Hsp90和共同伴侣扭曲了不同客户蛋白的功能

摘要

Hsp90结构与ATP酶循环

分子伴侣帮助新合成或错误折叠的蛋白质折叠，防止其聚集。高度保守的分子伴侣Hsp90（热休克蛋白，90kDA）是一种全球细胞调节因子，对多种细胞蛋白的折叠和调节至关重要，称为客户。Hsp90在依赖ATP的动态循环中与客户相互作用，以确保客户折叠、运输和/或组装成多蛋白复合物^1,2Hsp90在真核细胞中丰富，并且当细胞暴露于各种应激时其表达增加。Hsp90的两种亚型在酵母和哺乳动物细胞的胞浆中表达，其中一种表达对生存能力至关重要。高等真核生物还含有线粒体的相关蛋白Trap-1和内质网的Grp94。全基因组研究酿酒酵母表明高达10%的蛋白质直接或间接依赖于Hsp90的功能^三,4Didier Picard精心维护了Hsp90相互作用蛋白的最新列表(http://www.picard.ch/downloads/downloads.htm). 该列表包括依赖Hsp90折叠、稳定性和/或活性的客户，以及调节Hsp90和/或客户功能的共同伴侣。

Hsp90包含三个保守结构域：一个N末端ATP结合结构域、一个中间结构域和一个羧基末端结构域。所有检查的形式的Hsp90结合并水解ATP。最近的结构证据支持Hsp90构象变化的统一模型，该模型包含许多不同的步骤（参见^5——7). 简化模型如所示图1.在没有核苷酸的情况下(A类)，Hsp90在羧基末端二聚，形成开放构象。核苷酸结合(B类)诱导超束缚核苷酸的盖子闭合(C类)然后是N末端结构域的关联。在闭合构象中，氨基末端结构域的部分“交叉”与其他原聚体结合(D类). 然后，Hsp90二聚体形成紧密的扭曲结构(E类)这导致来自中间结构域的柔性环与核苷酸结合囊相关联。这种结构能够水解ATP。水解后，Hsp90返回开放构象。ATP水解速率和构象变化是可变的，不同物种的Trap-1、Grp94和HptG以及细胞溶质Hsp90之间存在差异。此外，一些形式的Hsp90即使在没有核苷酸的情况下也采用“封闭”构象⁸因此，与早期表明构象变化严格依赖于核苷酸的结果相反，最近的研究表明核苷酸改变了不同构象之间的平衡⁷.

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图1

Hsp90 ATP酶循环

在没有ATP的情况下(A类)，Hsp90在其C末端以“开放”构象二聚化。ATP绑定时(B类)N末端结构域随后发生构象变化，导致结合核苷酸上的“盖子”闭合(C类)以及氨基末端之间形成第二二聚化界面(D类，“闭合”构象）。闭合构象的连续重排允许N末端和中间结构域的相互作用，从而产生能够水解ATP的“闭合和扭曲”构象(E类). ATP水解后，盖子打开，N末端结构域相互释放，返回开放构象(A类). 辅子结合Hsp90并调节ATP酶循环。Hop/Sti1和Cdc37通过保持Hsp90的开放构象来抑制ATP酶活性。Aha1通过促进闭合构象的形成刺激ATP水解，而Sba1稳定闭合和扭曲构象。

胞质Hsp90与客户蛋白的组装依赖于共伴侣蛋白

从20世纪90年代初开始，鉴定出了一些额外的蛋白质或共同伴侣，它们与Hsp90在与类固醇受体或蛋白激酶的复合物中共同纯化(表1)^2,9,10虽然Hsp90经常被描述为“分子伴侣机器”，但没有证据表明Hsp90作为一个包含Hsp90和所有共伴侣的大型复合物而存在。相反，Hsp90和协同伴侣蛋白以有序的途径与客户蛋白相互作用，涉及客户蛋白与Hsp70和Hsp90的顺序ATP依赖性相互作用。在与类固醇激素受体相互作用的模型中，新合成或错误折叠的客户首先与Hsp40和Hsp70相互作用。含有四肽重复序列（TPR）的蛋白Hop/Sti1能够通过单独的TPR结构域同时结合Hsp70和Hsp90，从而促进客户蛋白从Hsp70转移到Hsp90。其他含TPR的共同伴侣取代Hop/Sti1促进核苷酸结合并形成ATP-结合的Hsp90闭合形式。P23相互作用进一步稳定了以二聚氨基末端为特征的闭合构象。ATP水解可能会被Aha1加速，导致客户分离^2,7相互作用的共同监护人的模式可能是特定于客户的^11,12例如，抑制N末端二聚化和ATP酶活性的Cdc37可能在蛋白激酶折叠期间替代Hop¹³类似地，Sgt1与p23同源，也与Hsp90的二聚氨基末端结合¹⁴，可能会取代客户端的p23功能，如Polo激酶^7,15.

大多数Hsp90共同伴侣是通过与从酵母或哺乳动物细胞提取物（Hop、PP5、p23、Sgt1、FKBP51/52、Cyp40和Cdc37）中分离出的Hsp90复合物共同纯化而首次鉴定的。通过与Hsp90的物理或遗传相互作用，确定了额外的共同伴侣酿酒酵母（Tah1、Aha1、Sse1和Cns1）。表1列出了作为Hsp90复合物一部分起作用的共同伴侣^{13,14,16——36}共伴侣结合随着Hsp90经历构象变化而变化。例如，p23优先绑定ATP绑定的关闭状态。含有TPR的共伴侣竞争结合Hsp90的保守羧基末端MEEVD序列，但一些含有TPR共伴侣的优先结合Hsp90+核苷酸³⁷.不调节Hsp70或Hsp90 ATP酶活性的辅酶基因可能具有特异性体内功能，如本地化或贩运。即使是密切相关的共同伴侣，如FKBP51和FKBP52，也可能对客户功能产生不同的影响，这表明他们可能会直接联系客户，或以特定于客户的方式影响Hsp90的功能¹²最近一项突变的囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR）的研究生动地证明了协同伴侣在客户折叠中的重要性和不同作用³⁸在缺乏Aha1（而非p23）的情况下，突变CFTR的稳定性特别增强，这表明协同伴侣在导致错误折叠的Hsp90客户降解的质量控制过程中起着关键作用。

假设所有形式的Hsp90在促进客户端折叠和激活方面具有类似的功能，以支持细胞的一般生物合成和稳态需求，并对各种应激条件作出响应。然而，调节Trap-1、Grp94或HtpG ATP酶活性的共伴侣尚未被确定。目前尚不清楚，细胞溶质Hsp90的共伴侣需求是否反映了Hsp90功能机制的差异，或是需要Hsp90发挥功能的蛋白质类型的差异。Hsp90分子伴侣机器的整体组成在不同的真核生物中似乎有所不同，编码共同伴侣的基因刺激或抑制Hsp90的基本ATP酶活性（Aha1）或（Hop/Sti1和Cdc37），但这些基因并不是绝对保守的³⁹因此，一些共伴侣的功能可能局限于客户蛋白的特定亚群，是以物种依赖的方式激活客户蛋白所必需的，或者与其他共伴侣冗余。

Hsp90与客户蛋白功能

Hsp90客户的主要类别包括转录因子，如类固醇激素的核受体、激酶（包括来自激酶所有分支的代表）以及第三类无关蛋白质，如端粒酶和病毒复制所需的蛋白质。与Hsp70等分子伴侣以延伸的未折叠构象结合多肽不同，Hsp90将客户蛋白保持在近乎完全折叠的构象中，以应对配体结合或磷酸化等激活信号。天然存在的小分子格尔德霉素及其衍生物结合Hsp90的ATP结合位点，并抑制Hsp90依赖ATP的伴侣活性。这些化合物破坏了以二聚氨基末端和p23相互作用为特征的“封闭”Hsp90复合物的形成。这改变了折叠途径，导致客户端活动减少，客户端与Hsp70的交互作用延长，客户端以泛素途径为目标进行降解。酵母中Hsp90的突变或广泛组织中的药物抑制会导致客户活动和/或稳定性的丧失。就类固醇激素受体而言，格尔德霉素阻止形成高亲和力激素结合状态，导致激素结合和转录激活降低以及受体降解。类似地，许多蛋白激酶的积累和活性，如v-src、ErbB2和Raf-1被破坏。折叠的Hsp90需求因客户而异：Hsp90持续需要维持类固醇激素受体活性，但仅在一些蛋白激酶合成过程中需要，例如p56（lck）^1,2,9,40类似地，Hsp90客户蛋白对Hsp90抑制剂有不同的敏感性⁴¹.

Hsp90客户端没有任何明显的序列或结构同源性，客户端绑定站点的位置仍不清楚。多年来，Hsp90的三个不同域中的每一个都与客户端绑定有关⁹客户端可能具有不同的结合位点和/或客户端结合位点随着Hsp90的构象变化而变化。最近的证据表明，客户将氨基末端和/或中间结构域结合在二聚体的“外部”^1,7特别是，Hsp90-Cdc37-Cdk4激酶复合物的单粒子电子显微镜结构⁴²结构显示Cdk4与N-末端和中间结构域的二价相互作用。虽然HtpG的一种构象最近被证明在抑制模型客户蛋白聚集方面具有高度活性，但在客户折叠中活跃的Hsp90的特定构象尚不清楚⁴³阐明Hsp90与不同客户的折叠相互作用和调节的机制仍是理解Hsp90功能的最大挑战之一。

HtpG、Trap-1和GRP94的功能

对其他形式的Hsp90的功能了解多少？与真核生物中细胞溶质Hsp90的重要作用相反，HtpG的缺失仅在非常高的温度下影响细菌的生长。然而，有一些证据表明HtpG促进应激状态下的蛋白质折叠大肠杆菌 ⁴⁴最近的一项研究表明，HtpG在调节尿卟啉原脱羧酶（四吡咯生物合成所需的酶）方面具有特殊作用⁴⁵，但还需要进一步的工作来澄清这种相互作用。线粒体陷阱-1在调节线粒体完整性中发挥关键作用，靶向线粒体的Hsp90抑制剂导致选择性肿瘤细胞死亡⁴⁶Grp94是内质网的丰富成分，Grp94的ATP酶活性对小鼠的发育至关重要⁴⁷Grp94有助于保护细胞免受各种应激，并通过ER相关降解途径在错误折叠蛋白质的降解中发挥作用⁴⁸已知需要Grp94发挥功能的一些特定蛋白质是胰岛素样生长因子-II、免疫球蛋白和一些toll样受体。

Hsp90的缓冲能力

研究黑腹果蝇和拟南芥证明Hsp90能够缓冲表型异常。通过突变或药物抑制Hsp90，Hsp90活性降低，导致各种表型异常的积累。这些异常被认为是由形态发生信号通路中功能蛋白的变异引起的。Hsp90可能结合并稳定含有改变的蛋白质，否则会导致功能降低或改变。与Hsp90在蛋白质折叠中的作用一致，在较高和较低温度下观察到的异常表型增强。这些令人兴奋的结果表明，Hsp90可能通过允许关键信号通路多态性变体的积累而在进化中发挥作用。由于生物体在自然选择过程中受到压力，这些隐藏的遗传变异可能在提高种群中不同基因型的存活率方面发挥关键作用^49,50.

这些实验的有趣之处之一是，这些依赖于Hsp90的表型变异是可遗传的。这种表型传递的机制是遗传的、表观的还是两者兼而有之，仍在争论之中^50——53在表观遗传模型中，DNA甲基化和染色质修饰会导致基因沉默或激活，而基因在遗传过程中不会发生任何改变。为了支持这一模型，Hsp90和协同伴侣与含有Ino80和/或SWR-C的染色质重塑复合物中的多个蛋白质发生物理或遗传相互作用^三.Hsp90还可能直接或间接影响CARM1（辅激活物相关精氨酸甲基转移酶1）和SMYD3（人类组蛋白甲基转移酶）的活性，导致DNA甲基化模式改变⁵¹.

Hsp90在癌症中的作用

Hsp90负责一些致癌激酶的伴随和维持，如Raf-1、Bcr-Abl和ErbB2。由于它影响对肿瘤进展的多个步骤至关重要的客户的活动，如永生化（端粒酶）、凋亡受损（AKT）、血管生成（HIF-1α）和侵袭/转移（基质金属蛋白酶2，MMP2），因此它是癌症治疗的重要靶点^1,40Hsp90在肿瘤细胞中上调了10倍，表明它有助于维持肿瘤细胞的生长和/或生存。Hsp90蛋白也可能在肿瘤细胞中发生改变，据报道，共伴侣相互作用和翻译后修饰发生改变，导致激活状态，促进恶性进展^54,55.Hsp90的缓冲能力可能有助于其参与维持肿瘤，因为它可能使肿瘤细胞耐受可能对细胞致命的基因改变⁴⁰Hsp90在维持肿瘤细胞中的另一个作用是其抑制凋亡的能力。线粒体Trap-1和细胞溶质Hsp90定位于肿瘤细胞线粒体，在调节线粒体完整性方面起着关键作用。作为这一关键功能的证据，靶向线粒体的Hsp90抑制剂可导致选择性肿瘤细胞死亡⁴⁶.

在临床试验中，一些小分子抑制剂被用于治疗多种肿瘤类型，这些小分子抑制剂会破坏客户的稳定并诱导细胞凋亡。这些化合物中研究得最好的是格尔德霉素的衍生物，即17-烯丙基氨基-17-脱甲氧基格尔德霉霉素（17-AAG），现在称为坦内霉素¹Hsp90抑制剂在临床试验中的一些最有希望的结果是作为乳腺癌、肺癌和一些白血病的联合治疗的一部分^56,57.

Hsp90在发病机制中的作用

最近的研究表明，Hsp90抑制剂除了有治疗多种癌症的前景外，还可以与抗真菌药物结合，治疗致病真菌感染，如白色念珠菌或乌米盖特曲霉 ⁵⁸临床应用最广泛的一类抗真菌药物是氮唑类药物，其靶向麦角固醇（真菌膜的一种成分）。在Hsp90存在下，真菌能够通过改变各种信号通路（例如上调麦角甾醇生物合成通路）来适应抗真菌药物。Hsp90抑制剂破坏了适应药物所需的信号通路，从而防止了耐药性⁵⁹.

许多病毒的复制也需要Hsp90，如乙型和丙型肝炎病毒、鸡舍病毒、巨细胞病毒、甲型流感病毒和其他病毒（参见¹). 小RNA病毒衣壳蛋白的折叠和成熟也依赖于Hsp90。抑制Hsp90会损害衣壳的产生和病毒复制，而不允许产生耐药病毒⁶⁰这些结果强调了Hsp90在使细胞适应各种应激中的关键作用，并表明Hsp90抑制剂可与其他抗病毒药物联合用于治疗大量传染病。

未来发展方向

Hsp90和协同伴侣调节大量客户在各种生物过程中的活动，包括生殖、免疫反应、细胞生长和分化。最近的研究表明，Hsp90和协同伴侣在植物发育和抗病虫害中起着关键作用^1,59,61尽管取得了这些进展，但值得注意的是，人们对Hsp90如何实际介导客户蛋白折叠知之甚少。客户结合位点在Hsp90中的位置尚不清楚，不同的客户蛋白是否与Hsp90有不同的相互作用也不清楚。此外，尽管最近在理解Hsp90结合和水解ATP时发生的动态构象变化方面取得了进展，但能够促进客户端折叠的Hsp90构象尚不清楚。

关于Hsp90的另一个问题是，它如何在没有协同伴侣的情况下（如HtpG、Trap-1和Grp94），或与一组似乎以物种特异性方式变化的协同伴侣一起，促进客户蛋白折叠³⁹由于已知一些共伴侣直接调节Hsp90（Hop、Aha1和Cdc37）的ATP酶活性，因此对共伴侣的部分需求可能是由于不同形式的Hsp90的固有ATP酶活性不同⁵目前尚不清楚ATP酶循环的改变如何影响特定客户的折叠。信号分子的快速折叠可能需要快速的ATP酶循环，而其他具有更复杂折叠路径的客户可能需要较慢的ATP酶周期，以便与Hsp90有效地相互作用。随着人们对共同伴侣相互作用的特殊性了解的越来越多，可能会区分特定客户是否必须接触不同物种中的相同共同伴侣。或者，考虑到Hsp90在缓冲蛋白质变化影响中的作用，在哺乳动物细胞中需要一组共伴侣的客户可能依赖于另一物种中不同的共伴侣，甚至在另一物种的功能中完全独立于Hsp90。

越来越多的Hsp90小分子抑制剂的可用性将继续促进我们对Hsp90如何与客户蛋白相互作用的理解的快速发展。特别有希望的是，临床研究表明，一系列肿瘤细胞对热休克蛋白90抑制剂（如丹皮霉素）有良好的反应，尤其是与其他药物联合使用时。未来的临床研究有望在靶向Hsp90治疗真菌和病毒感染方面显示出类似的前景。

致谢

引用的文献