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分子生物学细胞。2009年11月15日；20(22): 4845–4855.
数字对象标识：10.1091/桶。E09-01-0002号
预防性维修识别码：PMC2777113型
PMID：19759180

葡萄糖促进真菌病原菌的抗应激能力白色念珠菌

亚历山德拉·罗德基,* 艾丽娜·博霍维奇（Iryna M.Bohovych）,* 布里斯·恩贾伯特,*† 蒂姆-杨,‡ 弗兰克·C·奥兹,* 尼尔·A.R.高,*和阿利斯泰尔J.P.布朗通讯作者*
查尔斯·布恩，监控编辑器
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关联数据

补充资料

摘要

代谢适应，尤其是疾病进展过程中碳同化途径的调节，被认为有助于白色念珠菌因此，我们研究了葡萄糖对白色念珠菌转录组，测试该病原体对广泛葡萄糖水平（0.01、0.1和1.0%）的敏感性。我们展示了这一点，比如酿酒酵母,白色念珠菌对葡萄糖极为敏感，即使对0.01%的葡萄糖也能调节中枢代谢基因。这表明血液中的葡萄糖浓度（约0.05–0.1%）对白色念珠菌基因调控。然而，与酿酒酵母在葡萄糖下调应激反应的地方，一些应激基因是由葡萄糖诱导的白色念珠菌这反映在对氧化和阳离子应激的抗性增强以及对唑类抗真菌剂的抗性增强。Cap1和Hog1可能介导葡萄糖增强的抗氧化应激能力，但两者都不是这种作用的关键。然而，Hog1在葡萄糖作用下被磷酸化，对于葡萄糖增强对阳离子胁迫的抵抗力至关重要。数据表明，一旦进入血液，白色念珠菌细胞对葡萄糖的反应增加了它们对氧化和阳离子应激的抵抗力，这些应激是免疫保护吞噬细胞的核心。

简介

有效应对环境变化对微生物的生存至关重要。环境适应与病原微生物特别相关，病原微生物必须对抗宿主的防御系统，并调节其代谢和压力稳态机制，使其适应宿主中遇到的复杂微环境。

白色念珠菌是人类的主要真菌病原体(奥兹，1988;卡尔德隆，2002). 它作为共生生物存在于泌尿生殖道、胃肠道和皮肤上。在其他健康人群中，它会导致口腔念珠菌病和阴道炎等粘膜感染。此外，它还可能导致严重免疫缺陷患者的血流和内脏器官发生致命感染。因此，白色念珠菌可以在人类宿主的多样性和复杂的生态位中茁壮成长。

这种酵母对其微环境作出有效反应的能力必须有助于其作为病原体的成功。两个主要观察结果强化了这一观点。首先，某些代谢或应激基因的破坏会减弱白色念珠菌例如，使乙醛酸循环失活、糖异生、糖酵解或脂肪酸β-氧化的突变会降低毒力，尽管在某些情况下会略有降低(Lorenz和Fink，2001年;巴雷勒等。, 2006;皮耶卡斯卡等。, 2006;拉米雷斯和洛伦兹，2007年;Zhou和Lorenz，2008年). 因此，即使在经典的播散性念珠菌病小鼠模型中，这种酵母也需要代谢灵活性，尤其是在其碳同化途径中，才能显示正常的毒性水平。同样，过氧化氢酶、超氧化物歧化酶或Hog1应激激活蛋白激酶（SAPK）的失活会减弱白色念珠菌(怀松等。, 1998;阿隆索·蒙格等。, 1999;黄星京等。, 2002;马尔琴科等。, 2004;弗拉丁等。, 2005). 因此，应激信号和应激保护功能也有助于白色念珠菌.

第二个主要观察结果揭示了白色念珠菌产生于基因调控的研究。基因组表达谱分析表明白色念珠菌调节其代谢并在宿主接触时激活特定的应激反应。例如，糖酵解基因下调，乙醛循环和脂肪酸β-氧化基因上调白色念珠菌细胞接触血液、巨噬细胞或粒细胞(弗拉丁等。, 2003,2005;鲁宾·贝杰拉诺等。, 2003;洛伦兹等。, 2004). 此外，粒细胞吞噬后氧化应激功能上调(弗拉丁等。, 2005). 使用更复杂的体内外感染模型进行了类似的观察(Thewes公司等。, 2007;扎克哈尼等。, 2007). 新陈代谢和应激适应白色念珠菌在感染过程中，通过使用诊断性绿色荧光蛋白（GFP）融合分析单个酵母细胞的分子行为已经得到证实(巴雷勒等。, 2006;昂雅尔贝等。, 2007). 然而，这种单细胞方法揭示了白色念珠菌感染肾脏的群体在其分子行为方面是高度异质的。例如，只有一小部分白色念珠菌感染肾组织的细胞激活氧化应激反应(昂雅尔贝等。, 2007). 还有，一些白色念珠菌感染肾脏的细胞似乎通过糖酵解吸收碳，而其他细胞似乎利用碳代谢的合成代谢途径(巴雷勒等。, 2006).

必须定义白色念珠菌如果要了解这种病原体在体内复杂微环境中的异质行为，就需要特定的环境刺激。我们推断，个体的差异暴露白色念珠菌细胞转化为葡萄糖可能有助于其体内的异质代谢行为。因此，在本研究中，我们检查了白色念珠菌通过全基因组表达谱分析葡萄糖。我们比较了这种病原体和相对良性的酵母的反应酿酒酵母因为在这个物种中葡萄糖反应是很典型的。

葡萄糖对人体的新陈代谢和生理学有深远的影响酿酒酵母特别是，替代碳源同化的代谢途径受到葡萄糖的抑制。此外，发酵代谢上调，呼吸代谢下调。在暴露于葡萄糖的细胞中，核糖体生物生成和其他生长相关功能上调，而应激反应下调。酿酒酵母进化出复杂且部分冗余的信号机制来调节其葡萄糖反应（有关综述，请参阅甘塞多，1998年,2008;卡尔森，1999年;约翰斯顿，1999;Thevelein和de Winde，1999年;罗兰等。, 2001). 这些包括Ras-cAMP蛋白激酶A、Snf3-Rgt2和Snf1-Glc7-Reg1信号通路(甘塞多，2008). 特别是Ras-cAMP蛋白激酶A通路在核糖体生物发生的激活以及应激反应的下调中起着关键作用(Gounalaki和Thieos，1994年;戈尔纳等。, 1998;斯坦希尔等。, 1999;加罗等。, 2000).

这个酿酒酵母细胞对低浓度葡萄糖非常敏感，糖酵解上调，碳同化替代途径下调，而葡萄糖浓度低至0.01%(阴等。, 1996,2003). 这种精细的葡萄糖敏感性可能是因为这种酵母已经适应了从饥荒到野外盛宴的突然转变而进化而来的(约翰斯顿，1999). 相反，真菌病原体白色念珠菌被认为是由热血动物进化而来(奥兹，1988). 在人类宿主中，血糖浓度保持在稳态范围内（0.05-0.1%葡萄糖，相当于~3-5mM葡萄糖），远低于实验酵母培养物中常用的浓度（1-2%葡萄糖）。此外，与酿酒酵母(波斯特马等。, 1989),白色念珠菌根据其在高糖浓度下生长期间保持呼吸活性，已被归类为克拉布菌阴性酵母(青木和伊藤库娃，1982年;尼米等。1988年). 因此，我们推断，在这些致病性和良性酵母菌中，葡萄糖反应可能存在显著差异。在本文中，我们展示了白色念珠菌和酿酒酵母关于葡萄糖对其转录组的影响，但在葡萄糖对这些酵母菌应激反应的影响方面存在根本性差异。

材料和方法

菌株和生长条件

本研究中使用的菌株表1菌株在30°C的YPD或YPLactate（2%Bacto-peptone和1%酵母提取物，其中含有2%）中生长天-葡萄糖或2%乳酸）。

表1。

本研究中使用的菌株

应变基因型来源
SC5314号合同血液临床分离物：Clade 1MacCallum公司等。(2009)
AM2003-016年口咽临床分离物：Clade 1MacCallum公司等。(2009)
AM2003/0182血液临床分离物：Clade 2MacCallum公司等。(2009)
AM2004/0028型口咽临床分离物：Clade 2MacCallum公司等。(2009)
b30708/5号血液临床分离物：Clade 3MacCallum公司等。(2009)
T101型口咽临床分离物：分支3MacCallum公司等。(2009)
2012年2月73日血液临床分离物：Clade 4MacCallum公司等。(2009)
AM2003-020型口咽临床分离物：Clade 4MacCallum公司等。(2009)
CAI4公司尿酸3：：λimm434/ura3：：λ国际货币434Fonzi和Irwin（1993）
1000令吉ura3：λimm434/ura3：：λimm434，his1:：hisG/his1:：hisG威尔逊等。(1999)
主题1Ade2:：hisG/Ade2:：hisG，ura3:：λimm434/ura3：：λimm434，ENO1/ENO1:：ENO1-tetR-ScHAP4AD-3XHA-ADE2Nakayama公司等。(2000)
Δ猪1尿酸3：：λimm434/ura3：：λimm434，his1:：hisG/his1:：hisG，hog1:：loxP-URA3-loxP，hog1：：loxP-his1-loxP史密斯等。(2004)
Δ帽1尿酸3：：λimm434/ura3：：λimm434，his1:：hisG/his1:：hisG，arg4:：his G/arg4:：hisG，cap1:：His G/cap1:：hsG-URA3-hisG昂雅尔贝等。(2006)
Δ帽1Δ猪1尿酸3：：λimm434/ura3：：λimm434，his1:：hisG/his1:：hisG，arg4:：his G/arg4:：hisG，hog1:：loxP-arg4-ura3-loxP/hog1::loxP-his1-loxP，cap1:：hsG/his1：：hisG-ura3-hisG昂雅尔贝等。(2006)
ras1-2/ras1-3尿酸3：：λimm434/ura3：：λimm434，ras1Δ：：hisG/ras1Δ：hph-URA3-hph冯等。(1999)
WH324号机组尿酸3：：λimm434/ura3：：λimm434，aox1a:：：hisG/aox1b:：：hisGHuh和Kang（2001）
C20个尿酸3：：λimm434/ura3：：λimm434，tps1Δ：：hisG/tps1Δ：：hisG萨拉戈萨等。(1998)

成绩单档案

使用白色念珠菌应变THE1(表1)通过使用描述的过程酿酒酵母通过阴等。(2003).白色念珠菌细胞生长至中对数期（OD600=0.5）在30°C的YP乳酸中过夜，OD时重新接种到200 ml新鲜YP乳酸600=0.05，并在30°C下重新打磨至中对数阶段（OD600=0.5）。将培养物分为四个50 ml培养物，并添加葡萄糖，使其最终浓度为0%、0.01%（=0.56 mM）、0.1%（=5.6 mM）或1%（=56mM）。30分钟后收获细胞并在液氮中快速冷冻2如前所述制备RNA(豪泽等。, 1998)，并制备菁（Cy）3和Cy5标记的cDNA探针，并与白色念珠菌如前所述的微阵列（Eurogentec、Seraing、比利时）(昂雅尔贝等。, 2006). 使用ScanArray Lite扫描仪（PerkinElmer Life and Analytical Sciences，Beaconsfield，United Kingdom）扫描幻灯片，并使用QuantArray软件2.0版进行量化。使用GeneSpring（Silicon Genetics，Redwood City，CA）进行数据分析和归一化，并使用微阵列显著性分析（SAM）进行统计分析(塔瑟等。, 2001)错误发现率<10%。计算相对于暴露于0%葡萄糖的对照细胞的表达率。使用至少三个独立的生物复制品的数据进行分析。

白色念珠菌基因注释来自CandidaDB(http://genolistpastur.fr/CandidaDB;德恩费尔特等。, 2005)和念珠菌基因组数据库(http://candidagenome.org;布劳恩等。，2005年). 的功能类别白色念珠菌使用位于酿酒酵母基因组数据库（SGD；网址：www.yeastgenome.org/GOcontents.shtml). 完整的数据集在补充数据和ArrayExpress中提供(www.ebi.ac.uk/microarray公司/; 实验加入电子邮箱-1151).

Northern分析

进行Northern印迹以验证转录谱分析数据。RNA是从白色念珠菌THE1细胞，在1.5%琼脂糖/甲醛凝胶上分离，并按照前面所述进行Northern印迹(棕色等。, 2001). 基因特异性探针是聚合酶链反应（PCR）-从基因组DNA（引物在补充数据中指定）扩增而来，并使用现成的dCTP标记试剂盒（英国白金汉郡Chalfont St.Giles GE Healthcare）进行放射标记。信号通过与TEF3型mRNA水平，如前所述(棕色等。, 2001).

西方印迹法

蛋白质提取物制备自白色念珠菌OD检查的细胞6000.4，并进行蛋白质印迹，如前所述(史密斯等。, 2004). 使用磷酸特异性磷酸化p38有丝分裂原活化蛋白（MAP）激酶（Thr180/Tyr182）抗体（英国赫特福德郡希钦新英格兰生物实验室）检测Hog1激活，然后使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔免疫球蛋白（Ig）G二级抗体（德克萨斯州蒙哥马利Bethyl实验室）检测使用ECL Plus Western印迹试剂（GE Healthcare）。然后剥离膜并用抗Hog1（y-215）抗体（sc-9079，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）进行复制，然后用HRP-连接的抗兔IgG抗体（目录号7074；新英格兰生物实验室）进行装载控制。

应激表型

对于所有压力分析，白色念珠菌菌株首先在30°C的YPLactate中培养过夜至中对数期（OD600= 0.5). 然后将细胞继代培养成新鲜的YPLactate并再生到中对数期（OD600= 0.5). 对于氧化应激，培养物随后被分割：一半接受1%葡萄糖，而对照细胞接受0%葡萄糖。细胞再生长60分钟，然后暴露于0、0.4、5、10、25或50 mM H2O（运行）2对与非应激对照组相比的细胞活力进行检测（克隆形成单位[CFU]）。数据表示三个独立实验的平均值。

对于渗透胁迫，YP乳酸培养物被分离，一些细胞暴露于1%的葡萄糖，而对照细胞暴露于0%的葡萄糖。细胞再生长60分钟，然后暴露于0.5或1 M NaCl、0.6 M KCl或0.6或1.2 M山梨醇中60分钟。然后检测细胞活力（CFU）。数据是来自三个独立实验的平均值。

咪康唑治疗方法改编自Abbott和Odds（1989）.中长白色念珠菌用YP乳酸培养的细胞通过离心收集，在蒸馏H中洗涤两次2O（d高度2O） ，并以dH重新悬浮2O.四毫升悬浮液（～8×106细胞/ml）添加到4 ml pH 6.2的0.2 M柠檬酸盐缓冲液中。用10μg/ml咪康唑（最终浓度；英国多塞特郡普尔Sigma Chemical.Poole）或载体二甲基亚砜（DMSO）处理细胞10分钟。然后，将乳酸或葡萄糖添加到1%的最终浓度，或将对照细胞添加到0%的最终浓度中，并将细胞在30°C下再培养10分钟，然后确定活细胞数为CFU。数据表示三个独立实验的平均值。

海藻糖和活性氧（ROS）

使用已发表的程序对细胞内ROS水平进行量化(查托帕迪耶等。, 2006;现金等。, 2007)，进行了修改。如上所述，细胞在YPLactate上生长到中指数期，以进行转录谱分析。然后将葡萄糖添加到1%的最终浓度，并向对照培养物中添加等量的水。然后将50微升二甲基亚砜（2 mg/ml）中的二氯二氢荧光素二乙酸酯（目录号D6883；Sigma Chemical）添加到50毫升培养物中，在30°C下再培养15分钟。然后收集细胞，用冷水冲洗两次，并用玻璃珠在0.1 M Tris-HCl（pH 7.5）中剪切。细胞提取物在13000×克，上清液在水中稀释10倍，并在485和520nm处测量荧光。荧光测量值归一化为Bradford分析法测得的蛋白质浓度(布拉德福德，1976年).

细胞内海藻糖水平的测定方法如下：内维斯等。(1994)如上所述，细胞在YPLactate上生长至中指数期。然后将细胞暴露于1%葡萄糖中1小时，收获并用冰水清洗。通过在1 ml 0.25 M Na中煮沸1 h，从50 mg细胞中提取海藻糖2一氧化碳三然后，用100μl 0.5 M柠檬酸中和200μl提取物，并用0.1 U海藻糖酶（目录号T8778；Sigma Chemical）在总体积为200μl的1 mM EDTA中培养150μl该中和提取物2 h。然后使用商业试剂盒（目录号GAHK20；Sigma Chemical）对海藻糖水解释放的葡萄糖进行分析。

结果

白色念珠菌对葡萄糖极为敏感

之前，我们检查了酿酒酵母低（0.01%）、中（0.1%）和高（1%）葡萄糖水平(阴等。, 2003). 这些全基因组分析表明酿酒酵母对葡萄糖极为敏感，即使在低葡萄糖浓度下也能调节代谢基因的表达。糖酵解基因上调，糖异生和三羧酸（TCA）循环基因下调，即使只向生长培养基中添加0.01%的葡萄糖。相反，核糖体的生物生成只在中或高水平葡萄糖的作用下才被激活。

我们当前研究的第一个目标是测试以下工作假设：白色念珠菌和酿酒酵母对葡萄糖的反应不同。因此，为了检测白色念珠菌我们使用了一种类似于我们之前研究的实验方法酿酒酵母简而言之，RNA是从白色念珠菌细胞在添加0、0.01、0.1或1%葡萄糖到乳酸上呈指数增长的培养物后30分钟。我们选择这个时间点来复制我们在全基因组葡萄糖反应分析中成功使用的条件酿酒酵母(阴等。, 2003). 这个白色念珠菌RNA接受微阵列分析，测量零、低、中、高糖浓度相对于零葡萄糖对照组的影响。如果在三个独立的复制实验中显示出统计显著且可重复的变化≥1.5倍，并且通过了SAM施加的统计过滤，错误发现率<10%，则对转录本进行进一步分析(塔瑟等。, 2001). 总计347白色念珠菌基因上调，344个基因下调，以响应至少一种检测的葡萄糖浓度（基因组的～5%）（补充数据）。在这些基因中，有170个基因被上调，180个基因被0.01%的葡萄糖下调，这表明大约一半的葡萄糖调节基因对低血糖有反应。这些转录谱分析数据通过对选定的白色念珠菌抄本。例如，这证实了HXT62型（假定己糖转运蛋白）和QDR1号机组（多药耐药性所需的质膜转运体同源物酿酒酵母)对0.01、0.1和1%葡萄糖的反应增加，而对照组IPF3584型转录物（功能未知）对葡萄糖无反应PCK1型转录物（糖异生）被所有三种葡萄糖浓度抑制（数据未显示）。因此，就像酿酒酵母，的白色念珠菌转录组对葡萄糖极为敏感，对低至0.01%的浓度有反应。

白色念珠菌和酿酒酵母对葡萄糖的转录组反应存在显著差异

比较白色念珠菌和酿酒酵母更直接的是，我们选择了两种酵母中都有同源基因的基因（补充数据；昂雅尔贝等。, 2006). 然后，我们检查了参与中枢碳代谢的同源基因的行为，列出了各个基因对每种情况的反应（补充数据），然后计算了特定途径对每种葡萄糖浓度的平均反应(图1A） ●●●●。特定代谢途径的行为见图1B.英寸白色念珠菌低、中、高浓度葡萄糖暴露后，糖酵解基因上调，糖异生、乙醛酸循环、TCA循环和脂肪酸β-氧化基因下调。因此，中枢代谢途径的表达白色念珠菌即使在低血糖（0.01%）时也会受到调节。

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葡萄糖对中枢碳代谢相关基因表达的影响白色念珠菌和酿酒酵母细胞在YPLactate中生长至中指数期，暴露于无（0%）、低（0.01%）、中（0.1%）或高（1%）葡萄糖中30分钟，然后进行转录谱分析。对于白色念珠菌相对于0%的葡萄糖对照，对这四种条件下THE1细胞的-倍表达进行了测量。的数据酿酒酵母被取自阴等。(2003)世卫组织将这些数据标准化为0%的血糖水平。颜色编码从每个完整数据集中观察到的最大倍数增加（紫色）到无变化（黄色）再到最大倍数减少（青色）（补充数据中的颜色热标度）进行缩放。（A） 糖酵解转录物的调节。（B） 编码糖酵解、TCA循环、糖异生和乙醛酸循环、脂肪酸β-氧化和核糖体蛋白的转录物的平均反应：闭平方，白色念珠菌; 开放广场，酿酒酵母.

虽然碳代谢基因在白色念珠菌和酿酒酵母，核糖体蛋白基因在这些物种中的反应不同。在酿酒酵母，添加葡萄糖后核糖体蛋白基因表达上调(Mager和Planta，1991年)的转录谱分析研究证实了这一点阴等。(2003)然而，在白色念珠菌在同等条件下(图1B） ●●●●。几乎可以肯定的是，这些物种在YPLactate上生长的差异解释了这种截然不同的行为。酿酒酵母在YPLactate上生长相对缓慢，在添加浓度为1%的葡萄糖后，加倍时间减半。正如所料，核糖体蛋白基因的表达随着酵母的生长而加速(阴等。, 2003). 相反，白色念珠菌THE1细胞在含有乳酸或葡萄糖（T天=～110分钟）。因此，在这些条件下，该病原体的核糖体蛋白基因表达没有增加(图1B） ●●●●。这些差异可能在白色念珠菌和酿酒酵母对YPLactate的影响可能解释了我们在它们对葡萄糖的转录反应中观察到的一些其他差异。

然后我们检查了白色念珠菌和酿酒酵母通过根据基因本体对葡萄糖调节基因进行更广泛的分类(酿酒酵母基因组数据库；http://db.yeastgenome.org/cgi-bin/SGD/GO/goTermFinder网站)并询问哪些功能类别被葡萄糖显著上调或下调(图2). 糖酵解、发酵和己糖转运的功能类别在白色念珠菌和酿酒酵母此外，两个物种的糖异生、三羧酸循环、有氧代谢和脂肪酸代谢均下调。相反，功能类别核糖体的生物生成和蛋白质合成在白色念珠菌和酿酒酵母在病原体中无明显调节或下调，但在良性酵母中上调(图2). 毫不奇怪，这些功能类别的行为反映了这些类别中单个基因的行为(图1).

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葡萄糖对小鼠各种功能类别的调节作用白色念珠菌和酿酒酵母。根据来自酿酒酵母和念珠菌基因组数据库。的脚本分析数据酿酒酵母被取自阴等。(2003)（A）在上调（红色）或下调（绿色）基因中表现出统计显著富集的功能类别如下：浅橙色或绿色，p值<10−2; 中橙色或绿色，p值<10−3; 和深红色或绿色，p值<10−4.

对功能类别的分析揭示了白色念珠菌和酿酒酵母(图2). 作为对葡萄糖的反应，能量储备代谢在白色念珠菌在所有三种葡萄糖浓度下酿酒酵母对该功能类别的进一步分析表明，海藻糖代谢基因在白色念珠菌（例如。，测试程序集1,测试程序集2、和测试程序集3)，与中不同酿酒酵母(图3). 海藻糖是一种众所周知的压力保护剂(威姆肯，1990年). 因此，该观察结果与氧化应激反应和药物反应的上调一致白色念珠菌但不是在酿酒酵母(图2). 为了更详细地了解这一点，我们检查了这些功能类别中单个基因的行为。

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葡萄糖对mRNA编码的影响YAP1公司,第1章或海藻糖合成酶。闭合正方形，第1章mRNA；开放广场，YAP1公司mRNA；三角形，平均响应测试程序集1-3抄本；闭合符号，白色念珠菌; 开放符号，酿酒酵母.

关于药物反应，三白色念珠菌属于ATP结合盒转运蛋白超家族的基因（例如。，CDR1系统,CDR2系统、和序号Q2)也是主要辅导员家族的一员(QDR1号机组)在所有测试的葡萄糖浓度下均上调。所有这些基因都与抗真菌药物或诱变剂的反应有关(泽福斯等。, 1993;德科蒂尼等。, 1995;桑格拉德等。, 1995,1997;努涅斯等。, 2001).节气门执行器控制1，转录激活物CDR1系统和CDR2系统在里面白色念珠菌(成本等。, 2004)，对葡萄糖的反应没有显著上调。除了5菲律宾第纳尔（该酿酒酵母同系物CDR1系统)，在0.1%和1%葡萄糖的作用下，相应的酿酒酵母基因对葡萄糖的反应没有改变(阴等。, 2003).

三个白色念珠菌葡萄糖诱导了对氧化应激反应重要的基因。TRX1型和TTR1型编码参与氧化应激保护的硫氧还蛋白和谷胱甘肽。上调第1章通过葡萄糖(图3)特别值得注意的是，该基因编码一种抗氧化应激和多药耐药性所需的转录激活物(Alarco和Raymond，1999年).YAP1公司（该酿酒酵母同系物白色念珠菌CAP1)被葡萄糖双重下调(图3). 这些关键转录因子的对比行为为葡萄糖上调氧化应激功能提供了机制解释白色念珠菌但不在酿酒酵母.

我们的GO输出中并没有表现出对渗透胁迫的反应，因为葡萄糖对这一功能类别的基因调节不足。这部分是因为该功能类别包含相对较大比例的信号传递功能，这些功能是在转录后而非转录水平上调节的。因此，在进一步的研究中，我们认识到对渗透胁迫反应至关重要的基因白色念珠菌被葡萄糖上调。这些包括ENA22号机组编码钠离子转运蛋白GPD1项目和通用程序设计2，编码合成渗透压甘油所需的甘油-3-磷酸脱氢酶同工酶，甘油（补充数据）。

上述观察提供了第一条线索：白色念珠菌可能与酿酒酵母关于葡萄糖对应激反应的影响。应激反应被葡萄糖下调酿酒酵母(戈尔纳等。, 1998;加罗等。, 2000). 相反，我们的转录本分析数据表明白色念珠菌葡萄糖可能会上调某些应激反应。我们通过检测葡萄糖对白色念珠菌承受各种应力。

葡萄糖增加白色念珠菌对氮唑类抗真菌药物的耐药性

我们的微阵列实验显示，在暴露于葡萄糖的细胞中，与抗真菌药物耐药性有关的关键转录物水平迅速增加。因此，我们想测试葡萄糖是否会导致白色念珠菌唑类抗真菌药物。我们选择咪康唑是因为，与大多数唑类抗真菌药物不同，该药物对白色念珠菌(雅培和奥兹出版社，1989年). 这使我们能够测试暴露于葡萄糖是否保护白色念珠菌来自咪康唑诱导的杀戮。细胞在与转录谱实验（YPLactate指数期）等效的条件下生长，用葡萄糖处理1小时，然后暴露于10μg/ml咪康唑1小时，并测定细胞活力(图4). 与用水或新鲜乳酸处理的对照细胞相比，暴露于葡萄糖的细胞对咪康唑诱导的杀伤表现出高度显著的保护作用。因此，除了诱导与耐药性有关的基因表达外，葡萄糖还会增加白色念珠菌咪康唑。

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接触葡萄糖会增加白色念珠菌一种唑类抗真菌药物。白色念珠菌THE1细胞在YPLactate中生长至中指数期，暴露于1%葡萄糖或乳酸中1h，然后暴露于10μg/ml咪康唑，并测定其细胞活力。一式三份实验的平均值和SD显示为：*p<0.05和**p<0.01（学生的t吨测试）。

葡萄糖增强白色念珠菌的抗渗透应激能力

我们的微阵列分析表明，一些渗透胁迫基因是由葡萄糖诱导的白色念珠菌因此，为了测试葡萄糖是否影响渗透应激耐受性，白色念珠菌在乳酸上生长，暴露于葡萄糖中，然后用不同浓度的山梨醇、氯化钠或氯化钾处理。将这些细胞的活性与未接触葡萄糖的对照细胞进行比较(图5). 葡萄糖不影响白色念珠菌山梨醇。然而，葡萄糖暴露后，对氯化钠和氯化钾的抵抗力增加。因此，葡萄糖似乎影响这种致病酵母的阳离子胁迫抗性，而不是渗透胁迫抗性。

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葡萄糖增加了白色念珠菌阳离子胁迫。白色念珠菌THE1细胞在YPLactate中生长至中指数期，暴露于1%葡萄糖或乳酸中1 h，然后经受NaCl、KCl或山梨醇应激，并测定其细胞活力。三次重复实验的平均值和标准偏差如下所示：*p<0.05和**p<0.01（学生的t吨测试）。

这一观察结果与我们在微阵列实验中发现的一小组渗透胁迫基因由葡萄糖诱导的结果一致。这套包括ENA22号机组，与酿酒酵母ENA2编码有助于耐盐性的钠转运蛋白的基因(罗德里格斯-纳瓦罗等。1994年).

葡萄糖增加白色念珠菌对氧化应激的抵抗力

然后我们测试了葡萄糖对氧化应激基因表达的影响是否会影响白色念珠菌对这种环境侮辱。再一次，白色念珠菌细胞在YPLactate中生长到指数期，与葡萄糖接触一小时，然后用不同剂量的过氧化氢处理细胞一小时。将这些细胞的活性与未接触葡萄糖的等效细胞进行比较(图6). 葡萄糖显著增加了白色念珠菌高剂量氧化应激（>10 mM过氧化氢）。

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葡萄糖增加了白色念珠菌急性剂量的过氧化氢。白色念珠菌THE1细胞在YPLactate中生长至中指数期，暴露于1%葡萄糖或乳酸中1h，然后暴露于不同浓度的h2O（运行）2并测定其细胞活力。三次重复实验的平均值和标准偏差如下所示：*p<0.05和**p<0.01（学生的t吨测试）。

上述实验使用相同的白色念珠菌用于转录谱分析实验的菌株（THE1，表1). 因此，为了测试葡萄糖增强的抗应激能力是否是白色念珠菌，我们检测了葡萄糖对八株临床分离株耐过氧化物能力的影响，这些临床分离株代表了四个主要的流行病学分支白色念珠菌(MacCallum公司等。, 2009). 无论最初是从血流还是口咽中分离出来的(表1)，所有这些菌株都表现出显著的葡萄糖增强过氧化抗性(图7)表明葡萄糖对应激抵抗的积极影响是该病原体的一个普遍特征。

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葡萄糖增强的抗氧化能力是白色念珠菌.来自四个主要流行病学分支的菌株，无论是从血液还是口咽中分离出来的(表1)，显示出更强的抗氧化能力（50 mM H2O（运行）21%葡萄糖暴露1h后：葡萄糖处理细胞，封闭条；对照细胞生长在乳酸、开条上。三次重复实验的平均值和标准偏差如下所示：*p<0.05和**p<0.01（学生的t吨测试）。

Cap1、Hog1和Ras1在葡萄糖增强过氧化应激抵抗中的作用

bZIP转录因子Cap1通过其启动子中的YRE元件激活氧化应激基因，并在白色念珠菌(Alarco和Raymond，1999年;尼科尔斯等。, 2004). 也，第1章葡萄糖处理后转录水平升高白色念珠菌单元格(图3)，表明Cap1有助于葡萄糖增强的氧化应激抵抗(图6). 因此，我们测试了这种现象是否需要Cap1。同类白色念珠菌野生型（CAI4和RM1000）和帽1菌株用葡萄糖预处理，然后暴露于高剂量过氧化物（25mM）。Cap1的失活不会影响葡萄糖增加过氧化耐受性的能力(图8). 因此，尽管Cap1可能有助于实现这一效果，但葡萄糖增强的抗氧化性并不需要Cap1。

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调节器在葡萄糖增强抵抗过氧化应激中的作用。等基因菌株(表1)在YPLactate中生长至指数中期，用1%葡萄糖或乳酸盐处理1小时，暴露于25mM h2O（运行）21h后测定细胞活力。三次重复实验的平均值和标准偏差如下所示：*p<0.05和**p<0.01（学生的t吨测试）。

Hog1 SAPK也有助于在白色念珠菌(阿隆索·蒙格等。, 2003;史密斯等。, 2004). 因此，我们测试了Hog1是否是葡萄糖增强过氧化抗性所必需的。同类野生型和猪1对菌株进行了比较，表明Hog1并不是必需的葡萄糖增强过氧化抗性，尽管猪1细胞对这种氧化应激的抵抗力降低。这些结论得到了cap1猪1双突变体。尽管该突变体对氧化应激更敏感，但仍保留了葡萄糖增强的过氧化物抗性表型(图8)，确认Hog1和Cap1对该效果都不是必需的。

在酿酒酵母葡萄糖激活Ras-cAMP信号通路，通过下调转录因子Yap1、Msn2和Msn4，导致氧化应激抵抗的下调(Gounalaki和Thieos，1994年;斯坦希尔等。, 1999). Msn2/4同源物的功能在白色念珠菌与该病原体的氧化应激反应无关(尼科尔斯等。, 2004;拉姆斯代尔等。, 2008). 此外白色念珠菌同系物酿酒酵母Yap1不需要用于葡萄糖增强的过氧化物抗性(图8). 然而，据报道，Ras-cAMP信号转导影响应激基因的表达，并影响应激敏感性白色念珠菌(哈库斯等。, 2004;巴恩等。, 2007;威尔逊等。, 2007). 因此，可以想象Ras-cAMP信号传导可能介导葡萄糖对小鼠过氧化物抵抗的影响白色念珠菌因此，我们测试了该效应是否依赖于Ras1(图8).Ras1（Ras1）细胞对这种氧化应激更敏感。然而，葡萄糖仍然增加了这些细胞的抵抗力ras1（ras1）这表明这种效应并不依赖于Ras-cAMP信号转导。

活性氧和海藻糖在葡萄糖增强的过氧化物应激抵抗中的作用

AOX1a和AOX1b编码的交替氧化酶有助于白色念珠菌的耐氰呼吸途径(胡和康，2001年). 有人认为，这种途径有助于保护白色念珠菌免受线粒体呼吸活动产生的内源性活性氧物种的伤害(Huh和Kang，2001年). 因此，我们推断，添加葡萄糖可能会导致呼吸爆发，从而导致通过交替氧化酶Aox1a和Aox1b产生活性氧物种。根据该模型，这将引发氧化应激反应，从而防止随后暴露于高水平的过氧化物。我们通过检测葡萄糖暴露对细胞内活性氧积累的影响来测试这个模型。在三个独立的实验中，白念珠菌RM1000细胞暴露于1%的葡萄糖下，与对照细胞相比，细胞内活性氧水平大约降低了两倍(图9A） ●●●●。此外，Aox1a和Aox1b的失活并没有阻断葡萄糖增强的过氧化物抗性(图8). 这些数据表明，葡萄糖增强的过氧化物抵抗不是通过葡萄糖暴露后呼吸爆发产生活性氧来介导的。

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葡萄糖增强的抗逆性、海藻糖和活性氧水平之间的关系。（A） 葡萄糖对生长的乳酸细胞内活性氧水平（每毫克蛋白质的荧光单位）的影响白色念珠菌RM1000细胞，开条，无葡萄糖；封闭棒，1%葡萄糖维持1h。显示了三个独立实验的数据。显示了三次分析的平均值和标准偏差。（B） 外源海藻糖（1%）不能增强对过氧化应激的抵抗力（50 mM H2O（运行）2). 此外，Tps1失活(tps1型,表1)不会阻止葡萄糖增强的过氧化物应激抵抗。三次重复实验的平均值和标准偏差如下所示：*p<0.05和**p<0.01（学生的t吨测试）。

众所周知，海藻糖在酿酒酵母(威姆肯，1990年). 此外，海藻糖被认为在白色念珠菌(Alvarez-Peral公司等。, 2002;范·迪克等。, 2002;阿圭尔斯，2006年)并且已经证明可以防止严重的氧化应激(阿尔瓦雷斯·佩拉尔等。, 2002). 此外，葡萄糖暴露导致海藻糖生物合成mRNA水平增加白色念珠菌(测试程序集1-3;图3). 因此，我们想知道海藻糖代谢是否有助于葡萄糖增强过氧化抗性。我们测量了乳酸指数增长时细胞内海藻糖的水平白色念珠菌将细胞暴露于0%或1%葡萄糖中1h。在三个独立的实验中未观察到海藻糖水平的显著差异。暴露于1%葡萄糖的RM1000细胞含有0.034±0.006 nmol海藻糖/mg细胞，而暴露于0%葡萄糖的对照细胞含有0.032±0.006 nm ol海藻糖/mg细胞。第二次获得了类似数据白色念珠菌应变（THE1；未显示数据）。因此，尽管测试程序集mRNA水平，未观察到海藻糖水平的显著增加白色念珠菌葡萄糖暴露1h后。

然后我们测试了添加外源性海藻糖是否保护乳酸生长白色念珠菌对抗过氧化应激。未观察到明显的保护作用(图9B） ●●●●。最后，我们测试了海藻糖积累所需的Tps1是否失活(萨拉戈萨等。, 1998)导致葡萄糖增强型过氧化物抗性表型的丢失。事实并非如此(图9B） ●●●●。我们的结论是，尽管海藻糖在白色念珠菌(Alvarez-Peral公司等。, 2002)，葡萄糖增强的过氧化物抗性不是通过海藻糖积累介导的。

Hog1是葡萄糖增强渗透应激抵抗所必需的

接触葡萄糖会增加白色念珠菌渗透胁迫(图5). 在酿酒酵母和白色念珠菌，通过进化保守的Hog1-SAPK途径发生渗透胁迫适应(布鲁斯特等。, 1993;圣何塞等。, 1996;史密斯等。, 2004). 因此，我们测试了葡萄糖是否通过该信号通路刺激渗透应激抵抗。A类白色念珠菌猪1单个突变体和猪1头1双突变体没有表现出等基因亲本菌株RM1000所观察到的葡萄糖增强渗透胁迫抗性(图11). 相反，正如预期的那样帽1突变体保留了这种葡萄糖增强的渗透胁迫抗性表型。因此，Hog1是葡萄糖增强渗透胁迫抗性所必需的。

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Hog1对葡萄糖产生磷酸化反应。用磷酸化版本的Hog1特异性抗体检测到的磷酸化Hog1的Western blot（顶部）为总Hog1重制，作为对照的内部负荷（底部）。白色念珠菌细胞未经处理，暴露于葡萄糖或氯化钠处理作为阳性对照：野生型，THE-1；Δ猪1（请参见表1).

如果Hog1介导葡萄糖对渗透应激抵抗的影响，那么人们会期望这种MAP激酶在葡萄糖暴露后被激活。因此，我们检测了葡萄糖处理后Hog1的磷酸化状态白色念珠菌用磷酸特异性抗Hog1抗体进行Western印迹细胞(图11). 作为对照，我们为总猪1重复了这些斑点。我们还证实，野生型细胞中的Hog1磷酸化增加是对渗透胁迫的反应，并且与总Hog1和磷酸化Hog1相对应的条带在猪1突变体(图11). 值得注意的是，在葡萄糖处理的细胞中观察到Hog1磷酸化增加，表明Hog1对葡萄糖的反应被激活。这些观察结果与以下观点一致，即Hog1通路在葡萄糖作用下被激活，从而保护白色念珠菌细胞抵抗随后的渗透压力。

讨论

白色念珠菌和酿酒酵母居住在对比鲜明的壁龛中；因此，这些致病性和相对良性的酵母很可能在野外经历不同的葡萄糖暴露模式。因此，我们预测这些酵母可能对葡萄糖产生不同的反应。我们通过研究全球对白色念珠菌对低浓度（0.01%）、中浓度（0.1%）和高浓度葡萄糖（1%）的反应，并将这些反应与酿酒酵母在同等条件下(阴等。, 2003). 从我们的观察中可以得出几个值得注意的结论。

首先，我们得出如下结论酿酒酵母,白色念珠菌对环境中的低浓度葡萄糖极为敏感。在白色念珠菌细胞暴露于0.01%葡萄糖后30min内观察到转录组。该浓度明显低于人体血液中稳态维持的水平（3–5 mM；相当于～0.06–0.1%葡萄糖）(图1和​和2）。2). 因此，白色念珠菌能够检测并应对播散性血液感染期间血液中的葡萄糖水平。不足为奇的是，糖尿病患者的全身风险增加念珠菌感染(奥兹，1988)饮食中的葡萄糖增加白色念珠菌殖民和入侵(瓦尔加斯等。, 1993).

其次，我们发现白色念珠菌即使只暴露于0.01%的葡萄糖中，细胞也会调节代谢基因的表达。喜欢酿酒酵母(阴等。, 2003),白色念珠菌下调参与糖异生、TCA和乙醛酸循环以及碳同化替代途径的基因，而糖酵解和发酵基因上调(图1). 因此，白色念珠菌调节参与碳同化的代谢基因，即使是对低血糖信号作出反应。

这些观察结果似乎与早期的报告相矛盾白色念珠菌是一种对葡萄糖不敏感的Crabtree阴性酵母。该定义基于以下观察结果：白色念珠菌在有葡萄糖的情况下继续呼吸(青木和伊藤库娃，1982年;尼米等。, 1988). 然而，很明显白色念珠菌是葡萄糖敏感的，因为即使低水平的葡萄糖也会引发转录组的重大变化(图1和​和2；2; 补充数据）。我们的结论得到了特定葡萄糖调节基因分析的支持(洛伊克等。, 1997;蒙罗等。, 2001;巴雷勒等。, 2006;拉米雷斯和洛伦兹，2007年)并通过基因芯片研究白色念珠菌(洛伦兹等。, 2004). 此外，白色念珠菌0.025%到0.25%的葡萄糖浓度可以刺激形态发生(哈德逊等。, 2004;迈丹等。, 2005). 尽管这些形态发生的变化与我们当前的研究无关（因为我们的培养物是在30而不是37°C的温度下生长的），但这些其他研究加强了以下观点：白色念珠菌是一种对葡萄糖敏感的酵母。

第三，白色念珠菌和酿酒酵母在葡萄糖对应激反应的影响方面显示出根本性差异。葡萄糖下调应激反应酿酒酵母在这种酵母中，葡萄糖激活Ras-cAMP信号，导致蛋白激酶A介导的转录因子Msn2和Msn4磷酸化，从而抑制其核积累，并阻止在其启动子中携带同源一般应激反应元件的应激基因的激活(加罗等。, 2000;戈尔纳等。, 2002). Ras-cAMP信号也调节YAP1公司(Gounalaki和Thieos，1994年;斯坦希尔等。, 1999)，编码激活蛋白-1样转录因子，参与氧化应激的全球转录反应，对抵抗此类应激至关重要(史蒂芬等。, 1995;科恩等。, 2002). 葡萄糖还抑制一些应激基因的表达，如ENA1公司(阿勒普斯等。, 1997). Ena1是一种P型ATP酶Na+泵的失活会增加酿酒酵母阳离子应力下的细胞(哈罗等。, 1991). 因此，在酿酒酵母，葡萄糖通过多种信号机制下调应激反应(图11). 相比之下，我们发现一些白色念珠菌葡萄糖上调应激基因(图2和​和3）三)这些转录组的变化反映在对渗透应激、氧化应激和唑类抗真菌药物的抵抗力增加(图4​4–6).

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葡萄糖对应激反应影响的比较模型白色念珠菌和酿酒酵母.英寸酿酒酵母葡萄糖通过Msn2和Msn4下调一般应激反应，通过Yap1下调氧化应激反应，以及通过抑制一些应激基因的表达来抑制应激反应（见正文）。在白色念珠菌、Cap1和Hog1可能有助于葡萄糖增强氧化应激抵抗（见正文）。Hog1被磷酸化以响应葡萄糖，是葡萄糖增强的阳离子应激抵抗所必需的。类Msn2/4蛋白Msn4和Mnl1对氧化应激或渗透应激抵抗没有帮助白色念珠菌(尼科尔斯等。, 2004). 在白色念珠菌面板上，实心箭头推断出一个因素是产生效果所必需的，而虚线箭头则推断出一个因素对该效果有贡献，但对该效果不是必不可少的。灰色文本没有明显的作用。

葡萄糖是如何介导这些变化以提高应激敏感性的白色念珠菌？Ras1对这些效果并不重要(图8)，强化了该病原体的葡萄糖信号与其远亲良性病原体显著不同的观点，酿酒酵母此外，葡萄糖对应激抵抗的影响不是由替代性氧化酶介导的呼吸爆发介导的(图8和​和9A）。9A） ●●●●。葡萄糖也不是由海藻糖代谢介导的增强应激抵抗(图9B） ●●●●。相反，Cap1和Hog1可能介导葡萄糖对氧化应激和耐药性的影响。的表达式第1章，这是氧化应激和耐药性所必需的(Alarco和Raymond，1999年)，被葡萄糖上调(图3). Hog1也有助于抗氧化应激(阿隆索·蒙格等。, 2003;史密斯等。, 2004)，被葡萄糖激活(图11). 我们赞成Cap1和Hog1在介导葡萄糖增强的氧化应激抵抗中发挥部分冗余作用的观点(图11)，因为这可以解释为什么Cap1和Hog1对这种效果都不是必需的(图8).

葡萄糖对渗透胁迫抗性的影响似乎通过Hog1介导。葡萄糖刺激磷酸化和激活白色念珠菌猪1(图11). 此外，Hog1的失活阻断了葡萄糖增强的渗透胁迫抗性(图11). 之前，我们在白色念珠菌，的ENA21通用程序设计2,测试程序集2、和测试程序集3基因在渗透胁迫下上调，并且Hog1是其激活所必需的(昂雅尔贝等。, 2006). 因此，已知Hog1介导编码阳离子转运体和甘油和海藻糖生物合成相关酶的基因上调，以响应渗透胁迫。我们现在认为阳离子转运体、甘油和海藻糖生物合成酶通过Hog1上调对葡萄糖的反应，从而保护白色念珠菌随后暴露在阳离子压力下。

众所周知，Cap1和Hog1是渗透和氧化应激抵抗所必需的(圣何塞等。, 1996;阿拉科和雷蒙德，1999年;阿隆索·蒙格等。, 2003;史密斯等。, 2004). 然而，我们注意到帽1和猪1与同基因对照组相比，本研究中检测到的细胞对渗透和氧化应激的抵抗力没有降低(图8和​和10）。10). 抗压性测定的差异可能是这种明显矛盾的原因。之前的研究通过监测在压力下几天的平板生长来分析阻力。相反，为了研究葡萄糖的即时影响，我们在暴露于每种应激1小时后测定了细胞活力。我们建议，尽管Cap1和Hog1是自适应响应所必需的白色念珠菌细胞在渗透和氧化应激下恢复和生长，这些调节因子可能对白色念珠菌这些压力。

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调节剂在葡萄糖增强阳离子胁迫抗性中的作用。白色念珠菌菌株(表1)在YPLactate中生长，用葡萄糖或乳酸处理1h，暴露于1M NaCl中1h，然后测定细胞活力。三次重复实验的平均值和标准偏差如下所示：*p<0.05和**p<0.01（学生的t吨测试）。

我们的研究结果表明白色念珠菌已进化出将葡萄糖反应与氧化应激和渗透应激抵抗联系起来的分子机制。我们认为这可能与感染过程有关。例如，当侵入性白色念珠菌细胞进入血液后，很容易受到血载吞噬细胞的攻击。这些吞噬细胞产生氧化爆发，这是防御的主要途径念珠菌感染(萨萨达和约翰斯顿，1980年;Murphy，1991年;Vasquez-Torres和Balish，1997年). 中性粒细胞的杀伤还取决于阳离子流入吞噬细胞空泡(里夫斯等。, 2002). 然而，一旦进入血液，白色念珠菌细胞也会暴露在葡萄糖中。我们的数据表明，这种葡萄糖暴露将增加这些白色念珠菌细胞受到氧化和阳离子应激，因此可以保护它们免受吞噬白细胞的直接攻击。这与最近一个有趣的假设完全一致，即“微生物可能进化为通过适应其出现的时间顺序来预测环境刺激”(米切尔等。, 2009).

我们的发现也有助于解释白色念珠菌感染组织中的人口增长(巴雷勒等。, 2006). 大多数白色念珠菌感染小鼠肾脏的细胞表达糖酵解基因，表明它们主要通过糖酵化吸收碳。然而，这些细胞中有很大一部分表现出糖异生生长(巴雷勒等。, 2006). 我们的数据表明白色念珠菌在这些复杂的微环境中，细胞转化为葡萄糖可能会导致这种代谢异质性。

补充材料

【补充资料】

致谢

我们感谢珍妮特·奎因、唐娜·麦克卡勒姆、卡洛斯·甘塞多和Sa-Ouk Kang提供白色念珠菌突变体和Patrick van Dijck提供了海藻糖检测协议。我们还感谢英国生物技术和生物科学研究委员会（BBS/B/06670和BBS/S/2003/10842）、威康信托基金（063204和080088）、欧洲委员会（MRTN-CT-2003-504148和PITN-GA-2008-214004）和辉瑞公司的财政支持。

脚注

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体中的MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E09-01-0002)2009年9月16日。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会