实验室大鼠是人类疾病相关性状遗传解剖的良好模型(1)尽管对其基因组进行有针对性的修改在很大程度上是难以解决的。我们研究了工程锌指核酸酶（ZFNs(2))用于消除特定的大鼠基因功能和产生“敲除”大鼠。ZFN诱导位点特异的双链DNA断裂，可通过易出错的非同源末端连接DNA修复途径进行修复，从而导致靶向突变(). 在果蝇和斑马鱼中，直接胚胎注射编码ZFN的信使核糖核酸已被用于在特定基因座产生可遗传的敲除突变(2).
大鼠胚胎中ZFN介导的基因破坏。(A类)含有5-6个手指的ZFN被设计成靶向感兴趣的编码序列（灰线），用于特定位点的卵裂。(B类)微量注射GFP靶向ZFN后出生的五只幼崽中有两只没有GFP表达。(C类)使用GFP特异性引物进行的聚合酶链反应显示，与阳性同窝幼崽相比，GFP阴性幼崽中的每个幼崽都有截断的野生型序列。SS-Dahl S控制DNA；NT表示没有模板。(天)注射数据表显示了在三种大鼠品系中采用多种给药方法和剂量后，三种基因靶点成功突变。
针对插入大鼠染色体和两个内源性大鼠基因的单拷贝绿色荧光蛋白（GFP）转基因的ZFN试剂的设计和验证，免疫球蛋白M和拉布38，按照说明执行(三)并在补充材料为了利用更长（因此更罕见）的靶标所提供的更高的作用特异性的潜力，我们使用了5指和6指ZFN。
我们将这些ZFN传递给36个半合子GFP转基因(4)通过不同浓度的ZFN编码DNA或mRNA的原核或胞质内注射，获得近交SS（Dahl S）、91个近交FHH（浅霍氏高血压）和2793个远交SD（Sprague-Dawley）胚胎(). 对295只创始动物进行筛查，发现35只（12%）存在靶向突变。
由于突变动物缺乏GFP表达和野生型GFP序列，因此实现了GFP转基因的完全敲除(). 32个IgM突变体和单个Rab38突变体携带25–100%被破坏的目标染色体(图S1). 对18位创始人的序列分析显示，缺失等位基因的范围为3–187个碱基对；值得注意的是，有一种动物携带双等位基因突变免疫球蛋白M(表S1). 此外，由于在20个预测的ZFN非靶点中的任何一个靶基因突变动物中均未检测到ZFN诱导的突变，因此ZFN介导的基因突变对每个靶序列都具有很高的保真度(图S2、S3). 繁殖到野生型动物后，每1个GFP中就有1个，每4个GFP里就有3个免疫球蛋白M突变通过生殖系传播，其中一个随后被培育成纯合性(,S4系列).
染色体断裂的高百分比表明，ZFN在三个品系的早期大鼠胚胎中活跃，导致单等位基因和双等位基因断裂。尽管我们在预测的脱靶位点没有观察到切割，但通过回交到亲本菌株，这些事件可以从所需的突变中分离出来。ZFN驱动的基因破坏和种系传递可以在4个月内完成，ZFN可以针对广泛的序列进行工程(5,6). 因此，这一策略为日益强大的老鼠基因工具箱添加了一个有价值的工具，开辟了一系列人类疾病的新实验和模型。
