质谱法和核磁共振光谱法同时量化大量代谢物的能力导致了代谢物（代谢组学）及其通量（通量组学）的系统级检测1–三应用代谢组学研究人类疾病的初步工作主要集中在分析正常人与受影响人的生物液4–7虽然前景看好，但这种分析因个体之间的差异而变得复杂8此外，多细胞生物代谢过程的复杂性使得全面理解潜在的生物化学变得困难。
研究受影响个体生物流体的另一种方法是使用细胞模型在更可控的实验环境中探测疾病相关的代谢变化。病毒感染是一类具有有用细胞模型的人类疾病，因为病毒复制的核心过程在培养的哺乳动物细胞中得到了可靠的重现。
HCMV是一种β-疱疹家族的大型、包膜双链DNA病毒，潜伏感染大多数成年人。在健康人中，大多数感染都是无症状的，尽管它们可能会对健康造成长期影响，例如增加动脉粥样硬化的风险9,10更严重的是，该病毒是免疫缺陷人群发病和死亡的主要原因11也是出生缺陷的主要传染源，最常见的是导致听力损失12.
HCMV在多种细胞类型中复制，包括上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞和成纤维细胞，这些细胞为在体外病毒的培养13培养的成纤维细胞感染HCMV会在病毒早期和早期基因的前24小时触发转录，并调节宿主细胞转录14随后，一组更广泛的病毒基因转录、病毒DNA复制和在随后的48小时内广泛的病毒蛋白合成，最终导致新病毒的产生和释放15,16.
二十年来，人们已经知道HCMV感染在体外与受感染的成纤维细胞对葡萄糖的摄取增加有关，提示病毒诱导宿主细胞代谢上调17最近，我们检测了HCMV感染的融合成纤维细胞中细胞内代谢物的水平。感染后，参与糖酵解、三羧酸（TCA）循环和嘧啶核苷酸生物合成的中间体显著增加。代谢物浓度变化的程度远远超过未感染成纤维细胞在静止状态和生长状态之间的转换18.
尽管资料丰富，但有关代谢物浓度的数据本质上是不完整的。代谢物浓度升高可能反映其产量增加或消耗量减少。这些选择导致了对潜在生物学的根本不同理解。此外，它们具有独特的实际意义。例如，被病毒感染上调的酶催化通量抑制剂应被视为抗病毒药物。
对于生长在最小培养基上的微生物，在喂食部分标记碳源或标记碳源和未标记碳源的混合物后，可以基于蛋白质生成氨基酸的稳态标记模式来测量通量19,20与常见的模型微生物不同，哺乳动物细胞不在最小培养基上生长。相反，他们被洗澡了体内在过多的营养物质中，包括葡萄糖、谷氨酰胺和必需氨基酸，所有这些都包含在常见的组织培养基中。代谢输入的复杂性增加使得用于推断微生物代谢通量的方法不足以解析哺乳动物细胞中的通量。
同位素标记营养素的同化动力学包含了稳态标记模式所无法提供的丰富信息21在这里，我们通过动力学通量分析获取这一信息，其中液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）用于测量同位素标签从营养物质到下游代谢物的传递22,23然后，将动力学数据与选定代谢物流入和流出的直接测量以及特定稳态代谢物标记模式进行计算整合，以确定哺乳动物细胞中的代谢通量。
利用这项技术，我们发现HCMV感染上调了中心碳代谢通量以及核苷酸和脂肪酸生物合成的外排。随后的实验表明，脂肪酸生物合成的这种意外上调对于HCMV以及另一种医学上重要的包膜病毒甲型流感的复制至关重要。
结果
糖酵解、磷酸戊糖和核苷酸通量
HCMV感染48小时后，当代谢物浓度首次出现较大变化时，进行通量分析18使用了一组五种测定法：（i）直接测量关键的细胞代谢流入（葡萄糖和谷氨酰胺）和流出（丙酮酸、乳酸、丙氨酸和谷氨酸），（ii）均匀13C-标记葡萄糖，（iii）动力学通量剖面13C-标记的谷氨酰胺，（iv）使用[1,2探测糖酵解和磷酸戊糖途径（PPP）之间的分支点-13C] 葡萄糖和（v）丙酮酸氧化与羧基化分支点的[3-13C] 葡萄糖。动力学通量剖面实验涉及通过抽吸未标记培养基将细胞从未标记碳源快速转移到标记碳源，并用含有标记碳源的其他相同培养基替换。在同位素转换后的不同时间点收集样品，以通过LC-MS/MS进行分析。
HCMV感染增加了葡萄糖和谷氨酰胺的摄取以及乳酸和谷氨酸的排泄(). 与葡萄糖摄取和乳酸排泄增加相一致，糖酵解动力学分析表明糖酵酵解通量增加：HCMV感染细胞中标记的葡萄糖比模拟感染细胞中更快地转化为标记的糖酵化中间产物(). 感染细胞和未感染细胞中PPP五种碳物种的标记相似(). 与病毒相对于PPP对糖酵解的上调相一致，病毒感染降低了乳酸的比例13喂入[1,2后的C-标记碳-13C] 葡萄糖(). 当[1，2-13C] 葡萄糖通过非氧化PPP代谢，但不通过糖酵解。虽然PPP通量没有上调，但核糖-5-磷酸并入核苷酸的量增加了()与病毒诱导的核苷酸生物合成上调相一致16.
未感染和HCMV感染细胞的通量分析。(一)测定选定代谢物的流入和流出（每1.5×106细胞；平均值+2 s.e。；n个≥ 3). 负值是流入，正值是流出。(b条)细胞内积聚13切换1.5×10后C-标记的糖酵解代谢物（己糖-P、葡萄糖-6-磷酸及其异构体；FBP、果糖-1,6-二磷酸；3PG、3-磷酸甘油酯；PEP、磷酸烯醇丙酮酸）6细胞均匀排列13C-标记葡萄糖培养基。符号表示实验数据点±2s.e。；n个= 4; 行表示模型输出。(c（c）)标记动力学，如b条PPP中间体戊糖-P（5-磷酸核糖及其异构体）。(d日)含一个标记乳酸的百分比13喂入[1,2后的C原子-13C] 葡萄糖。这表明PPP：糖酵解通量比；非氧化PPP通量产生含乳酸的乳酸13C原子，而糖酵解通量没有。数据显示为平均值+2 s.e。；n个= 3). (电子)标记动力学，如b条和c（c），用于ATP。观察到的大部分标记来自ATP的核糖部分。GTP、UTP和CTP也有类似的结果。
三羧酸循环和柠檬酸穿梭
标签数量从[13C] TCA循环的第一个化合物柠檬酸盐产生葡萄糖，其在感染细胞中的累积速度是模拟感染细胞的20倍以上(). 这反映了受感染细胞中的柠檬酸盐池更大，并且该池的标记更快速和完整（相比之下). 尽管病毒感染细胞中几乎所有柠檬酸盐都被标记为13在15分钟内从葡萄糖中提取C，标记的苹果酸池少于30%(). 相比之下[13C] 谷氨酰胺（但不是葡萄糖）标记的柠檬酸盐、α-酮戊二酸盐和苹果酸盐都有相似的程度(). 这表明，一些从葡萄糖传递到柠檬酸盐的碳从TCA循环中被重定向。
未感染和HCMV感染细胞中TCA循环通量的剖面。(一)细胞内积聚13转移1.5×10后的C-标记柠檬酸盐6单元格一致13C-标记葡萄糖培养基。符号表示实验数据点±2s.e。；n个= 4; 行表示模型输出。(b条)转移1.5×10后柠檬酸盐标记动力学和模式的详细信息6模拟感染细胞均匀13C-标记葡萄糖培养基。符号表示实验数据点±2s.e。；n个= 4; 行表示模型输出。(c（c）)可比较数据b条但对于HCMV感染的细胞。(d日)标记动力学，如一苹果酸。(电子)范围13在均匀暴露2小时后，对所示TCA循环代谢物进行C标记（部分或全部）13未感染和病毒感染细胞中的C-标记葡萄糖（平均+2 s.e。；n个= 4). (（f）)可比较数据电子，但用于统一标记13C-标记谷氨酰胺(n个= 2). (克)柠檬酸盐梭子诱导均匀喂食的标记模式示意图13C-标记葡萄糖。该模式与一–电子。乙酰辅酶A的未标记部分来自辅酶A，为了简单起见，图中省略了辅酶A。
柠檬酸盐除了是TCA循环的中间产物外，还将两个碳单位从线粒体运送到胞浆，用于脂肪酸和胆固醇的生物合成。观察到的TCA循环标记模式()表明病毒诱导了该穿梭器的激活。如图所示，之后[13C] 在葡萄糖喂养下，柠檬酸盐穿梭物将标记的乙酰基单元（来源于葡萄糖）从线粒体转移到胞质溶胶，通过柠檬酸盐和两个13C原子。TCA循环中的四碳和五碳化合物不会被标记。柠檬酸盐细胞溶质裂解后释放的未标记细胞溶质草酰乙酸被NADH还原形成苹果酸，苹果酸要么脱羧形成丙酮酸和NADPH，要么泵回线粒体重新进入TCA循环24.
代谢物浓度和流量的绝对定量
虽然人工检查标签数据是生成假设的有用工具，但流入和流出TCA循环的大量通量使数据解释复杂化。这些包括通过丙酮酸羧化酶形成草酰乙酸，我们直接使用[3-13C] 葡萄糖(补充图1在线）和TCA相关氨基酸的流量。特别重要的是α-酮戊二酸和谷氨酸的快速相互转化，谷氨酸是一种丰富的细胞内代谢产物。大量谷氨酸可以稀释葡萄糖中的标记碳原子，使得TCA循环标记模式的定性解释不可靠25为了更定量地了解中枢碳代谢通量及其受HMCV感染的调节，我们建立了一个常微分方程模型(和补充图2在线），在固定代谢通量和池大小（即通量平衡）的假设下预测同位素标记动力学和模式26.
未感染和HCMV感染的融合人成纤维细胞中的代谢物浓度和通量。字体大小表示代谢物池大小（每1.5×106细胞）。箭头尺寸表示净通量（每1.5×106细胞）。颜色表示HCMV感染引起的褶皱变化。所有刻度均为对数。所示通量为中值(补充表5)从中显示的100个通量集补充表6和7字体大小和池大小的比例性的一个例外是丙二酰辅酶A，其浓度太小，无法用字体大小来描述。未直接测量其水平的代谢物以灰色斜体显示。氨基酸是由标准的三个字母代码命名的。己糖-P、葡萄糖-6-磷酸及其异构体；FBP，果糖-1,6-二磷酸；磷酸二羟基丙酮；3PG，3-磷酸甘油酯；磷酸烯醇丙酮酸；AKG，α-酮戊二酸；OAA，草酰乙酸。
我们首先通过实验确定模型中代谢物的绝对池大小。该方法包括通过同时均匀喂食对细胞内代谢物进行广泛标记13C标记葡萄糖和谷氨酰胺培养1周27然后，我们在已知浓度的未标记内标化合物存在的情况下提取标记的细胞内代谢物，并通过LC-MS/MS测定标记与未标记化合物的比率。对某些代谢物的标记不完整进行了校正(补充表1在线）。结果值如所示补充表2在线。与基于提取量的测量相比，在整个提取、样品处理和分析过程中使用内部标准大大提高了这些测量的可靠性就其本身而言。
然后，我们使用池大小数据、葡萄糖和谷氨酰胺的动力学通量剖面数据、代谢物流入和流出数据以及特定支点数据来搜索与实验结果一致的通量组合。完整的实验结果如所示补充表2-4和补充图3和4在线。使用全局参数识别算法获得了与实验数据一致的通量，并将成本分配给未在平均值±2 s.e.内重述观测到的实验数据的通量集28(补充方法在线）。将符合95%置信区间内实验数据的所有通量视为等效通量是防止过度拟合的关键措施，这是通量解释中的一个常见问题29为了进一步降低过度拟合的风险，我们没有确定一组最能概括实验结果的通量，而是确定了100个不同的通量集，这些通量集与观测数据近似。这使得能够估计观测通量的置信限。未感染细胞与病毒感染细胞的通量中值及其置信限如所示补充表5在线。
HCMV感染后的绝对池大小、绝对通量及其折叠变化如图所示池和通量随其图表大小呈指数级缩放，在代谢物和反应之间的绝对池大小和通量存在显著差异。未感染细胞中最活跃的途径是糖酵解，产生的大部分丙酮酸以乳酸形式排泄。TCA循环流量约为糖酵解流量的1%，主要由谷氨酰胺通过谷氨酸流入α-酮戊二酸所驱动。
HCMV引起的全球代谢变化
中的颜色显示HCMV感染引起的池大小和流量变化，红色增加，蓝色减少。值得注意的是，几乎整个路径图（PPP除外）都是红色的，这表明HCMV几乎在全球范围内上调了代谢流量。糖酵解通量增加约两倍(和补充表5)与病毒感染细胞葡萄糖摄取增加相一致17核苷酸生物合成通量增加了约三倍，与基于核苷酸的抗代谢药作为HCMV治疗药物的疗效一致30TCA循环通量增加更为显著，核心循环通量大幅上调（例如，从柠檬酸到α-酮戊二酸的约20倍），丙酮酸脱氢酶途径为循环提供营养（从丙酮酸到乙酰辅酶A的约80倍），四碳单元形成的反胸膜途径（丙酮酸到草酰乙酸的约4倍）和脂肪酸生物合成的两碳单元流出（柠檬酸到丙二酰辅酶A的约20倍）。与脂肪酸生物合成途径的上调一致，脂肪酸合成中的关键中间体丙二酰辅酶A的浓度从检测不到的水平增加到超过检测限十倍以上().
HCMV诱导脂肪生成。(一)未感染（黑色）和病毒感染（红色）细胞中丙二酰辅酶A的原始LC-MS/MS色谱图。(b条,c（c）)生产14C-标记脂质来自[14C] 未感染和HCMV感染的成纤维细胞中的葡萄糖。脂肪酸数据单独显示(b条)和甘油(c（c）)皂化脂类的部分（平均值+s.e。；n个= 3).
脂肪酸生物合成作为抗病毒靶点
许多上调的流量反映了非可行抗病毒靶点的基本过程。例如，TCA循环的典型步骤受损可能会导致氧化依赖性细胞类型（如心肌细胞和神经元）的严重代谢并发症。相反，脂肪酸合成虽然在生长发育中很重要，但在哺乳动物中并不是至关重要的31–33鉴于脂肪酸合成的大量上调，我们希望进一步探讨其在病毒感染中的作用。为了更直接地测试病毒感染是否增加葡萄糖驱动的脂质合成，我们喂养未感染或HCMV感染的成纤维细胞14C-标记葡萄糖。然后，我们提取并皂化脂质，并计算由此产生的脂质衍生脂肪酸和甘油组分中的放射性。结果数据证实，HCMV感染导致葡萄糖同化为脂肪酸和甘油部分的脂质显著增加().
接下来，我们使用脂肪酸生物合成酶乙酰辅酶A羧化酶（ACC）和脂肪酸合成酶（FAS）的药物抑制剂来确定HCMV诱导的脂肪酸生成上调对病毒复制是否必要(). ACC抑制剂5-十四烷氧基-2-呋喃甲酸（TOFA）治疗34，导致HCMV复制的剂量依赖性抑制，在10μg/ml时效果>1000倍−1TOFA公司。用FAS抑制剂C75（反式-4-羧基-5-辛基-3-亚甲基-丁内酯）处理35，导致类似的剂量依赖性抑制，在10μg ml时的效果是100倍以上−1综上所述，这些结果表明脂肪酸生物合成对HCMV的正常复制是必要的。
脂肪酸生物合成药物抑制剂对HCMV和流感复制的影响。(一)在载体（DMSO）、ACC抑制剂TOFA或FAS抑制剂C75（平均值+s.e。，n个= 4). (b条)HCMV IE1蛋白（主要亚型为~75 kDa）、UL26（两种亚型）和pp28在载体C75（10μg ml）存在下的累积−1)或TOFA（10μg ml−1)每个电池的MOI为3.0 PFU。微管蛋白水平显示为蛋白质负荷的控制。(c（c）)感染后24小时在载体TOFA（50μg ml）存在下产生A型流感病毒（MOI，0.1 PFU/细胞）−1)或C75（10μg ml−1). 数据显示为平均值+s.e。；n个= 4).
HCMV感染诱导病毒基因表达和随后蛋白质合成的时间协同级联。为了确定脂肪酸生物合成的抑制是否影响这一级联反应，我们分析了HCMV早期即时蛋白IE1、早期蛋白UL26（由两种亚型组成）和晚期蛋白pp28的积累(). C75或TOFA处理未影响所有三种蛋白质的积累。因为pp28的积累取决于病毒DNA的合成36这些结果表明，脂肪酸生物合成受到抑制导致的病毒生长缺陷发生在DNA复制之后。
由于丙二酰辅酶a积累而抑制FAS可能是有毒的，并且已经证明在一些转化细胞系中诱导凋亡37。C75和TOFA存在下病毒蛋白的正常积累表明，在当前条件下，测试药物浓度没有细胞毒性。为了直接测试宿主细胞的细胞毒性，我们将未感染的成纤维细胞暴露在C75或TOFA中96小时（病毒生长试验的长度），并通过台盼蓝排除法和药物去除后评估细胞生长来分析生存能力。治疗和未治疗细胞的两个终点相同。为了直接检测凋亡诱导，我们检测了caspase-3靶向聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的裂解。TOFA或C75处理24或72小时后，在模拟或HCMV感染的细胞中未检测到PARP的裂解，而0.5 M山梨醇通过渗透性休克诱导凋亡导致了caspase介导的PARP裂解的85-kDa片段特征(补充图5在线）。综上所述，这些结果表明，受试剂量的TOFA和C75阻止HCMV复制，而不会诱导宿主细胞毒性或凋亡。
HCMV复制晚期事件对脂肪酸生物合成的要求可能反映了从头开始病毒包膜或病毒蛋白脂质修饰中合成的脂肪酸。为了研究这一要求是否适用于其他包膜病毒，我们评估了在ACC抑制剂TOFA或FAS抑制剂C75存在的情况下A型流感的生长情况。TOFA抑制甲型流感复制超过1000倍，C75抑制复制超过10倍(). 因此，脂肪酸生物合成抑制剂会损害两种进化上分化的包膜病毒的正常复制。
讨论
哺乳动物细胞中代谢通量的量化能力对于理解正常代谢调节和广泛疾病的病理生理学至关重要。这些包括明显的代谢状况（如糖尿病）和涉及继发性代谢紊乱的状况（如癌症）。尽管之前对哺乳动物细胞代谢通量的研究在特定途径和分支点方面取得了许多重要结果（参见，例如，参考文献。38–40)，它们还不足以生成全面的代谢通量图。基于氨基酸稳态同位素标记模式的微生物流组学方法不容易转化为哺乳动物细胞，因为哺乳动物细胞需要不同的营养输入（使标记模式数据的解释复杂化），并且不能合成必需的氨基酸从头开始（仅限制从氨基酸分析中获得的信息）。
我们使用同位素标记营养素同化到下游代谢物的动力学来剖析哺乳动物细胞中的代谢通量。通过将动力学数据与代谢物摄取和排泄率以及稳态标记模式的选择性测量相结合，可以实现可靠的通量测定。与微生物通量测定一样，计算数据集成是通过遗传算法实现的，该算法搜索与实验数据一致的通量组合41这项研究的一个显著特点是识别了一大组接近于在95%置信限内重述实验结果的通量组合。与基于平均实验结果识别单通量解决方案的方法相比，该方法避免了过拟合，并提供了通量置信限。这使得通量发生显著变化（在这种情况下补充表5不重叠）以进行可靠识别。通量反褶积的下一步将包括采集和合并与辅因子反应相关的数据，例如耗氧量，以了解NAD（H）氧化和还原的速率。
将这种流量测量方法应用于模拟和HCMV感染的人成纤维细胞，发现感染细胞中的流量显著上调。在检测的41个通量中，28个通量在未感染细胞和感染细胞之间的分布不重叠，所有病例中感染细胞的通量都较大(补充表5). 因此，HCMV导致几乎全球代谢上调。HCMV上调代谢流量（包括脂肪酸生物合成）的机制目前尚不清楚。病毒诱导的转录变化可能对某些途径起作用。例如，通过微阵列和定量PCR分析，我们发现磷酸果糖激酶-1转录物在整个感染过程中上调，可能导致糖酵解通量增加18在其他情况下，病毒诱导的代谢基因转录似乎不起作用。例如，ACC转录不会因HCMV感染而改变14,18在这种情况下，代谢蛋白的翻译后修饰可能在病毒诱导的流量改变中发挥作用。
核苷酸生物合成，目前用于治疗HCMV感染的抗代谢药物的靶点42是HCMV上调的通量之一。因此，我们的方法有效地确定了一种上调途径，已知其抑制作用与HCMV治疗具有临床相关性。与核苷酸生物合成一样，脂肪酸生物合成在哺乳动物中可以被药物抑制，而不会产生严重的副作用。我们的观察表明，HCMV增加脂肪酸生物合成的流量至少与核苷酸生物合成的增加量一样多，这表明，为治疗高脂血症和肥胖而开发的脂肪酸生物生成抑制剂可用于削弱HCMV的复制。事实证明，脂肪酸生物合成关键步骤的抑制剂TOFA就是这种情况，它将HCMV滴度降低了约1000倍。值得注意的是，TOFA还影响A型流感病毒的复制，该病毒与HCMV几乎没有共同之处，除了存在脂质膜。
脂肪酸生物合成抑制作用针对HCMV和甲型流感的具体机制尚待确定。可能包括阻止病毒出芽所需的膜成分变化，妨碍特殊包膜磷脂的合成43或阻碍蛋白质的脂肪酸修饰44值得注意的是，甲型流感病毒感染细胞释放的血凝素对非特异性脂质合成抑制剂cerulenin敏感45类似地，丙型肝炎病毒复制通过香叶基香叶基焦磷酸的水平和富含胆固醇的膜域中发现的蛋白质的活性与宿主胆固醇合成有关46此外，最近的代谢组学分析发现猴免疫缺陷病毒诱导的脑炎中磷脂酶A2活性升高47，最近一项基于RNAi的筛选发现，参与糖脂和肌醇代谢的几个基因对HIV复制很重要48综上所述，这些结果表明脂质代谢是治疗各种包膜病毒感染的有效治疗靶点。此外，脂代谢抑制剂可能具有相对广谱的抗病毒活性，使其能够用于病毒综合征患者，而无需识别特定的潜在病原体。
对于任何潜在的新治疗方法，重要的是权衡预期疗效与副作用。3-羟基-3-甲基-谷氨酸-CoA还原酶抑制剂（他汀类）的临床成功表明，脂代谢抑制剂可以是安全有效的人类治疗药物。对于通过抑制脂肪酸生物合成治疗病毒感染，靶向ACC可能比靶向FAS更具临床实用性，因为抑制FAS会导致严重厌食和体重减轻49在哺乳动物中，ACC作为两种组织特异性同工酶存在于脂肪组织和肝脏中——ACC1，以及肝脏、心脏和骨骼肌中的ACC2。尽管ACC1在胚胎发生过程中至关重要32TOFA（非同工酶特异性）在大鼠体内耐受性良好，包括在怀孕期间和出生后发育期间。口服TOFA（150 mg/kg/天）导致稳态血浆浓度（30μg ml−1)高于阻止HCMV复制所需的剂量（10μg ml−1)31.此剂量与血浆胆固醇和脂肪酸的降低有关，且无明显毒性或致畸迹象31虽然需要进行广泛的临床试验，但这暗示TOFA或另一种ACC抑制剂可能具有良好的风险效益比50用于治疗HCMV感染或控制对当前药物耐药的甲型流感疫情。
过去几十年来，癌症和病毒感染之间的联系一再出现。病毒是导致癌症的重要原因，癌症和病毒都以特定基因为靶点，包括肿瘤抑制因子，以覆盖细胞周期和DNA复制的正常控制。我们的结果将这些相似性扩展到了细胞代谢领域。我们发现大量病毒诱导的核苷酸生物合成、糖酵解和脂质生物合成上调。核苷酸生物合成增加长期以来被认为是癌症的标志，糖酵解升高是Warburg效应的类似物51最近，葡萄糖转化为脂肪酸的流量增加已成为肿瘤发生的一个特征52很可能，除了提供更具体的靶向病毒感染的手段外，了解病毒诱导的代谢流量调节机制也将有助于癌症研究。
方法
生物试剂和细胞培养
MRC-5成纤维细胞（ATCC）在含有7.5%胎牛血清和4.5g l−1葡萄糖。在感染之前，成纤维细胞在10厘米的培养皿中生长至汇合，产生约1.5×106每个培养皿的细胞数。在汇流处培养3-5天后，去除含血清培养基并添加无血清培养基。然后将细胞在无血清DMEM中保存24小时，这表明可以同步G细胞中的细胞0细胞周期阶段18然后以每细胞3.0个斑块形成单位（PFU）的感染多重性（MOI）模拟感染或感染HCMV。我们使用了HCMV株BADwt，它来自HCMV AD169株的细菌人工染色体（BAC）克隆53将BAC插入HCMV基因组中，不删除任何病毒序列，并用共转染的Cre重组酶切除，该重组酶在HCMV的基因组中介导重组液氧磷位于BAC两侧的站点，只剩下液氧磷病毒克隆中的位点。该克隆已在各种检测中进行了测试，并且始终显示出野生型AD169表型。经过2小时的吸附期后，抽吸病毒接种物并添加新鲜的无血清DMEM。
TOFA（Biomol International）和C75（Calbiochem）保持为10 mg ml−1DMSO库存。为了评估代谢抑制剂存在下HCMV的生长情况，在含有10%血清的DMEM中，在抑制剂存在下以指定剂量感染密集融合的成纤维细胞。培养2小时以允许病毒吸附后，通过柠檬酸钠清洗（40 mM柠檬酸钠、10 mM KCl和135 mM NaCl，pH 3.0）灭活未结合病毒，然后使用DMEM清洗，然后在含有10%血清的DMEM中以指示的抑制剂剂量进行培养。感染48小时后，改变细胞培养基，并添加新鲜培养基和代谢抑制剂。96小时后，刮除细胞，并通过MRC-5细胞上的标准斑块试验测定病毒滴度。为了评估甲型流感的生长，将完全融合的Madin-Darby犬肾上皮细胞（MDCK细胞；ATCC）在流感感染缓冲液（含有0.2%BSA、0.01%CaCl的DMEM）中用A/WSN/33流感株（ATCC）感染2，0.01%氯化镁2，1微克毫升−1胰蛋白酶（沃辛顿）和0.1%胎牛血清）。通过MDCK细胞的标准斑块试验测定病毒滴度。
通过在DMEM（用于成纤维细胞）或Flu感染缓冲液（用于MDCK细胞）中用不同剂量的药物抑制剂处理未感染细胞，并持续与病毒生长试验相同的时间（成纤维细胞为96小时，MDCK为24小时），分析TOFA和C75的潜在毒性。与抑制剂孵育后，对处理过的细胞进行台盼蓝排除分析，发现其存活率>95%。经抑制剂处理的细胞也在没有抑制剂的情况下进行了移植，发现其生长动力学与未经处理的细胞相似。对于MDCK细胞，50μg ml−1TOFA用于甲型流感生长试验，因为MDCK细胞对该剂量有良好的耐受性。较低的TOFA剂量可能对未转化的宿主细胞有效，因为癌细胞通常具有强烈的上调从头开始脂质生物合成。
代谢组学实验
通过添加10 mM HEPES和适当形式（标记或未标记）的葡萄糖和谷氨酰胺，以不含葡萄糖或谷氨酰胺的DMEM（Sigma）制备标记DMEM培养基，最终浓度为4.5 g l−1葡萄糖和0.584 g l−1谷氨酰胺（标记葡萄糖和剑桥同位素实验室标记谷氨酰胺），然后进行无菌过滤。对于动力学通量剖面实验，在切换到13C标记介质。这最小化了同位素转换时由于去除累积的代谢废物而产生的代谢组扰动。如前所述，进行代谢组淬火和提取18.绝对代谢物定量涉及使用统一标记的细胞代谢物的扩展标记[13C] 葡萄糖和[13C] 谷氨酰胺和在已知浓度的未标记标准溶液中提取（详情见参考文献）。23,27和补充方法).
葡萄糖和谷氨酰胺的摄取量以及所有测量代谢物的排泄量（丙酮酸、乳酸、丙氨酸和谷氨酸的排泄量显著）是从感染后48小时内采集的培养基样品中测定的。通过酶分析（E00715251，R-Biopharm）测定葡萄糖。其他化合物通过LC-MS/MS进行测量，包括谷氨酰胺、谷氨酸、丙酮酸、乳酸和丙氨酸的同位素内标物。
使用[1,2估算糖酵解和PPP之间的相对碳通量-13C] 所述葡萄糖38在标记培养基中培养4h，并用LC-MS/MS检测标记形式的乳酸。根据[3-13C] 葡萄糖在6小时内转化为苹果酸、天冬氨酸和柠檬酸（有关详细信息，请参阅补充方法).
液相色谱-串联质谱分析
通过电喷雾电离（ESI）将两种不同的LC分离耦合到以多反应监测模式运行的三重四极质谱仪。如前所述，与正模式ESI耦合的LC方法是在碱性pH条件下在氨丙基柱上进行亲水作用色谱54.与负模式ESI耦合的LC方法是使用胺基离子对试剂的反相色谱法（参考文献中使用的方法的变体）。55). 固定相和流动相是相同的，但梯度变化如下：t吨= 0, 0%B类；t吨= 5, 0%B类；t吨= 10, 20%B类；t吨= 20, 20%B类；t吨= 35, 65%B类；t吨= 38, 95%B类；t吨= 42, 95%B类,t吨= 43, 0%B类；t吨= 50, 0%B类; 哪里B类指含甲醇的流动相。对于LC，我们使用LC-20 AD HPLC系统（岛津），自动进样器温度为4°C，进样量为10μl。对于MS，我们使用了TSQ Quantum Ultra或Discovery Max三重四极质谱仪（Thermo Fisher Scientific）。质谱参数如参考文献所述。54增加了额外的多重反应监测扫描，以测量部分标记的化合物。所有数据都根据天然丰度进行了校正13C（参见补充方法).
脂质合成的测量
为了直接检测葡萄糖转化为脂质的流量，我们将成纤维细胞（感染或模拟感染48小时）转移到含有放射性葡萄糖（8μC ml）的培养基中−1[14C] 葡萄糖，1克升−1). 培养4 h后，抽吸培养基，用PBS清洗细胞，并通过添加500μl 60:40己烷：异丙醇提取磷脂。然后用额外的400μl己烷：异丙醇混合物清洗培养皿。在N2气体，再次悬浮在500μl 1 N KOH和90:10甲醇：水中，并在70°C下培养60分钟，以皂化脂类。然后添加硫酸（100μl，2.5 M），然后添加己烷（700μl）以提取皂化脂肪酸。通过离心和闪烁计数分离有机相和水相。
通量的计算测定
根据中的图表构建了中心碳代谢的常微分方程模型补充图2该模型由69个微分方程组成，用于维持通量平衡。模型方程描述了喂食[U-13C] 葡萄糖或[U-13C] 谷氨酰胺培养基，并按以下方式书写：
其中代谢物B直接位于代谢物A模型的下游1，A2，…，AN个,F类总数是流入（或等于流出）总B池的总通量，B类X（X）是化合物B的特定同位素形式的池大小；F类我是我第个流入B的通量；是A的所有同位素形式的总和我注入的B类X（X）直通通量F类我,是A的总池大小我（即A的所有标记形式和未标记形式的总和我),B类总数是B和的总池大小N个是进入B的通量数。该模型没有明确包括核苷酸氧化或还原或磷酸盐转移反应（如NAD+还原或ATP水解），因为这些反应的速率不能用13C-示踪剂。
参数（通量和未测量浓度）由C/C++中实现的遗传算法识别，该算法寻求参数值，以最小化实验观测值和计算结果之间的差异。只有当模型输出超出实验室数据的95%置信限（平均值±2 s.e.）时，才应用成本。对模拟和病毒感染数据进行了20次独立的遗传算法运行，以获得最佳流量估计值的分布，如补充表5-7在线。有关计算详细信息，请参见补充表8-10在线，补充方法和补充计算代码在线。
在建立通量平衡模型时，蛋白质生物合成的氨基酸流出用符号表示X（X）（如所示补充图2). 模型中每个氨基酸的流出量被写成X（X），其中X（X）是培养基中不存在的所有氨基酸（丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和脯氨酸）和谷氨酰胺向蛋白质的流出总量。这些组分是根据蛋白质中氨基酸的相对丰度估算的，包括HCMV蛋白质组中人类蛋白质组中氨基酸的丰度56胶原蛋白。感染细胞和未感染细胞的丰度比均近似为6:4:3:5:5:4（Ala:Asp:Asn:Glu:Pro:Gln）。显示的分数补充图2谷氨酸（10/27）占谷氨酸及其产物脯氨酸的比例，天冬氨酸（7/27）也占天冬酰胺的比例。如所示补充图2,X（X）完全受其他模型通量的约束，因此不会作为参数出现在模型中。
蛋白质分析
蛋白质积累用western blot分析。用PBS清洗细胞，刮取并溶解在破坏缓冲液中（50 mM Tris（pH 7.0）、2%SDS、5%2-巯基乙醇和2.75%蔗糖）。将所得提取物进行超声处理，并在14000℃下离心克使不溶性物质颗粒化5分钟。在含有10%SDS的聚丙烯酰胺凝胶中对等量的分数进行电泳，并转移到硝化纤维板上。然后用胭脂红S对印迹进行染色，以确保相等的蛋白质负载和转移，通过用5%牛奶处理来阻断，并与第一抗体反应。使用的抗体对UL99编码的pp28（10B4-29；参考文献。57)，UL123编码IE1（1B12；T.S.，未发布数据），UL26（7H19；参考。58)、PARP（圣克鲁斯生物技术）或tubulin（表观）。根据制造商的说明（Pierce），通过增强化学发光检测显示蛋白质条带。微管蛋白水平分析可作为额外的蛋白质负荷控制。
