为了鉴定Jade-1活性的分子介质，我们使用酵母双杂交方法筛选了一个人类肾脏cDNA文库，该文库使用缺失两个PHD（Jade-1 dd）的Jade-1的转录非活性截断作为诱饵(补充信息，图S1a). 发现了9种强相互作用物，包括一种癌蛋白β-catenin和典型Wnt信号的关键转录共激活物7.
通过共免疫沉淀证实哺乳动物细胞中Jade-1-β-catenin相互作用(). β-catenin的定位和命运取决于Wnt状态7组成上，在Wnt关闭期，β-连环蛋白被GSK-3β磷酸化，与胞质溶胶中的破坏复合物结合并被降解。在Wnt-on相，GSK-3β被抑制；β-catenin从破坏复合体中解离并转移到细胞核。因此，我们研究了Wnt信号不同状态下内源性Jade-1和β-catenin的结合。Wnt信号通过Wnt-3a配体或氯化锂（一种模拟Wnt激活的GSK-3β抑制剂）激活，并通过Wnt-3α加DKK1（Wnt-3 a的竞争性拮抗剂）抑制(和补充信息，图S1b). 内源性Jade-1与内源性β-catenin和副病毒共同免疫沉淀(). 然而，与Wnt-3a处理的细胞（Wnt-on期）相比，载体和Wnt-3a-DKK1处理的细胞中Jade-1-β-catenin相互作用增加。进行共定标和剖面图以证明蛋白质的分布和丰度(). Wnt-off阶段(β-catenin主要存在于胞浆和细胞膜中。Jade-1位于细胞质和细胞核中，不包括核仁三,8在胞浆中发现Jade-1和β-catenin的共定域。Wnt-3a处理导致β-catenin核移位。然而，Jade-1和β-catenin在细胞核中表现出不同的亚室定位(，Wnt-3a处理），导致共定位减少。因此，内源性Jade-1和内源性β-catenin相互作用，Wnt-off相的相互作用大于Wnt-on相。
Jade-1和β-catenin相互作用。(一)体内Jade-1和β-catenin的相互作用。用1μg单克隆Myc-tag或Flag-tag抗体免疫沉淀（IP）瞬时转染293T细胞的提取物（600μg蛋白质）。免疫印迹法检测共免疫沉淀β-连环蛋白或Jade-1。检测全细胞裂解物（WCL）（10%）以供输入。4个实验的代表性免疫印迹。(b条)内源性Jade-1和内源性β-连环蛋白的相互作用在Wnt关闭期增加。用载体（PBS+0.1%牛血清白蛋白-BSA）预处理293T细胞的WCL（500μg蛋白）或PBS+0.1%BSA中的50 ng Wnt-3a配体预处理293 T细胞，加或不加50 ng DKK1，使用1μg兔多克隆Jade-1抗体（J1）或免疫前兔血清（C）进行IP。用单克隆β-连环蛋白抗体免疫印迹法检测共免疫沉淀的β-连环蛋白。如上所述，使用单克隆β-连环蛋白抗体（β-cat）和同型对照（C）免疫沉淀β-catenin。用Jade-1抗血清进行免疫印迹检测Jade-1。WCL（10%）用于输入。进行密度测定以定量β-catenin和Jade-1。使用IgG标准化Jade-1和β-catenin免疫沉淀的数量。3个实验的代表性免疫印迹。(c（c）)Wnt-off状态下内源性Jade-1和内源性β-catenin的共定域增加。将经载体或Wnt-3a（200 ng）预处理4 h的293T细胞固定，用单克隆β-catenin和多克隆Jade-1抗体孵育，然后用Alexa 594驴抗鼠和Alexa 488羊抗兔作为二级抗体。使用NIH ImageJ生成剖面图，以显示Jade-1和β-catenin蛋白的定量分布。剖面图表示沿代表性细胞中点的单线的每个荧光团的信号强度。X轴表示通过单个细胞长度的距离（以像素为单位），每个荧光团的强度绘制在Y轴上。显示了来自4个实验的代表性图像。比例尺=10μm。(d日)鉴定Jade-1结合所需的β-catenin结构域。对瞬时转染293T细胞的提取物进行免疫沉淀。WCL（10%）用于输入。β-catenin delC和delN结构分别缺乏蛋白质的C端和N端(补充图S1a). β-catenin S33A是一种天然发生的致癌氨基酸替代突变体。3个实验的代表性免疫印迹。
Jade-1与β-catenin的N末端特异性相互作用(). 有趣的是，Jade-1与缺乏GSK-3β磷酸化位点的β-catenin的天然发生、致癌、组成活性（CA）S33A突变体的结合减少(). 这些发现通过表达标记Jade-1和Myc-taggedβ-catenin系列的细胞的免疫荧光显微镜证实(补充信息，图S1c-e). 在Wnt-of期，Jade-1与野生型β-catenin广泛共定位，β-catentin的C末端截短主要在胞浆中，而与β-catelin S33A或β-catenicn的N末端截短不在一起(补充信息，图S1d). 与Wnt-on期相比，野生型β-catenin定位于细胞核，从而减少与Jade-1的共定位(补充信息，图S1d与S1e)与内源性Jade-1-β-catenin结合Wnt活化的减少相一致。这些数据表明，β-catenin N端丝氨酸残基33或其磷酸化对于与Jade-1的最佳结合非常重要。我们检测了纯化的重组GST标记Jade-1和GST标记β-catenin在在体外GST下拉分析。GST标记的Jade-1与GST标记β-catenin相关(补充信息，图S1f). 然而，这种结合在在体外激酶CK1和GSK-3对β-连环蛋白的磷酸化作用(补充信息，图S1f). GST标记的Jade-1不与β-连环蛋白的N端缺失结合。总的来说，Jade-1直接与β-catenin的N末端结合，并且在Wnt-off阶段与β-catanin磷酸化的相互作用增强。
在Wnt-of阶段，β-catenin发生降解，这一过程取决于β-catentin N末端或“脱基”7,9Jade-1与β-catenin的N末端相互作用，尤其是残基S33(补充信息，图S1a). 因此，我们研究了Jade-1是否调节β-catenin丰度。Jade-1下调野生型β-catenin和C末端缺失(). 然而，Jade-1对β-catenin或β-catentin S33A的N端缺失几乎没有影响，这与Jade-1与β-catelin的结合模式一致().
Jade-1降低β-catenin蛋白丰度。(一)Jade-1构建的β-catenin的差异调节。将Myc-taggedβ-catenin和Flag-taged Jade-1（J1）构建物瞬时转染至293T细胞。β-catenin结构示意图如所示补充信息，图S1a在WCL中检测β-连环蛋白和α-微管蛋白。用Flag抗体免疫印迹法检测Jade-1的表达。使用NIH ImageJ进行密度测定，以α-微管蛋白作为负荷控制。5个实验的代表性免疫印迹。(b条)Jade-1调节内源性β-catenin的细胞溶质和核组分，但不调节其膜组分。293个未感染的亲代细胞（P）或感染空载体（Vec）或翡翠-1shRNA慢病毒（Jsh）进行细胞分离。检测细胞液、细胞核和膜组分中的β-连环蛋白。α-微管蛋白、纤维蛋白和E-cadherin分别作为细胞溶质、核和膜组分的负荷控制和标记物。这些对照印迹是通过按预期的对照分子量切割膜和分别进行免疫印迹来生成的。显示了两个类似实验中的一个。(c（c）)Jade-1减少内源性β-catenin的细胞溶质和核池。稳定表达空载体（Vec）或Jade-1（J9和J18）的克隆性786-O肾癌细胞系的提取物4,5检测β-catenin。α-微管蛋白、纤维蛋白和N-钙粘蛋白分别作为细胞溶质、核和膜组分的标记物和负荷对照物。这些对照印迹是通过按预期的对照分子量切割膜和分别进行免疫印迹来生成的。使用多克隆Jade-1抗体检测Jade-1。3个实验的代表性免疫印迹。稳定转染的Jade-1对β-catenin丰度的影响似乎具有剂量依赖性。(d日)翡翠-1沉默显著延长内源性细胞溶质β-catenin的半衰期。Digitonin用于提取β-连环蛋白的胞浆池。洋地黄是一种温和的清洁剂，在低浓度下可以选择性地刺穿富含固醇的质膜上的8-10纳米孔，从而使高达200kDa质量的细胞溶质蛋白质泄漏10（上图），通过免疫印迹法检测用空载体或JshRNA慢病毒载体感染并用20μM催吐剂预处理的293细胞的Digitonin提取物中的β-连环蛋白。（下面板），在归一化为α-微管蛋白后，通过密度测定法分析洋地黄提取部分中剩余的β-连环蛋白百分比。图表显示了4个实验的平均结果。误差线=SEM(e（电子）)GSK-3β沉默减轻Jade-1对内源性β-catenin的调节。用标记Jade-1（J1）和GSK-3βshRNA质粒（GSK-3βsh）或空载体（Vec）和GFP。转染后一天，使用荧光激活细胞分选（FACS）对细胞进行分选，并重新放置48小时。使用单克隆β-连环蛋白抗体检测细胞蛋白提取物中的β-连环素。分别用多克隆GSK-3β和Jade-1抗体进行免疫印迹检测GSK-3和Jade1蛋白。α-微管蛋白、纤维蛋白和E-cadherin分别作为细胞溶质、核和膜组分的负荷控制和标记物。显示了两个类似实验中的一个。(（f）)GSK-3β的化学抑制减轻Jade-1对内源性β-catenin的调节。将瞬时转染的293T细胞血清饥饿12-16小时，并用氯化锂（10mM）或BIO（100nM）再处理12小时。使用β-连环蛋白抗体检测β-连环蛋白。4个实验的代表性免疫印迹。(克)Jade-1对Wnt-on和Wnt-off状态下内源性β-catenin的调节。HeLa亲代细胞（P）或感染空载体的细胞（Vec）或翡翠-1shRNA（Jsh）慢病毒用Wnt-3a（100 ng）加或不加DKK1处理4 h。检测细胞溶质部分的β-连环蛋白和α-微管蛋白。4个实验的代表性免疫印迹。
内源性β-catenin存在于三个不同的细胞池中7细胞溶质和核组分中的内源性β-catenin蛋白在3种不同组分中至少高出2倍翡翠-1沉默细胞系比空载体系(和补充信息，图S2b-S2d). β-catenin的膜池没有改变。相反，表达Jade-1-的稳定细胞系的细胞溶质和核组分中的β-catenin的量明显低于空载体细胞系(). 然后我们检查了细胞溶质β-catenin的半衰期。洋地黄素提取部分10细胞溶质标记物增加证明细胞溶质丰富，但没有膜污染(补充信息，图S2e). 提取的洋地黄素胞浆β-连环蛋白的半衰期从10分钟增加到90分钟翡翠-1沉默的293细胞系(). 因此，翡翠-1沉默基本稳定的细胞溶质β-catenin。在表达Jade-1的肾癌细胞系中，β-连环蛋白的半衰期降低(补充信息，图S2f). 因此，Jade-1调节β-连环蛋白Wnt反应池的稳定性。
β-catenin降解依赖于GSK-3β。在Wnt-off阶段，β-catenin通过GSK-3β在苏氨酸41、丝氨酸37和33处进行顺序磷酸化。Jade-1与磷酸化-β-catenin的优先结合以及与β-catentin S33A的缺乏结合表明GSK-3β可能在Jade-1调节β-catelin中发挥作用(和补充信息，图S1f). 此外，全长Jade-1主要由于磷酸化β-连环蛋白的减少而降低了总β-连环素(补充信息，图S3a). 因此，Jade-1优先调节磷酸化-β-连环蛋白。该观察结果进一步表明，GSK-3β可能对Jade-1调节β-catenin特别重要。事实上，Jade-1对β-catenin的调节通过沉默或化学抑制GSK-3β来缓解(). 同样Jade-1型当GSK-3β活性被抑制时，Wnt-on期β-catenin丰度的沉默减少(和补充信息，图S3b). 总的来说，这些数据表明Jade-1需要完整的GSK-3β激酶活性才能完全抑制β-catenin。
β-catenin经历蛋白酶体降解11MG132对蛋白酶体的抑制完全消除了Jade-1对β-catenin丰度的影响(补充信息，图S3c). 此外，在Jade-1和蛋白酶体抑制的存在下，β-连环蛋白的超高分子量物种积累(补充信息，图S3d)表明Jade-1可能增强β-catenin的泛素化和降解。
蛋白质泛素化依赖于高选择性E3泛素连接酶对底物的识别。PHD蛋白如MEKK1和MIR表现出E3泛素连接酶活性12,13Jade-1有两个博士三与MEKK1、MIR1、MIR2和c-MIR的PHD一致(补充信息，图S4a). 因此，我们推断Jade-1可能通过其PHD泛素化β-catenin。PHD的缺失降低了Jade-1对β-catenin的作用(补充信息，图S4b). 接下来，免疫沉淀内源性β-连环蛋白，并在存在Myc-tagged泛素和Jade-1、Jade-1 dd或成熟的β-连环素E3泛素连接酶组分β-TrCP的情况下检测其泛素化6(). 在这些条件下，β-TrCP可观察到最小的β-catenin泛素化，这可能是由于β-TrCP-SCF复合物的其他组分未共同表达或β-TrCP-SCF表达较低。有趣的是，在全长Jade-1中观察到稳健的β-连环蛋白多泛素化，而PHD的缺失显著降低了β-连环素泛素化(). β-catenin泛素化表现为涂片，最显著的是全长Jade-1。由于293T细胞在基础条件下处于Wnt-off状态，这些数据表明Jade-1在Wnt-of阶段促进内源性β-catenin泛素化。
Jade-1泛素化物β-catenin。(一)Jade-1 PHDs的缺失显著降低了内源性β-连环蛋白的泛素化。用β-catenin抗体和蛋白A珠免疫沉淀转染并用MG132处理的293T细胞的提取物（600μg蛋白）（10μM处理1h）。将洗脱液分成两等份，分别用单克隆Myc-tag抗体和β-catenin抗体进行免疫印迹。免疫印迹法检测β-TrCP和Jade-1蛋白的表达。显示了两个类似实验中的一个。(b条)离体使用HeLa细胞胞质S100部分纯化的β-catenin泛素化。谷胱甘肽Sepharose™珠上纯化的重组GST-β-catenin与HeLa细胞S100组分（用泛素醛和MG132预处理）、Myc-tagged人重组泛素（Ub）、重组Jade-1和能量再生溶液（ERS）孵育。使用Laemmli缓冲液从珠子中洗脱β-catenin。洗脱液分为两等份，分别用单克隆Myc-tag或β-catenin抗体进行免疫印迹。被指定为无Ub或无ERS的通道分别是没有Ub或仅ERS的反应。使用多克隆Jade-1抗体检测洗脱液中的Jade-1输入。3号通道从同一个污点重新排列。β-连环蛋白泛素化表现为涂抹和高分子量阶梯。显示了两个类似实验中的一个。(c（c）)β-catenin的Jade-1泛素化在体外，以及Jade-1上E3泛素连接酶结构域的映射。筛选一组E2泛素转移酶，包括UbcH2、UbcH3、UbcH2a、UbcH5b、UbcH 5c、Ubch 6、Ubc H7和UbcH c10，以检测Jade-1-介导的β-连环蛋白泛素化（数据未显示）。Jade-1泛素化β-连环蛋白仅在UbcH6存在时存在（图3c和补充信息，图S4c)或UbcH2（未显示数据）。使用GST-β-catenin（野生型或delN）与E1激活酶、E2结合酶（UbcH6）、E3连接酶750 nM Jade-1（全长或dd）、Myc-tagged人重组Ub和MgCl重建泛素化反应2-ATP。指定为无E1、无E2和无Ub的通道分别与除E1、E2或Ub以外的所有组分发生反应。以显性阴性UbcH6（DN E2）代替野生型UbcH5作为对照。使用Laemmli缓冲液从小球中洗脱β-catenin，并使用单克隆Myc-tag抗体进行免疫印迹。使用多克隆β-catenin C末端抗体和多克隆Jade-1抗体分别探测与反应中使用的等效的GST-β-catentin和GST-Jade-1珠。无E1、E2或泛素的反应，或与DN UbcH6的反应，作为阴性对照（lanes，6-9）。3个实验的代表性免疫印迹。(d日)Jade-1介导的内源性β-catenin降解独立于β-TrCP。用β-catenin抗体检测转染野生型或DNβ-TrCP的293T细胞的全细胞提取物，包括标记Jade-1的细胞和未标记Jade1的细胞。使用Flag和Myc-tag抗体分别检测WCL（10%）中Jade-1和β-TrCP蛋白的表达。α-微管蛋白和纤维蛋白分别作为细胞溶质和核组分的标记物，并作为负荷对照。4个实验的代表性免疫印迹。
体外然后检测β-catenin的泛素化。GST纯化的β-catenin与HeLa细胞胞浆S100组分孵育。在Jade-1存在下观察到β-catenin泛素化(). 为了解决Jade-1是否直接泛素化β-连环蛋白，并绘制Jade-1内的E3泛素连接酶结构域，我们用所有纯化的成分重新构建了泛素化反应(和补充图S4c). Jade-1以剂量依赖的方式观察到β-连环蛋白泛素化(补充信息，图S4c，4-6车道）。Jade-1 PHD缺失或β-catenin N末端取消β-catentin泛素化(第5和10车道；和补充信息，图S4c，第7和12车道）。因此，纯化的Jade-1泛素化物是非磷酸化GST标记的β-连环蛋白，Jade-1 PHD是E3泛素连接酶活性所必需的。
为了研究Jade-1-和β-TrCP-介导的β-catenin降解之间的关系，使用缺乏F盒的DNβ-TrCP拮抗β-TrCP1和β-Tr CP214DNβ-TrCP使内源性β-catenin表达增加2倍(). 有趣的是，Jade-1仍然可以在DNβ-TrCP存在时下调β-catenin()这表明Jade-1独立于β-TrCP调节β-catenin。
在TCF/β-catenin转录测定中评估了Jade-1-β-catenin相互作用的生物学意义。全长Jade-1，但不是Jade-1 dd，将TOP-Flash启动子报告子抑制了3.5倍(). Jade-1对β-catenin S33A转录活性无影响(). 这些观察结果与Jade-1对野生型β-连环蛋白和β-连环素S33A蛋白水平的影响一致(). 有趣的是，在翡翠-1沉默细胞系(补充信息，图S5a)与这些品系中内源性β-catenin的稳定性一致。
Jade-1抑制典型Wnt信号。(一)Jade-1抑制TCF/β-catenin报告活性。使用TCF应答启动子报告TOP-Flash和非应答对照报告FOP-Flash。Wnt信号通路的活性通过测量归一化为肾小球荧光素酶的相对萤火虫荧光素素酶活性单位（RLU）进行量化。用野生型β-catenin（β-cat）或β-catening S33A和Jade-1（J1）全长或Jade-1 dd（J1dd）转染293T细胞。给出了3个实验的平均结果。Error bars=SEM。使用单克隆标记和β-连环蛋白抗体检测蛋白质提取物，以检查构建物的表达。(b条)Jade-1抑制Xwnt8型-和β-连环蛋白-诱导异位轴形成非洲爪蟾胚胎。Xwnt-8号机组（0.34-0.45 pg）或β-连环蛋白（100-120 pg）mRNA，有或没有翡翠-1（全长0.8ng或dd1.2ng）mRNA注射到腹侧卵裂球中。LacZ公司（1.5 ng）作为阴性对照。总共进行了7个实验来比较全长Jade-1和Jade-1日注射胚胎。(c（c）)X-wnt-8型-和β-连环蛋白-诱导的异位轴被抑制翡翠-1在里面非洲爪蟾胚胎。柱状图描绘非洲爪蟾显示了胚胎表型。每个栏顶部显示的数字表示每个类别中的胚胎数量。采用卡方检验确定统计显著性Xwnt-8与Jade-1对比（p<0.0001）。#=Xwnt-8与Jade-1 dd对Xwnt-8（p=0.096），**=β-连环蛋白与Jade-1对β-连环蛋白（p<0.046），§=β-连环蛋白与Jade-1 dd对β-连环蛋白（p=0.087）。S=具有统计学意义，NS=不具有统计学意义。(d日)Jade-1调节内源性Wnt靶点。检测感染空载体（Vec）或Jade-1沉默慢病毒构建物（Jsh1和Jsh2）的293个细胞的WCL内源性Axin2和actin。显示了两个类似实验中的一个。
由于Jade-1破坏β-连环蛋白的稳定并抑制β-连环蛋白介导的反式激活，我们推断Jade-1可能抑制经典的Wnt途径体内我们对典型Wnt信号进行了功能分析，即异位轴的形成非洲爪蟾腹部注射胚胎Xwnt-8号机组或β-连环蛋白信使核糖核酸15.全长翡翠-1，但不是Jade-1日，显著抑制了Xwnt-8号机组-和β-连环蛋白-发育过程中诱导异位轴的形成非洲爪蟾胚胎(和补充信息，图S5b). 这些数据表明，Jade-1在Wnt-on阶段具有抑制Wnt活性的能力体内考虑到Jade-1和β-catenin在Wnt-on相的明显相互作用，这是合理的(和补充信息图S1b)非磷酸化β-连环蛋白的Jade-1结合和泛素化(补充信息，图S1f和). 特定Wnt目标Axin216年也有所增加翡翠-1沉默的293细胞系(). 其他Wnt靶点，如cyclin D1和c-Myc，在翡翠-1沉默细胞系(补充信息，图S5c). 全长Jade-1，但不是Jade-1 dd，降低c-Myc的蛋白质水平(补充信息，图S5d). 因此，Jade-1是典型Wnt信号的抑制剂。
Jade-1蛋白通过野生型pVHL稳定，但不通过与肾癌相关的突变pVHL三,4我们假设pVHL可能通过Jade-1调节β-catenin。首先，我们比较了甚高频-不足和甚高频-完整的肾癌细胞系(). 有趣的是，β-catenin的内源性细胞溶质和核池在甚高频-完整细胞系与甚高频-缺陷细胞系(). 这一结果可以根据我们之前的观察结果进行解释，即Jade-1水平在甚高频-缺陷细胞系5接下来，在786-O细胞中重新引入pVHL会增加内源性Jade-14,5并显著降低内源性β-catenin水平(和补充信息，图S6a). 击倒甚高频siRNA寡核苷酸导致Jade-1的下调和β-catenin的积累(和补充信息，图S6b)17.
pVHL通过Jade-1调节内源性β-catenin。(一)β-catenin蛋白水平取决于甚高频肾癌细胞系的状态。对肾细胞癌细胞系的细胞质和细胞核部分进行内源性β-连环蛋白的检测。显示了两个类似实验中的一个。(b条)pVHL下调内源性β-连环蛋白。从稳定表达空载体（Vec）或pVHL的786-O细胞提取液中检测内源性β-连环蛋白。使用多克隆Jade-1和单克隆pVHL抗体检测Jade-1和pVHL的表达。3个实验的代表性免疫印迹。(c（c）)pVHL敲除增加内源性β-catenin丰度。为了证实pVHL的敲除，使用来自未转染（Un）293T细胞或转染有甚高频（VHLsi）或对照siRNA（Csi）寡核苷酸，因为内源性pVHL丰度低17检测细胞组分中的内源性Jade-1和内源性β-catenin蛋白。3个实验的代表性免疫印迹。(d日)野生型pVHL和不稳定Jade-1的pVHL截断对内源性β-catenin的差异调节。用免疫印迹法检测转染野生型pVHL、pVHL del96-122（Δ96-122）、pVHL1-143和pVHL1-175的293T细胞提取物中的pVHL，内源性β-catenin和内源性Jade-1。显示了两个类似实验中的一个。(e（电子）)pVHL抑制内源性Wnt靶点。对表达pVHL的786-O细胞系的空载体（Vec）或pVHL表达的WCL进行pVHL、内源性LEF1和细胞周期蛋白D1的检测。3个实验的代表性免疫印迹。(（f）)野生型pVHL（而非pVHL del96-122）抑制β-catenin/Tcf靶基因。体外转录，加盖LacZ公司（0.288克），野生型VHL（重量）（0.194 ng）或VHL电话：96-122将（0.293 ng）mRNA注射到非洲爪蟾胚胎。在第10阶段采集注射胚胎进行RT-PCR。Wnt靶点的半定量RT-PCR分析克西莫伊斯和Xnr3号机组在整个胚胎中进行。ODC公司作为控制。统一=未被拒绝。
为了明确Jade-1是否介导β-catenin的pVHL下调，我们比较了野生型pVHL和不稳定Jade-1的截断型pVHLs对β-catentin的调节4(). pVHL del96-122和自然发生的致癌截断，如pVHL 1-143和pVHL 1-175，对Jade-1的稳定性几乎没有影响4，对β-catenin的影响最小(). 我们也撞倒了翡翠-1在pVHL存在下。pVHL增加了内源性Jade-1水平，这一效应被翡翠-1击倒(补充信息，图S6c). 重要的是，pVHL对β-连环蛋白的下调通过翡翠-1击倒(补充信息，图S6c). 此外，pVHL野生型，而非pVHL del96-122，抑制了β-连环蛋白的转录活性(补充信息，图S6d). 特定Wnt目标，如LEF118pVHL表达的肾癌细胞系中细胞周期蛋白D1降低(). 野生型pVHL，但不是pVHL del96-122，也降低了293T细胞中的Axin2(补充信息，图S6e). 总的来说，这些数据表明pVHL抑制β-catenin和典型Wnt信号，Jade-1是这些影响的关键介体。
确定pVHL是否能够减少内源性Wnt信号体内，为了检测野生型pVHL和pVHL-del96-122对Wnt活性抑制的差异，我们注射野生型VHL或VHL电话：96-122mRNA进入背侧卵裂球非洲爪蟾胚胎，其中典型Wnt信号对背部发育是必要的19.抑制背轴的形成非洲爪蟾用背内侧指数（DAI）量表测量的背内侧结构（小眼、小头或无脑儿）的减少可以证明胚胎的存在19在相同的蛋白质丰度水平上，野生型pVHL对背轴形成的抑制显著大于pVHL del96-122(补充信息，图S6f和S6g). 正如预期的那样，野生型pVHL对内源性轴的抑制与β-catenin/Tcf靶基因的更大抑制相关克西莫伊斯和Xnr3号机组比pVHL del96-122(). 因此，pVHL抑制典型Wnt信号体内和pVHL del96-122，它们只对Jade-1进行最小程度的结合和调节4,5，对背轴形成和Wnt靶基因的影响很小非洲爪蟾胚胎。这些数据进一步支持Jade-1作为β-catenin pVHL调节的关键介质的作用。
在本研究中，我们证明了Jade-1是β-catenin的单亚单位E3泛素连接酶，并且Jade-1 PHD对E3泛素连接酶功能至关重要。此外，Jade-1是pVHL抑制β-catenin和典型Wnt信号的关键介质。Jade-1具有抗增殖和促凋亡作用，而β-catenin具有促增殖、抗凋亡和致癌作用7因此，Jade-1的抑癌活性可能部分归因于β-catenin的抑制。
现已确定了几种用于β-连环蛋白的泛素连接酶9,20,21，但只有β-TrCP和Jade-1显示Wnt反应性，表明它们在典型Wnt信号的生理和病理生理学中都很重要。内源性β-TrCP存在于胞质溶胶中，能够结合和泛素化磷酸化的β-连环蛋白6,9,22,23相反，内源性Jade-1存在于细胞质中，但主要存在于细胞核中三,8并且能够结合和泛素化磷酸化和非磷酸化的β-连环蛋白。因此，Jade-1和β-TrCP只有部分重叠的亚细胞位置，并且对β-catenin的形式有不同的特异性。这些差异可以解释为什么翡翠-1β-TrCP不能完全补偿沉默(和补充信息，图S2b-d). 此外，Jade-1似乎在典型Wnt级联中作用更远，影响细胞核中的β-catenin。这可能使Jade-1负责精细控制β-catenin水平。
Jade-1是β-catenin的单亚单位E3泛素连接酶，而β-TrCP需要形成多亚单位蛋白质复合物。PHD作为适配器型E3泛素连接酶直接将泛素部分转移到底物13因此，控制Jade-1可能是调节β-catenin丰度的一种更简单、更有效的方法。该细胞很可能利用β-TrCP和Jade-1之间独特的功能和上下文差异来确保Wnt信号的有效调节。
β-catenin是肾癌和肾囊性疾病发病机制中的关键分子。例如，小鼠肾上皮中β-catenin活性的增加会导致肾囊肿和肿瘤的形成24-26在肾癌中，甲基化空气污染指数基因启动子很常见27最近发现，pVHL可抑制HGF介导的β-连环蛋白酪氨酸磷酸化28这些观察结果进一步加强了Wnt信号在肾细胞癌中的作用。Jade-1和pVHL也可能参与其他形式的囊性肾病，其中Wnt信号失调的证据正在增加26,29.
我们的数据表明，Jade-1对Wnt信号的抑制代表了pVHL的一个新的肿瘤抑制轴。此外，这些发现直接将肾脏特异性pVHL肿瘤抑制途径与Wnt信号级联（一种更普遍的肿瘤发生途径）联系起来。因此，Jade-1和β-catenin可能是肾细胞癌的治疗靶点。
