相似(图3D类)。为了解决这个矛盾的发现，我们用免疫组织化学方法检测了MYC蛋白在原发性和转移性肿瘤中的表达。虽然原发肿瘤的MYC表达为阴性，证实了原位注射时细胞的稳定击倒，但该动物肺部的转移细胞的MYC表达显著阳性，表明稀有细胞以某种方式重新激活了MYC的表达，使这些细胞从乳腺脂肪垫转移到肺部(图3E类)。对MYC敲除动物与对照动物的原发肿瘤进行进一步组织病理学检查，结果显示，这两种肿瘤类型均为高级别癌，均含有圆形多边形细胞，MKI-67、TUNEL、波形蛋白和E-cadherin染色水平相当，可标记细胞增殖、凋亡和间充质/上皮细胞状态，分别(图3F类)。综上所述，这些体内结果表明，MYC活性是维持转移状态而非这些高转移性乳腺癌细胞的增殖、凋亡或分化状态所必需的。

鉴于体内的这些发现，我们最终研究了MYC活性对于转移细胞行为的基本特征和标志性特征（即癌细胞侵袭和迁移）是否必要。我们使用一种新开发的微流控设备在单细胞水平上研究细胞迁移和侵袭，在单细胞层面上，细胞的运动受到预定路径的机械约束(29)。每个设备包含一系列线性微柱，每个微柱高10μm，宽20μm，长600μm。将单个MDA-MB-231细胞植入填充有Matrigel（以模拟癌细胞在体内遇到的一些三维微环境条件）或简单涂有IV型胶原（以研究无阻碍迁移）的微柱后，使用活细胞延时视频显微镜对其进行可视化。我们专门在没有化学梯度的情况下进行这些实验，这使我们能够检查内在的细胞行为。该装置中单细胞速度的定量分析表明，MYC敲除大大阻碍了MDA-MB-231在Matrigel中的侵袭，但与对照细胞相比，对迁移速度的影响较小(图4A类——F类、和电影S1——S4系列)。然而，正如迁移细胞的延时电影中最明显的那样，敲除细胞是圆形的，与对照细胞相比，其移动效率和持久性较低，方向变化频繁且无序，并且不能有效地退出微柱(电影S3和S4系列)。我们还评估了MYC敲除对MDA-MB-231细胞侵袭的定量影响，这是在更传统的Boyden室试验中进行的。我们发现，在这个实验系统中，MYC基因敲除导致入侵减少约50%(图S4)。这些发现表明，在高转移性MDA-MB-231乳腺癌细胞中，MYC对于维持侵袭和迁移状态是必要的。

在单独的窗口中打开

图4。

MDA-MB-231在体外侵袭和迁移，MYC敲除稳定。(A类)对照（pLKO）和MYC敲除（MYC HP1）MDA-MB-231乳腺癌细胞通过基质胶填充的微毛细管迁移的代表性光学显微镜图像。(B类)24小时内侵入Matrigel填充微柱的单个pLKO和MYC HP1细胞的位置随时间变化。(C类)柱状图表示pLKO和MYC HP1细胞通过Matrigel的平均入侵速度，pLKO为13.9±1.1μm/h(n个=33），MYC HP1为9.1±0.9μ(n个=31）和10.9±0.7μm/h（MYC HP2）(n个= 33).P（P）数值由双面Walsh计算得出t吨测试。(D类)pLKO和MYC HP1 MDA-MB-231乳腺癌细胞通过IV型胶原涂层微柱迁移的典型光学显微镜图像。(E类)单个pLKO和MYC HP1细胞在12小时内沿着IV型胶原涂层微柱迁移的位置随时间变化。(F类)条形图表示pLKO和MYC HP1敲除细胞通过胶原蛋白涂层微柱的平均迁移速度，pLKO为82.5±7.5μm/h(n个=17）和70.4±6.4μm/h（MYC HP1）(n个= 21).P（P）数值由双面Walsh计算得出t吨测试。另请参见电影S1——S4系列.

讨论

MYC是人类癌症中最重要的体细胞突变癌基因之一。最近的研究表明，8q24上的遗传多态性也会影响MYC的转录调控，这种多态性可以有效地改变实体瘤的易感性(30)。MYC癌蛋白的放松调控通过促进增殖、细胞存活、分化阻滞、上皮-间充质转化和遗传不稳定性，在不同环境下赋予癌细胞选择性优势，所有这些都可能导致转移(27,31 ——33)。事实上，最近的一份报告表明，在c-RAF驱动的非小细胞肺癌小鼠模型中，MYC通过调节生长、分化和血管生成，发挥转移的间接调节器的作用(34)。MYC也被认为是癌症干细胞生长和存活的潜在重要调节因子(22)。我们的发现通过证明MYC活性在某些情况下对癌细胞的侵袭、迁移和最终转移也是必要的，从而为这些基本观察结果增添了新的内容。在我们的实验系统中，MYC对侵袭、迁移和转移的直接影响与其对生存、增殖和分化的影响是分开的，这可能是因为MYC在体内外敲除后维持MDA-MB-231细胞增殖动力的代偿性变化。为了说明这一点，MDA-MB-231细胞在KRAS中包含一个突变，这表明在实验性MYC失活的环境中可以维持原发性乳腺肿瘤的发生(35)。然而，在自然的人类肿瘤环境中，MYC似乎很可能协调调节这些不同的细胞功能，这些功能结合在一起对于成功的侵袭、移位、播种和远距离生长是必要的。此外，虽然MYC活性是MDA-MB-231细胞侵袭行为所必需的，但MYC自身的过度表达不足以诱导非侵袭性MCF10A细胞的侵袭，这表明其他分子途径必须与MYC合作才能在癌症进展过程中完全触发侵袭性表型(18,36,37)。需要进一步的工作来精确定义MYC特异性调节癌细胞移位的机制。

这些结果可以部分解释为什么早期原发性肿瘤患者表达预后较差的转录特征更有可能进展为远处转移。以前的工作主要集中于预后特征，作为肿瘤增殖、存活和分化的基因组相关性(9,23,38)。其他人注意到，我们分析中的四个预后特征协调地标志着相同的高危原发肿瘤(13)。此外，独立小组报告称：（i）MYC在我们的分析中调节了一些个别的不良结果特征，（ii）MYC-驱动的基因表达特征在原发性人类乳腺肿瘤中具有预后价值，以及（iii）不良结果特征可以通过替代生物信息学方法与MYC联系起来(18 ——22)。与这些观察结果一致，我们证明了13种不同的预后较差的癌症特征，包括70基因MammaPrint和21基因Oncotype Dx生物标记物，协调地反映了人类乳腺癌细胞内的MYC活性，而MYC又是乳腺癌细胞向远处侵袭和转移所必需的。人类肿瘤中MYC活性的增加可能是由体细胞突变或其无数上游调控途径的改变引起的。该模型与最近的研究一致，该研究表明，单个肿瘤内从原位乳腺癌向浸润性乳腺癌的转变通常与MYC基因座的扩增有关，它与较短的无转移生存期和总生存期相关，是临床结果多变量分析中的独立预后因素(39,40)。最后，我们分析中的许多不良结果特征在其他实体瘤类型中具有预后价值，在这些类型中，已知会发生MYC放松调节。这增加了MYC对乳腺癌以外的其他人类实体瘤类型的侵袭、迁移和转移通常是必要的可能性。

材料和方法

有关更多详细信息，请参阅SI方法.

补充材料

致谢

脚注

参考文献