衰老损害多能干细胞的成功重编程

摘要

从体细胞中获得多能干细胞的能力可能实现无限干细胞在基础生物学、药物开发或再生医学中的应用前景。已采用不同的策略将体细胞重新编程为多能干细胞。其中包括核转让(Wilmut等人，1997年)，与胚胎干细胞的细胞融合(Ying等人，2002年)或与干细胞多能性相关的因子的表达(高桥和山中2006). 关于后者，高桥和山中（2006）第一项研究表明，通过表达四种转录因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc），小鼠体细胞可以重新编程为多潜能样状态。自那时以来，诱导多能干细胞（iPS）已从多种来源的细胞中获得，包括成人成纤维细胞和角质形成细胞(Takahashi等人，2007年;Yu等人，2007年;Lowry等人，2008年;Park等人，2008年). 交替组合因子（即用Nanog和Lin28替代Klf4和c-Myc）已成功用于对不同细胞进行重新编程或提高重新编程的效率(Yu等人，2007年;Feng等人，2009年). 目前，将基于iPS的重编程转化为临床应用的两个主要限制是常规地安全、无载体和转基因序列地传递iPS细胞，以及提高重编程效率。第一个问题是通过使用替代方法来传递重编程因子，如瞬时转染(Okita等人，2008年)，转座子(Kaji等人，2009年)，腺病毒(Stadtfeld等人2008)，上位向量(Yu等人，2009年)或重组蛋白(Zhou等人，2009年). 正在研究不同的策略以提高重新编程的效率(Feng等人，2009年).

重新编程是一个渐进的过程；例如，逆转录病毒转导后，谱系特异性基因逐渐沉默，随着胚胎标记物的激活，与多能性相关的内源性基因被诱导(Brambrink等人，2008年). 然而，这一过程只会导致受感染人群中的一小部分细胞成为多能干细胞。这表明障碍可能会限制成功重新编程的效率。部分重组细胞（Pre-iPS）和iPS的遗传和表观遗传图谱的比较表明，独立衍生的Pre-iPS具有相似的基因表达和表观遗传学图谱，反映了一种常见的中间状态(Mikkelsen等人，2008年;Sridharan等人，2009年). 前IPS表现出不完全的表观遗传重塑和持续的DNA超甲基化，并可以通过全面抑制DNA甲基化以不同的效率转化为IPS(Mikkelsen等人，2008年). 限制重编程效率的其他机制的存在还有待研究。

衰老是指在细胞周期的G1转变过程中，由于复制衰竭或对诸如DNA损伤、化疗药物或癌基因异常表达等应激反应而引起的不可逆转的细胞周期停滞。这种阻滞主要通过激活p53和上调细胞周期素依赖性激酶（CDK）抑制剂p16来实现^INK4a公司和第21页^CIP1级(Collado等人，2007年). 衰老不仅仅是一种体外观察，它还发挥着相关的生理作用。特别是，癌基因诱导的衰老（OIS）在各种癌前病变中被广泛观察到，并被认为具有肿瘤抑制作用。衰老还通过调节干细胞自我更新来限制正常组织的体内平衡，从而影响衰老(Collado等人，2007年).

在本报告中，我们研究了iPS重编程过程与衰老之间的直接关系。我们观察到，重新编程最初会触发具有衰老特征的应激反应。这种重新编程诱导的衰老（RIS）是限制该过程效率的初始屏障。决定性的是，缓解这些培养物的衰老可以提高重编程效率。

结果和讨论

我们分析了体细胞对四种重编程因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）表达的早期反应(图1A). 为此，编码Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc（OSKM）的多顺反子盒式磁带(Carey等人，2009年)转移到逆转录病毒载体（pBABE-OSKM）。OSKM载体感染IMR90人成纤维细胞后的早期事件(图1)或与表达重编程因子（4-F）的四个单独载体共同感染（补充图S1）。作为对照，我们包括感染激活型RAS（H-RAS）的细胞^G12伏)，会导致衰老。在重编程因子表达后，我们观察到通过生长曲线、集落形成测定评估的IMR90细胞的数量和生长减少，并且掺入BrdU的细胞的百分比减少(图1B-D). 在我们的实验条件下，重组因子的表达增加了阻滞在G1中的细胞的百分比，而没有显著诱导细胞凋亡（补充图1）。表达四种重编程因子的细胞类似于细胞质增大的衰老细胞，表现出衰老相关β-半乳糖苷酶（SAβ-Gal）活性和衰老相关异色灶（SAHF）(图1E; 补充图1）。重编程因子在另一株人成纤维细胞（BJ）或小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中的表达也导致具有衰老特征的生长停滞（补充图2）。为了剖析每个重编程因子是如何导致衰老的，我们分别用每个因子感染IMR90细胞。令我们惊讶的是，Oct4、Sox2、Klf4和cMyc这四个因子都降低了IMR90细胞的细胞生长，减少了BrdU掺入，上调了标记物和衰老特征（补充图S3），因此，这意味着一个复杂的场景，在这个场景中，不同的通路可以同时被激活，以触发衰老，响应它们的联合表达。

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图1。

四种重编程因子表达诱导衰老。(A类)图中实验的时间表图2用表达四种因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）的多顺反子载体感染IMR90人成纤维细胞。选择细胞7天(B类)四种因子表达对IMR90细胞生长的影响。(C类)用指示的载体感染的IMR90细胞的结晶紫染色板。(天)四种重编程因子的表达导致包含BrdU的IMR90细胞百分比下降。(E类)表达四种重编程因子的载体对IMR90细胞SAβ-Gal活性和SAHF形成的影响。

为了确定在重编程的早期阶段导致衰老的途径，用OSKM载体感染IMR90细胞并进行免疫荧光分析。pST/Q或γH2AX抗体阳性的细胞核染色水平升高可观察到重编程因子的表达引起DNA损伤反应(图2A; 数据未显示）。有趣的是，OSKM的表达也会引起氧化应激，如氧化碱8oxoG水平升高所反映的（补充图S5A）。我们还观察到抑癌基因p16的显著上调^INK4a公司、p53和p21^CIP1级-OSKM多顺反子载体感染IMR90细胞后的关键衰老效应物(图2B-D; 补充图5）、BJ和MEF（补充图S2）。在诱导控制下表达四种因子的MEF已发表转录谱的再分析(Mikkelsen等人，2008年)显示p16增加^墨水4a和第21页^{Cip1号机组}以后会略有下降的水平（补充图S6）。在表达重编程因子的IMR90细胞中的一个时间过程表明，尽管衰老效应物的水平升高（与载体相比），但在以后的时间里，它们的表达降低，尤其是对p53和p21的表达^CIP1级（补充图S7）。

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图2。

重组因子表达诱导衰老的分子分析。(A–D)四种重编程因子的表达导致DNA损伤阳性细胞百分比（用pST/Q IF测量）、p53、p21的增加^CIP1级，和p16^INK4a公司补充材料和补充图4中详细说明了用于计算阳性细胞百分比的程序。(E类,F类)HPV E6和/或HPV E7的共表达或p53、p16的敲除减轻了四种重编程因子阻止IMR90细胞增殖的能力^INK4a公司，或p21^CIP1级使用结晶紫染色法测量的shRNAs(E类)或BrdU公司(F类).

有趣的是，我们还观察到p16的上调^INK4a公司和第21页^CIP1级（补充图S8C）(Pereira等人，2008年)这表明衰老和重编程之间存在内在联系。我们推断，如果衰老效应器的上调是对重新编程的早期反应，那么其在Pre-iPS细胞中的水平可能会保持升高。实际上，p16的表达^墨水4a和第21页^CIP1级与对照组相比，MEF衍生的Pre-iPS上调（补充图S9A），并且从重新检查公布数据中得出类似结论（补充图9B、C；Mikkelsen等人，2008年;Sridharan等人，2009年). 因此，使用不同的重编程方法，在不同的细胞类型中观察到重编程诱导衰老（RIS），这反映在衰老效应物（如p21）水平的升高上^CIP1级和第16页^INK4a公司在Pre-iPS中。

为了分析RIS期间衰老效应器上调的作用，我们将OSKM载体与HPV16的E6和E7蛋白共表达，分别使p53和Rb网络失活。如所示图2E，两者的表达均缓解了重编程因子诱导的生长停滞，E6和E7的联合表达至少具有相加效应。专门测试p16的贡献^INK4a公司，第21页^CIP1级我们使用shRNAs。对感染OSKM载体的细胞中BrdU掺入和生长的分析表明，p53，p21^CIP1级和第16页^INK4a公司与逮捕有关(图2E、F).

这个INK4a/ARF公司该位点通常受到H3K27甲基化和多梳抑制复合物募集介导的强烈表观遗传抑制。因此，我们调查了H3K27甲基化在INK4a/ARF公司基因座对重编程因子表达的反应。染色质免疫沉淀（ChIP）用于使用前面描述的引物集测量三甲基化H3K27（H3K27me3）与总H3的比率(图3A;Barradas等人，2009年). 压抑的标记在INK4a公司启动子，我们观察到H3K27me3修饰水平在INK4a/ARF公司基因座对重编程因子表达的反应(图3B). 纳入人类ES（hES）细胞进行比较，结果显示H3K27me3水平更高。同时，我们观察到H3K4me3标记在INK4a/ARF公司重编程因子表达的位点(图3C). 为了研究这些染色质变化背后的机制，我们分析了H3K27me3组蛋白去甲基化酶JMJD3的水平。JMJD3是重塑INK4a/ARF公司衰老过程中的基因座(Barradas等人，2009年). 我们观察到JMJD3在重编程因子表达上的急性上调(图3D，E). 与这一观察结果一致，ChIP反映了JMJD3向INK4a公司发起人；有趣的是，我们还观察到H3K27me3组蛋白甲基化酶EZH2与该位点的结合减少，但对其总表达水平的影响很小(图3F; 数据未显示）。我们观察到类似的重塑INK4a/ARF公司从单个载体（4-F）表达重编程因子时的位点（补充图S10）。

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图3。

组蛋白脱甲基酶JMJD3有助于调节INK4a/ARF公司RIS期间的基因座(A类)展示人类组织的卡通INK4b/ARF/INK4a使用的位点和引物集。(B类,C类)四个重编程因子的表达导致H3K27me3标记丢失(B类)H3K4me3分数增加(C类)在中INK4b/ARF/INK4a轨迹。(天)H3K27me3组蛋白脱甲基酶JMJD3是对四种重编程因子的表达作出反应而诱导的。(E类)上调JMJD3转录物对四个重编程因子表达的反应。(F类)ChIP分析显示JMJD3的富集和EZH2在INK4a公司启动子对四个重编程因子表达的反应。

了解p53/p21^CIP1级该通路在RIS期间参与，我们分别表达了每个重编程因子。Sox2、Klf4和c-Myc各自上调p21^CIP1级水平(图4A). 有趣的是，它们诱导了p21^CIP1级通过不同的机制。Sox2表达导致p21的p53依赖性上调^CIP1级而c-Myc或Klf4同时诱导p53和p21^CIP1级虽然只有c-Myc引起DNA损伤(图4A). 这些结果表明p21^CIP1级在重新编程期间由冗余信号激活。

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图4。

p21的作用^CIP1级RIS期间(A类)重编程因子对DNA损伤诱导及p53和p21表达的个体效应^CIP1级通过免疫荧光测定。c-Myc和Klf4的表达诱导p53上调。c-Myc、Klf4或Sox2的表达诱导p21的上调^CIP1级在两个独立的实验中获得了类似的结果。（O） 10月4日；（S） Sox2；（K） Klf4；（M） c-Myc公司。(B类)TaqMan分析了感染载体或四种因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）、三种iPS细胞（iPS B6、B7和B8）和H1 hES细胞（hES）的IMR90细胞中miR-302簇miRNAs的表达。(C类)miR-302簇（302）的表达减轻了OSKM诱导的衰老。(左侧)用指示的载体感染IMR90细胞，感染后10天，在16小时脉冲后测量BrdU掺入量。(赖特)如图所示为结晶紫钢板。（Ctrl.）控制向量。(天,E类)miR-302a–d防止p21上调^CIP1级(天)和p130(E类)免疫荧光分析重编程因子的表达。

已经确定了几种表达与多能性相关的microRNAs（miRNAs），如小鼠细胞中的miR-290簇，人类细胞中的microR-371-373簇，或两者中保守的miR-302簇(Houbavey等人，2003年;Suh等人，2004年). 这些miRNAs在ES细胞中表达，并在受精卵重编程至八细胞胚胎阶段时被诱导(Tang等人，2007年). 其中一些miRNA是ES细胞正常增殖所必需的，并通过靶向p21等负细胞周期调节因子发挥作用^CIP1级、Rb同源物p130或LATS2(Wang等人，2008). 在这方面，我们注意到不仅p21^CIP1级但在RIS期间p130的表达也增加（补充图S11A）。

IMR90细胞中四种重编程因子的表达并没有将这些miRNAs的水平重置为hES细胞中观察到的水平(图4B; 补充图S12），即使miR-302簇被Oct4和Sox2调节(Barroso-del Jesus等人，2009年). 相反，iPS细胞表达这些miRNAs的水平与hES细胞相当(图4B; 补充图12）。四种重编程因子的表达与多潜能相关miRNAs之间的解耦可能是p21升高的原因^CIP1级根据我们的假设，miR-302簇的异位表达减轻了生长停滞(图4C)并阻止p21的上调^CIP1级RIS期间观察到的p130(图4D，E).

我们观察的一个推论是，抑制衰老可以提高重编程效率。为了支持这一论点，我们敲低了p16的表达^INK4a公司，第21页^CIP1级或p53在BJ人成纤维细胞中表达shRNAs(图5A). 接下来，我们用表达Oct-4、Sox2、Klf-4和c-Myc的病毒感染这些细胞，并在适当的条件下培养它们，以促进人类iPS（hiPS）细胞集落的出现。21天后，通过免疫荧光分析菌落中NANOG和TRA-1-60的表达（补充图13A）。双阳性集落计数为完全重新编程的iPS细胞集落，而两种标记物的形态不同的集落阴性得分为部分重新编程(图5B; 补充图S13A–C）。使用形态学标准对IMR90细胞进行类似实验，以确定hiPS细胞集落和部分重新编程的集落。衰老效应器的敲除导致BJ和IMR-90细胞中完全和部分重新编程的iPS细胞集落数量增加(图5B; 补充图S13）。在MEF中进行的实验中，p16的表达^墨水4a/第19页^阿尔夫，第21页^{Cip1号机组}或p53被shRNAs敲除，或在p53或p21敲除的菌株中，也显示了衰老效应物耗竭后的重编程效率增加（补充图S14）。

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图5。

抑制衰老可提高重编程效率。(A类)用靶向衰老效应物的shRNAs感染BJ人成纤维细胞。定量RT-PCR显示p53转录物的水平，CDKN1A公司（p21编码^CIP1级)、和INK4a公司（p16编码^INK4a公司). (B类)用表达Oct-4、Sox2、Klf4和c-Myc的慢病毒转导上述BJ成纤维细胞，并在与多能干细胞生长相容的培养条件下生长。分析NANOG和TRA-1-60的菌落。阳性菌落数显示为三个代表性实验的平均值±SD。(C类)表总结了iPS细胞中hES细胞标记物的定量RT-PCR分析结果。（绿色）阳性；（黄色）阴性；（未注明日期）未确定。本实验所选定量RT-PCR图如补充图15所示。(天)敲除p53或p16后产生的hiPS细胞系表达多潜能标记物。(E类)敲除p53或p16后产生的hIPS细胞可以分化为胚外组织和三个胚层的衍生物。

从IMR90或BJ成纤维细胞中产生的hiPS细胞集落中单独挑选和扩增衰老因子水平降低的细胞。所有hiPS细胞系(n个=8）分析到目前为止表达的多能性标记，包括Oct4、Sox2、Nanog和Tra-1-60(图5C、D; 补充图S15），用于重编程的转基因在iPS中沉默(图5D). 迄今为止分析的hiPS系列(n个=8）能够在体外分化为胚外组织和三个胚层的衍生物-外胚层、中胚层和内胚层(图5E). 综上所述，这些数据表明，抑制衰老可以提高体细胞重新编程的效率，由此产生的iPS细胞表现出多能干细胞的特征。

不同的报告描述了未能完全重新编程的细胞（Pre-iPS）的特征，并表明它们被困在重新编程的后期(Mikkelsen等人，2008年). 抑制DNA甲基化、敲除谱系特异性基因或使用两种抑制剂治疗(Silva等人，2008年)可以将其中一些Pre-iPS转换为iPS，或者增加完全重新编程的iPS与Pre-iPS的比例。通过抑制或缓解衰老，我们推测可以增加超过RIS施加的早期屏障的细胞，从而增加Pre-iPS和完全重新编程iPS的数量（补充图S16）。这两种策略的组合可用于协同提高重编程效率。

在这项研究中，我们提供了与RIS相关的途径的初步证据^INK4a公司由表观遗传重塑控制INK4a/ARF公司该位点至少部分由JMJD3介导。p53/p21^CIP1级通路在不同水平上参与对重编程因子表达的反应。与复制诱导衰老和OIS期间观察到的情况类似，DNA损伤与该过程有关。此外，从重编程因子的单个表达中推断出的数据表明，p21的激活^CIP1级似乎是不同信号汇聚的关键终点。

通过引入定义的因子进行重新编程，从基于多能性所需因子知识的经验分析开始(高桥和山中2006). 关于重新编程背后的分子机制的其他信息可以用于为该方法添加逻辑。受精卵发育重编程为多能胚胎的研究可以为我们提供有价值的线索。在此过程中，miRNAs上调也需要维持与ES细胞相关的快速细胞增殖和细胞周期特征(Wang等人，2008). 我们发现，其中一些miRNAs的表达在iPS中也上调，但在成纤维细胞中表达重编程因子后早期仍然较低。miR-302簇的异位表达可缓解RIS。与我们的假设一致，即抑制衰老可提高重编程效率，miR-290和miR-302miRNA簇的成员已被证明可以提高重编程的效率(Judson等人，2009年). 尽管iPS的产生是一个人工过程，但这说明了我们如何从其机制中学习，并将其与其他生理相关过程联系起来。

总之，涉及重新编程的因素和过程会引起细胞衰老。尽管衰老与癌症之间的联系使得缺乏肿瘤抑制因子（如p53或p16）的iPS细胞的衍生变得不切实际^INK4a公司在重新编程期间，用可逆化合物处理细胞以暂时缓解或抑制衰老可能是一种可行的替代方法。下一个合乎逻辑的步骤是确定需要暂时抑制衰老以改善重新编程的精确时间。除了替代方法外，用靶向衰老效应器的siRNAs瞬时转染可能足以提高重编程效率。多个小组正在集中精力寻找提高重新编程效率的策略。除了无偏见的筛选方法外，对重编程过程的了解已经表明，能够放松表观遗传调控或提高ES细胞克隆效率的化合物或遗传元素是增强重编程的潜在候选物。我们相信衰老将是寻找更有效的诱导多能干细胞衍生策略的关键过程。

材料和方法

致谢

脚注

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