细胞质蛋白酶体对线粒体内蛋白质的降解

泛素参与UCP2的降解

由于蛋白酶体降解并非完全由多泛素破坏标签与蛋白质结合介导(Murakami等人，1992年)，我们探索了UCP2在细胞中是否泛素化，以及这种泛素化是否影响UCP2的降解。

利用细胞裂解物中UCP2的免疫沉淀（IP）和泛素（Ub）的免疫检测，我们寻找代表多泛素化UCP2物种。我们希望在用扰乱的短干扰（si）RNA（Scr）处理的细胞中观察到这样的物种，但在那些被敲除UCP2（KD）的细胞中观察不到，并且它们应该不存在于用非抗原特异性（正常）免疫球蛋白敲除的细胞裂解物中。图2A，通道1显示来自分子量范围（>30kDa）的物种的强烈信号，这些物种以UCP2特有的方式消失（参见。图2A，2-4车道）。

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图2。

泛素参与UCP2降解。(一)用200 nM打乱（Scr）或UCP2（KD）siRNA处理INS-1E细胞48小时。用IP缓冲液溶解细胞，用蛋白A结合珠和抗UCP2或抗Ub抗体或非抗原特异性（正常）免疫球蛋白（N.Ig）在4°C下孵育裂解产物1小时，然后在凝胶加载缓冲液中煮沸造粒并变性。蛋白质通过SDS-PAGE分离，并对Ub、UCP2或ANT进行免疫印迹。非特异性：条带不依赖于与UCP2或泛素的特异性相互作用。(B类)将200 nM干扰siRNA（Scr）或靶向UCP2（KD）的siRNA转染INS-1E细胞。免疫沉淀实验中使用的Scr/UCP2-KD细胞进行UCP2、ANT和β-actin的免疫印迹。电池负荷：1×10⁵单元格/车道。(C类,D类)以0.5μg/ml DNA转染纯化的HA标记的WT-泛素、K48R-泛素和赖氨酸-KO-泛素质粒20-24小时。然后用10μg/ml环己酰亚胺（CHX）处理INS-1E细胞，在所示的时间点采集并重新悬浮在凝胶负载缓冲液中。使用SDS-PAGE（1×10）分离蛋白质⁵细胞/通道）和HA（C）或UCP2（D）免疫印迹。D中的值为平均值±s.e.m(n个=3），针对负载进行校正（β-actin）。通过重复测量ANOVA（匹配非零时间点的比较）和Dunnett的事后检验确定统计显著性(*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001). 显示了典型的UCP2免疫印迹（分子量~30 kDa）。

细胞裂解物中泛素的相互免疫沉淀以及UCP2的免疫检测如图所示图2A类似地，第5-8条通道显示，在细胞中没有UCP2（第6条通道）或使用非特异性抗体下拉（第7条和第8条通道）时，代表多泛素化UCP2的信号不太显著或不存在，只看到非特异性带。

为了测试泛素化是否对UCP2特异，或对线粒体载体更普遍，我们剥离了含有5-8通道的硝化纤维素膜，并用抗ANT抗体重新缝合(图2A，9-12车道）。正如预期的那样，这导致非特异性条带的下拉，这在正常的免疫球蛋白下拉中也可以看到(图2A，2、4、7和8道），包括分别为~50kDa和~23kDa的重链和轻链免疫球蛋白。然而，在这些实验中没有发现泛素化ANT的迹象。因此，尽管ANT与UCP2相似，且丰度远高于UCP2，但ANT不会被抗Ub抗体拉下，因此，ANT不可测量为泛素化。

为了测试UCP2的多泛素化是否与其降解有关（并探索泛素连接的性质），我们用编码野生型（WT）的表达质粒转染INS-1E细胞Ub和两个显性阴性突变体：一个K48R-Ub突变体，它特别不能形成K48连锁的多泛素链；另一个赖氨酸敲除（KO）Ub突突变体，其中所有赖氨酸都突变为精氨酸。K48R突变体应该仍然能够形成所有类型的多泛素延伸和连接，除了那些涉及K48的，而赖氨酸敲除突变体应该不能通过任何赖氨酸形成连接，例如通过K29和K33的。如果它们与内源性泛素竞争并以防止形成多泛素破坏标签的方式修饰UCP2，这些突变体应延长UCP2半衰期。由于WT和突变体Ub是HA标记的，我们使用抗HA抗体来证实转染质粒中适当的Ub的成功表达(图2C).

将环己酰亚胺添加到转染细胞中，然后进行UCP2免疫印迹分析，结果表明突变的Ub质粒（K48R-Ub和KO-Ub）均显著延缓了UCP2的衰变(图2D)，K48R-Ub将UCP2半衰期延长至对照值的约150%，KO-Ub延长至对照值的约175%。尽管WT-Ub诱导UCP2降解速度加快（并且UCP2半衰期缩短），但降解动力学与模拟转染细胞没有显著差异。这些显性阴性突变体引起的抑制是不完全的，可能是因为存在内源性Ub。K48R-Ub和KO-Ub的作用彼此没有显著差异，这表明通过K48残基的Ub连接是将UCP2靶向蛋白酶体的主链延伸，尽管不能排除其他连接。

UCP2降解的调节

除了抑制泛素蛋白酶体系统外，影响线粒体生物能量状态的化合物也影响UCP2的周转(图3). 所有降低线粒体质子动力Δp（图S3C）的测试化合物都减缓了UCP2的周转。这些化合物包括呼吸抑制剂，可防止Δp的生成(图3A)，和消散Δp的化合物，即化学解偶联剂羰基氰化物-第页-三氟甲氧基苯腙（FCCP）和氧化还原循环醌甲萘醌(图3B)线粒体通透性转换孔的已知诱导物(Tonnello等人，2004年). 黑精对Δp（ΔpH）化学成分的耗散对UCP2降解没有影响(图3B)表明UCP2降解不需要ΔpH。与未经处理的细胞相比，环己酰亚胺处理对线粒体膜电位没有显著影响（未显示）。

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图3。

线粒体生物能量学对UCP2降解的调节。用下述效应器处理INS-1E细胞30分钟，然后用10μg/ml环己酰亚胺处理。在所示时间采集样品，用SDS-PAGE（1×10）分离⁵细胞/车道），对UCP2进行免疫印迹并通过密度测定进行量化。(一)使用10μM鱼藤酮（抑制复合物I）、10μM抗霉素A或10μM粘噻唑（抑制Q）抑制呼吸链_o个和Q_我综合体III的现场）。(B类)用20μM FCCP（消散Δp）、0.5μM尼葛酸（消散△pH）或75μM甲萘醌处理。(C类)用1μg/ml寡霉素（抑制Fo/F1 ATP合成酶）治疗，有或没有20μM FCCP或溶酶体抑制剂10 mM NH₄Cl.值为平均值±标准误差(n个=3），针对负载进行校正（β-actin）。通过重复测量ANOVA（匹配非零时间点的比较）和Dunnett的事后检验确定统计显著性(*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001). 典型的UCP2免疫印迹（分子量~30 kDa）如补充材料图S2所示。

由于Δp或其电气元件（膜电位，ΔΨ）的耗散_米)也会导致ATP耗竭，我们测试了F_o个/F类₁ATP合成酶抑制剂寡霉素，其停止线粒体ATP合成并降低细胞ATP，但不使线粒体去极化（补充材料图S3C，D）。寡霉素部分抑制UCP2降解(图3C)表明ATP是必需的，正如泛素蛋白酶体系统功能所预期的那样。然而，用寡霉素和FCCP预培养细胞会导致对UCP2降解的强烈抑制(图3C)，表明除了ATP外，Δp的维持对UCP2的快速降解也很重要(图3C). 我们可以推测ΔΨ_米可能是UCP2去折叠所必需的[就像其他蛋白质一样(Huang等人，2002年;Prakash和Matouschek，2004年)]以及从膜中提取。

与ΔΨ相反_米而ATP对活性氧（ROS）的影响与抑制UCP2降解无关(图3，补充材料图S3A，B）。一些抑制UCP2降解的化合物提高了ROS（鱼藤酮，抗霉素A），而其他化合物没有显著作用（寡霉素）或略微降低ROS（甲萘醌，FCCP）。据报道，呼吸抑制剂可以稳定内膜中的UCP2（也就是说，通过减少周转），这可能是通过增加ROS实现的(Giardin等人，2008年). 我们的结果表明，呼吸抑制剂通过对ATP和ΔΨ的影响影响UCP2降解_米而不是通过它们对活性氧的影响。

接下来，我们检测了FK506结合蛋白8（FKBP8），一种与26S蛋白酶体与线粒体相连的蛋白(Nakagawa等人，2007年)可能在促进蛋白酶体与线粒体外膜的结合方面很重要，因此在UCP2降解方面也很重要。图4A结果表明，siRNA对FKBP8的敲除在统计学上显著减缓了细胞中UCP2的周转，表明FKPP8可能参与了UCP2降解途径，蛋白酶体可能在细胞液和线粒体外膜之间的界面上访问UCP2。

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图4。

UCP2附着和逆行移位。(一)用200 nM干扰siRNA或靶向FKBP8的siRNA处理INS-1E细胞48小时。UCP2降解测定如下图1蛋白质（1×10⁵细胞/车道）通过SDS-PAGE分离并免疫印迹UCP2和β-actin。数值为平均值±标准误差(n个=4），针对负载进行校正（β-actin）。通过重复测量ANOVA（匹配非零时间点的比较）和Dunnett的事后检验确定所有统计显著性(*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001). (B类)用PIC-1处理INS-1E细胞2小时，并使用Q蛋白组细胞室试剂盒进行分离。蛋白质通过SDS-PAGE分离并进行UCP2免疫印迹。将数值归一化为用于生成分数的单元格编号，并显示平均值±s.e.m(n个=3). 统计显著性由Student’st吨-测试。重要P（P）显示值。

图4B显示了一项旨在测试UCP2是否可以从内膜输出到胞浆的实验的结果。将细胞与蛋白酶体抑制剂混合培养2小时，然后进行分馏。在有PIC的情况下，细胞溶质和核组分中回收的UCP2比例显著增加。这不太可能是预先输入的UCP2，因为在环己酰亚胺存在下的类似实验也显示，蛋白酶体抑制后UCP2的细胞溶质增加（未显示）。这一观察结果表明，当蛋白酶体受到抑制时，一些UCP2从内膜输出到胞浆并去泛素化，但不会进一步降解。该反应可以通过蛋白酶体帽进行，其去泛素化活性在蛋白酶体抑制剂存在下保持活性(Verma等人，2002年)或通过去泛素化酶。用多面体获得的类似观察结果内质网蛋白也有同样的解释(Oberdorf等人，2006年).

蛋白酶体抑制

在进行UCP2转换实验之前，用蛋白酶体抑制剂处理INS-1E细胞2小时。蛋白酶体抑制剂cocktail-1（PIC-1）包括30μM MG132、10μM乳酸菌素和10μM PI-1[Z-Ile-Glu（Ot-Bu）-Ala-Leucinal]。PIC-2包括30μM ALLN(N个-乙酰-Leu-Leu-Nle-CHO；钙蛋白酶抑制剂）、5μ。AdaAhx公司_三L（左）_三VS在5μM下使用。蛋白酶体抑制剂以所示的浓度使用，鸡尾酒以其成分的添加剂浓度使用。所有蛋白酶体抑制剂均来自Calbiochem。

细胞中UCP2降解的生物能量调节

INS-1E细胞与10μM鱼藤酮、10μM抗霉素A、10μM粘噻唑、75μM甲萘醌、20μM FCCP、0.5μM尼葛霉素、1μg/ml寡霉素或10 mM NH孵育₄在测量UCP2降解之前，Cl保持30分钟。

INS-1E细胞活性氧、线粒体膜电位和ATP水平的测定

在96-well板中进行测量，每孔接种40000个INS-1E细胞过夜。细胞在Krebs-Ringer-Hepes缓冲液（135 mM NaCl，3.6 mM KCl，10 mM Hepes，1.5 mM CaCl）中培养_2·H（H）₂O、 0.5 mM氯化镁₂，0.5 mM NaH₂人事军官₄2 mM葡萄糖，5%v/v FCS，2 mM谷氨酰胺，pH 7.4），实验前30分钟。在λ_前任/λ_{相对长度单位}510纳米/580纳米。用25 nM四甲基罗丹明甲酯（TMRM）在λ_前任/λ_{相对长度单位}555纳米/588纳米。根据制造商的说明，使用ATPlite发光荧光素酶检测试剂盒（Perkin Elmer）测定细胞ATP水平。所有数据均使用Spectramax Gemini XPS平板阅读器（分子设备）收集，并使用SoftMax Pro软件记录。

免疫印迹法

通常为1×10⁵用12.5%SDS-PAGE分离细胞或凝胶负载缓冲液中的25μg线粒体蛋白（10%（w/v）SDS、250 mM Tris-HCl（pH 6.8）、5 mM EDTA、50%（v/v）甘油、5%（v/v）β-巯基乙醇、0.05%（w/v）溴酚蓝），用半干法转移到Protran硝化纤维素膜（Whatman）上（20 v 30分钟），并用0.2μg/ml抗人UCP2山羊多克隆IgG抗体（Santa Cruz Biotechnology，cat.no.sc-6525）、0.2μg/ml抗人腺嘌呤核苷酸转位酶（ANT）山羊多克隆抗体（SantaCruz biotechnoology，cat no.sc-9300）、0.2微克/毫升抗人β-肌动蛋白兔多克隆Ig g抗体（Abcam，UK，cat.no.ab8227）、，或0.2μg/ml抗HA（英国Abcam，目录号ab9110）。二级抗体为免疫纯（Pierce）过氧化物酶偶联抗体，即0.08μg/ml羊抗兔（猫编号31463）IgG或0.04μg/ml兔抗羊IgG（猫编号31633）。必要时，使用Restore PLUS western blot剥离缓冲液（Pierce）剥离膜，并根据制造商的说明重新缝合。

使用Lumigen®ECL Plus Western印迹检测系统（Amersham Biosciences）开发免疫印迹。通过使用ImageJ软件分析条带强度来量化蛋白质(网址：http://rsb.info.nih.gov/ij/)如Affourtit and Brand所述(Affourtit and Brand，2008年). 额外的负荷控制按如下方式进行：对于细胞实验，使用β-肌动蛋白信号校正UCP2信号，对于线粒体实验，使用考马斯染色膜（使用凝胶蓝染色试剂，皮尔斯）中每个通道的整个密度校正总蛋白的UCP2信号。

泛素质粒的扩增与分离

大肠杆菌在37°C下，在含有100μg/ml氨苄西林的Luria-Bertani培养基中，隔夜培养含有HA标记的野生型（WT）、敲除型（KO）或K48R-泛素pRK5质粒（Addgene cat.nos.17608、17603、17604）。根据制造商的说明，使用EndoFree Plasmid Maxi Kit（Qiagen）分离质粒。使用NanoDrop 1000分光光度计测定DNA浓度（A₂₆₀)和质粒纯度（其中A₂₆₀/A类₂₈₀＞1.8表示几乎没有或没有蛋白质污染）。获得的所有值均大于1.8。

转染实验

免疫沉淀

通过在4°C下与蛋白A结合珠培养1小时，然后造粒珠并将1 ml细胞裂解液转移到新鲜试管中，清除来自搅乱siRNA-处理或UCP2-KD细胞的裂解液。将清除的细胞裂解物与各种抗体在4℃孵育1小时，然后与蛋白A结合珠在4℃再孵育一小时。使用的抗体为0.5μl抗Ub血清（Abcam ab19247）、0.05μg多克隆兔抗UCP2抗体（Calbiochem，分类号144157）或0.05μg兔正常IgG抗体（Calbiochem（分类号NI01）。兔UCP2抗体因其特异性而被选择用于该应用，并按照山羊抗UCP2的描述进行了验证(Azzu等人，2008年).

重组体外UCP2降解试验

如前所述分离线粒体(Affourtit and Brand，2006年)但没有蛋白酶抑制剂。通过在10000℃下离心冷冻和解冻的线粒体制备粗有丝分裂体克持续10分钟。线粒体和有丝分裂体在改良的蔗糖-荷叶缓冲液（2 mM二硫苏糖醇（DTT）、0.25 M蔗糖、20 mM Hepes、2 mM EGTA、10 mM KCl、5 mM MgCl）中重新悬浮至920μg/ml₂0.1%（w/v）脱脂牛血清白蛋白，pH 7.4）。对于每次分析，240μg线粒体和/或有丝分裂体与ATP再生系统（1 mM ATP、10 mM磷酸肌酸和20 IU/ml肌酸激酶）和泛素混合物（70μg泛素、1.4μg组分1、1.4μg组分2，来自Calbiochem，分类号662096）孵育30分钟。时间零点为添加3.5μg哺乳动物26S蛋白酶体组分（Biomol International cat.no.PW8950）、20 mM琥珀酸盐、0.3μM FCCP或50μM PIC-1时，如图所示。线粒体在37°C下孵育，并在指定的时间点取出等分样品。在每个时间点取下40μg线粒体蛋白样品，造粒并重新悬浮在凝胶加载缓冲液中。

细胞分馏

用PIC-1处理INS-1E细胞2小时，然后根据制造商的说明使用Q蛋白质组细胞室试剂盒（Qiagen）进行分离。

化学制品

除非另有说明，否则所有化学品均来自Sigma或BDH。

英国医学研究委员会、剑桥大学临床医学院和国家卫生研究院的资助P01 AG025901;,PL1 AG032118; 和第30页AG025708非常感谢。存放在PMC中，6个月后发布。