辅助依赖性腺病毒载体中非编码填充DNA的宿主细胞检测导致转基因表达的表观遗传抑制^▿

质粒和siRNA。

编码FLAG-tagged Sp100A、Sp100B和Sp100HMG的质粒由Hans Will（德国汉堡海因里希-佩特实验病毒学研究所）善意提供。编码血凝素标记的pp71和pp71delDID2/3的质粒由Robert Kalejta（威斯康星大学，麦迪逊分校）提供。表达野生型和突变型Gam1的质粒来自Susanna Chiocca（意大利米兰欧洲肿瘤研究所）。靶向Sp100和Daxx的混合小干扰RNA（siRNA）来自Dharmacon。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行所有转染。

炸薯条。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析采用改良版Upstate Biotechnology协议进行。用1 mM苯甲基磺酰氟（OmniPur）、10μg/ml亮氨酸蛋白酶抑制剂（罗氏）和10μg/ml抑肽酶（罗氏）补充裂解缓冲液和ChIP稀释缓冲液。将HeLa或A549细胞汇合在直径为15 cm的培养皿中（～2.5×10⁷细胞）被指示的病毒感染（感染多重性[MOI]，10 IU/细胞）；24h后，向培养基中添加浓度为1%的甲醛，并在室温下培养板10min。在0.125 M甘氨酸中孵育5分钟后，用冰镇磷酸盐缓冲液冲洗单层两次，刮入补充有1 mM苯甲基磺酰基氟化物的磷酸盐缓冲液中，并转移到1.5 ml微离心管中。通过离心（500×g，5 min，4°C）将细胞制成颗粒，悬浮在0.5 ml细胞裂解缓冲液[5 mM哌嗪-N个,N个′-双（2-乙磺酸）（PIPES；pH 8），85 mM KCl，0.5%NP-40]，并在4°C下恒速培养45分钟。通过离心（1250×g，5 min，4℃）将细胞核丸化，并在0.25 ml核溶解缓冲液（50 mM Tris-HCl[pH8]，1%十二烷基硫酸钠[SDS]，10 mM EDTA）中溶解10 min。通过超声作用将染色质剪切至平均大小200至1000 bp（5至10次脉冲，每次10 s，使用Vibra-Cell VCX 600超声波处理器[超音速与材料]，配备最大振幅为30%的阶梯式微尖）。剪切后的染色质用补充了22.2μg/ml剪切鲱鱼精子DNA和1.11 mg/ml牛血清白蛋白的ChIP稀释缓冲液稀释10倍。用50μl 50%蛋白G珠浆液（Upstate）预处理稀释的染色质（在200μG/ml剪切鲱鱼精子DNA和1 mg/ml牛血清白蛋白存在下预培养1h），在4°C下持续旋转2h。然后在4°C下将预先清除的染色质与所示抗体和50μl 50%的蛋白G珠浆液一起恒温培养过夜。这些实验中使用的抗体是抗腺病毒E1A（M58；新标记物）或辣根过氧化物酶结合的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（170-6516；Bio-Rad）（阴性对照）、抗未修饰H3（ab1791；Abcam）、抗泛乙酰基H3（06-599；Upstate）、抗泛乙酰基H4（06-866；Upstates）、抗RNA聚合酶II（N-20；Santa Cruz）、，抗2meK9H3（07-441；Upstate）和抗3meK27H3（Ab6002；Abcam）。

免疫沉淀后，依次用低盐免疫复合物洗涤缓冲液（ICWB）、高盐ICWB和氯化锂ICWB冲洗珠子；然后用Tris-EDTA冲洗两次。然后用0.25 ml免疫复合物洗脱缓冲液（100 mM碳酸氢钠，1%十二烷基硫酸钠）将珠子培养两次15分钟。Elugates合并；将氯化钠添加至200 mM；并将样品在65°C下培养4至6小时，以反转交联。接下来，向样品中添加10μl 0.5 mM EDTA、20μl 1 M Tris-HCl（pH 6.5）和1μl 20 mg/ml蛋白酶K（Sigma），然后在42°C下培养2 h。通过酚氯仿提取纯化DNA，并用异丙醇和20μg糖原（罗氏）沉淀。ChIP DNA悬浮在20μl H中₂O并使用半定量PCR进行分析塔克聚合酶（Invitrogen）。使用不同体积的输入DNA（通常代表输入的0.05%、0.1%和0.2%）和不同的循环数进行初步的半定量PCR分析，以建立PCR条件，该条件将在所使用的所有引物组的线性扩增范围内产生终点。半定量分析通常涉及25至30个扩增周期，所有引物组的退火温度如表所示​表1。1PCR产物在1.5或2%琼脂糖凝胶上进行电泳，并用溴化乙锭染色。

DNA甲基化分析。

为了检测宿主细胞转导前CpG甲基化的状态，从1×10¹¹SDS蛋白酶K提取hdAd-prok颗粒(35)，用MspI或HpaII消化，在1.0%琼脂糖凝胶上分离，并用溴化乙锭染色进行可视化。为了检测细胞转导后载体DNA的甲基化状态，A549细胞在250 IU/细胞的MOI下感染，在感染后1或7天，分离并用MspI、HpaII、SphI或McrB/C（新英格兰生物实验室）消化细胞总DNA。所得DNA在1%琼脂糖凝胶上分离，转移到尼龙膜上，并用地高辛（DIG）标记的hdAd-prok质粒DNA进行探测。使用DIG High Prime DNA标记和检测试剂盒II（Roche）进行DNA标记和探针检测。在先前确定的条件下，还使用亚硫酸氢盐转化法分析了hdAd-prok和-euk的DNA甲基化状态(10,13)。将转化的DNA悬浮在20μl H中₂O、 5μl用于PCR，40个扩增周期，引物集如表所示​表1。1将得到的PCR片段克隆到pBluescript KS（+）（Stratagene）中，并由StemCore实验室（加拿大安大略省渥太华市）测序。

hdAd-prok转基因与低乙酰化组蛋白相关。

我们最近确定，组蛋白在核移位后不久沉积在hdAd载体上，DNA被组装成生理上间隔的核小体（P.J.Ross和R.J.Parks，未发表的数据）。为了检测hdAd-prok和-euk的染色质状态，我们使用ChIP和针对转录抑制（二甲基K9 H3和三甲基K27 H3）或转录活性（乙酰化组蛋白H3、乙酰化组蛋白H4和RNA聚合酶II）染色质标记物产生的抗体。尽管这两种载体与未修饰组蛋白H3的关联水平相似，但两种载体均未与mCMV启动子或启动子内K9或K27甲基化的组蛋白H4表现出任何显著关联lacZ公司打开阅读框（图。​（图2A）。2安培)。然而，与hdAd-euk相比，我们观察到hdAd-prok mCMV启动子与乙酰化组蛋白H3和H4的相关性降低（图。​（图2B）。2B型)。与我们的表达式数据一致（图。​（图1B），1B年)，我们还观察到RNA聚合酶II与hdAd-prok的相关性降低（图。​（图2B）。2B型)。通过分析细胞位点证实了ChIP的特异性和有效性。正如所料，Myt1启动子是HeLa细胞中多梳沉默的已知靶点(19)与二甲基K9 H3和三甲基K27 H3相关（图。​（图2A）。2安培)。组成活性β-肌动蛋白启动子与乙酰化组蛋白H3和H4相关，但与K9或K27甲基化的H3无关（图。2A和B)，并且未诱导的β干扰素启动子与乙酰化组蛋白无关（图。​（图2B）。2B型)。综上所述，这些数据表明，原核DNA抑制基因表达独立于组蛋白甲基化，可能是通过招募使转基因启动子脱乙酰化的因子。

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图2。

与hdAd-euk相比，hdAd-prok与转录活性染色质标记物的相关性降低。用hdAd-prok（p）或hdAd-euk（e）（MOI，10IU/cell）感染HeLa细胞，感染后24小时，用指示的抗体处理细胞以检测ChIP。使用载体特异性（mCMV启动子和紫胶Z开放阅读框）或宿主特异性（β-肌动蛋白、β-干扰素[IFN-β]和Myt1）引物。PCR产物在琼脂糖凝胶上进行解析，并通过溴化乙锭染色进行可视化。（A） 使用针对异染色质相关组蛋白修饰的抗体进行ChIP。在HeLa细胞中，Myt1组成性不活跃（阳性对照），而β-肌动蛋白组成性活跃（阴性对照）。α、 反；2meK9H3，组蛋白H3在K9处二甲基化；3meK27H3，组蛋白H3在K27处三甲基化。（B） 使用针对转录活性染色质标记的抗体进行ChIP。在HeLa细胞中，β-肌动蛋白具有组成性活性（阳性对照），而干扰素-β在未刺激细胞中没有活性（阴性对照）。乙酰化Ac；RNApII，RNA聚合酶II。

抑制组蛋白去乙酰化可减轻原核DNA的抑制作用。

转录沉默启动子通常与去乙酰化组蛋白相关(17)。脱乙酰化由组蛋白脱乙酰酶（HDAC）家族的酶执行。在确定hdAd-prok转基因DNA与低乙酰化组蛋白相关后，我们接下来研究了HDAC在原核DNA抑制作用中的作用。TSA是一种抑制I类和II类HDAC的微生物小分子，给药后，两种载体的转基因表达量均呈剂量依赖性增加，尽管hdAd-prok的表达量增加幅度大于hdAd-euk（分别为40倍和10倍）（图。​（图3A）。3A级)。因此，我们得出结论，hdAd-prok是针对细胞HDAC的抑制。

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图3。

组蛋白去乙酰化的抑制或染色质修饰从填充DNA向转基因的扩散消除了原核DNA的抑制作用。（A） 用TSA预处理HeLa细胞5h，然后用hdAd-prok或-euk（MOI，1IU/cell）感染。在感染后18小时，收集细胞裂解物并测定β-Gal活性（平均值±标准误差；n个= 3). （B） HeLa细胞未经处理或用250 ng/ml TSA预处理5 h；随后，他们感染了hdAd-prok（p）或-euk（e）或含有HS4绝缘体元件的类似载体。感染后18小时，收集细胞裂解物并测定β-Gal活性（平均值±标准误差；n个= 3).

我们的研究表明，原核DNA使低乙酰化染色质形成核，从而抑制相关转基因。因此，插入一个绝缘体元件，阻止转录抑制染色质的扩散(32)，应该可以减轻原核填充物DNA的抑制作用。为了验证这一假设，我们在转基因和hdAd-prok和hdAd-euk的填充物DNA之间插入了鸡β-珠蛋白基因座衍生的HS4双核绝缘体元件（分别产生hdAd-prok-ins和hdAd-euk ins）（图。​（图1A）。1安培)。插入绝缘体元件对hdAd-euk转基因表达没有影响（图。​（图3B）；3B公司); 然而，在hdAd-prok-ins中包含绝缘体元件导致转基因表达比亲本载体hdAd-pro的表达增加了33倍（图。​（图3B）。3B公司)。为了证实这种效应是由于HS4绝缘体的屏障元件功能引起的，我们生成了一个额外的hdAd-prok载体，该载体包含一个1kb的真核DNA片段（来自紧邻HS4的填充器DNA）lacZ公司hdAd-euk中的表达盒）lacZ公司hdAd-prok中的表达盒和lambda填充器DNA；然而，这对hdAd-prok的转基因表达水平没有影响（数据未显示）。最近的工作表明，最小HS4双芯绝缘体中不包括的附加元件需要作为屏障元件发挥最佳功能(1)这可能解释了为什么我们没有看到hdAd-prok表达完全恢复到hdAd-euk水平。与此一致，用TSA和HS4绝缘体元件联合处理细胞，完全恢复了hdAd-prok的表达（图。​（图3B）。3B公司)。这些数据清楚地表明，阻断HDAC的作用可以将hdAd-prok表达恢复到hdAd-euk的水平。此外，这些数据表明，原核DNA被定位为转录抑制染色质的成核位点，然后扩散到转基因。

hdAd-prok载体DNA未甲基化。

在真核细胞中，沉默的基因经常与CpG二核苷酸的DNA甲基化增强有关。接下来，我们评估了宿主细胞转导前后hdAd DNA的甲基化状态。为了确定hdAd-prok DNA在进入宿主细胞之前是否甲基化，用等裂殖体MspI或HpaII消化纯化的病毒DNA。MspI消化不依赖甲基化，而HpaII消化被CpG甲基化阻断。这两种酶都能够完全消化亲本质粒DNA（由于缺乏细菌CpG甲基转移酶，因此未甲基化CpG）和衣壳衍生DNA（图。​（图4A），4A级)表明在宿主细胞转导之前，病毒DNA在CpG残基处未甲基化。为了确定宿主细胞转导后hdAd-prok DNA是否甲基化，我们从感染细胞中分离出DNA，并用MspI、HpaII或核酸内切酶McrB/C（与SphI共消化或不共消化）消化。McrB/C消化（A/G）甲基-C半位点之间的DNA（因此不包括MspI/Hpall识别序列CCGG）。Southern blot分析显示，感染后1天或7天获得的DNA没有明显的McrB/C裂解，并且在任一时间点与HpaII或MspI的消化模式没有差异（图。​（图4B）。4B类)。由于hdAd-prok基因组为～30 kb，因此很难通过McrB/C对少量甲基化CpG基序进行适度消化。因此，我们用SphI（将hdAd-prok基因组消化成三个片段，通过常规琼脂糖凝胶电泳很容易将其解析）在有或无McrB/C的情况下，从hdAd-pro感染细胞中消化基因组DNA。该实验的结果清楚地表明，添加McrB/C后，hdAd-prok带型没有差异（图。​（图4C）。4摄氏度)。因此，hdAd-prok DNA保持非甲基化，甚至在感染后1周。

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图4。

hdAd-prok DNA未甲基化。（A） 用MspI（M）或HpaII（H）消化hdAd-prok质粒DNA或纯化的hdAd-prok病毒的DNA。消化后的DNA在琼脂糖凝胶上溶解，并通过溴化乙锭染色进行可视化。（B） 用hdAd-prok（MOI，250IU/cell）感染A549细胞，并在感染后指定天数（dpi）采集基因组DNA。基因组DNA要么未消化（−），要么用McrB/C（B）、MspI（M）或Hpall（H）消化。（C） 用hdAd-prok感染A549细胞。在感染后24小时采集基因组DNA，并用指示的酶消化带有或不带有GTP。用DIG-标记的hdAd-prok质粒DNA进行Southern印迹分析消化后的DNA。

上述分析排除了hdAd-prok DNA的整体超甲基化。然而，为了更详细地分析病毒基因组的特定区域，我们对感染细胞的DNA进行了高分辨率亚硫酸氢盐测序。我们对mCMV启动子的380-bp片段进行了测序，该片段包含22个CpG基序，287-bp片段来自原核填充器DNA的中心区域，该区域包含20个CpG-基序。对mCMV启动子和填充器DNA的八个克隆进行序列分析，未检测到42个CpG基序的甲基化（数据未显示）。总之，我们的全球和特定位点分析未能检测到hdAd-prok DNA甲基化的任何证据。因此，我们得出结论，DNA甲基化并不参与调节原核DNA对转基因表达的抑制作用。

PML和PML机构对于抑制hdAd-prok是不必要的。

确定了原核填充物DNA中CpG基序的甲基化对hdAd-prok的抑制不是必需的（图。​（图4），4)，我们试图确定识别原核DNA并介导相关组蛋白脱乙酰化的细胞因子，从而抑制相关转基因。在宿主细胞转导后不久，PML小体在大型DNA病毒基因组附近重新组装(6)。这些病毒包括巨细胞病毒（CMV）、单纯疱疹病毒（HSV）和腺病毒（Ad），携带重组PML体的基因，而PML体是生产性感染所必需的。PML小体还含有细胞蛋白Sp100和Daxx，它们与抑制病毒基因表达有关(25,36)。因此，我们假设PML体可能参与抑制与原核DNA相关的基因。

为了研究PML在抑制hdAd-prok中的作用，我们构建了一个携带短发夹RNA（shRNA）的质粒，该质粒先前显示可以抑制PML的表达(8)。用该质粒转染细胞可阻断dsRed-PML的异位表达（图。​（图5A），5A级)证明了这个质粒在我们手中的功效。然而，PML的缺失对hdAd-prok的表达没有影响，只是轻微影响了hdAd-euk的表达（图。​（图5B）。5亿)。与这一观察结果一致，我们发现鸡Ad蛋白Gam1的过度表达阻止PML的SUMO化并阻止PML小体的形成(5)，不影响hdAd转基因表达（数据未显示）。因此，PML对于hdAd-prok的抑制是不必要的。

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图5：。

PML和PML机构对于抑制hdAd-prok是不必要的。用携带靶向PML mRNA序列的shRNA质粒（shPML）或携带对照shRNA的质粒（shCtrl）转染HeLa细胞，并分析敲除效率和对hdAd基因表达的影响。（A） shRNA输送48小时后，用表达dsRed或dsRed-PML的质粒转染细胞。一天后，用光场显微镜或荧光显微镜观察细胞。（B） shRNA导入48小时后，细胞感染hdAd-prok或-euk（MOI，1IU/cell）；24小时后，收集细胞裂解物并分析β-Gal活性（重复样品的平均值±范围）。这些数据代表了两个实验。

Sp100B和Sp100HMG对hdAd转基因表达的影响不大。

虽然PML对PML小体的形成至关重要，但在缺乏PML的情况下，PML小体内的几个成分——Sp100、Daxx和ATRX——在传入的HSV基因组上积累(7)。主要的Sp100亚型，Sp100A，只与体内PML小体相关；相反，Sp100B和Sp100HMG表现出弥漫性染色模式，并抑制HSV 1型基因的表达和复制(25)。为了确定Sp100是否在hdAd-prok表达的调节中发挥作用，我们用靶向所有四种Sp100亚型共有的mRNA序列的siRNA库转染细胞。用Sp100 siRNA转染导致对HeLa细胞中最常见的亚型Sp100A的约65%的敲除（图。​（图6A）。6A级)。Sp100敲除导致hdAd-euk表达适度下降，而hdAd-prok表达增加2.2倍（图。​（图6B），6亿)表明Sp100阻遏物亚型可能有助于抑制hdAd-prok转基因表达。为了确定不同的Sp100亚型对hdAd-prok基因表达是否有不同的影响，我们在hdAd-pro或euk感染细胞中短暂过度表达Sp100A、Sp100B或Sp100HMG（图。6C和D)。Sp100A的过度表达导致两种载体的表达增加了约2倍（图。​（图6D），第6天)与该亚型在基因激活中的作用一致。相反，Sp100B的过度表达对hdAd-euk没有影响，但使hdAd-prok的表达降低了20%。尽管Sp100HMG降低了两种载体的表达，但hdAd-prok的抑制程度高于hdAd-euk（分别为50%和30%）（图。​（图6D）。第6天)。因此，先前参与天然防御病毒入侵的Sp100亚型影响hdAd携带的转基因的表达。

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图6。

Sp100B和Sp100HMG影响hdAd载体的表达。（A和B）HeLa细胞转染所有Sp100亚型（siSp100）mRNA中的对照siRNA（siCtrl）或混合siRNA靶向序列。（A） 48小时后，收集全细胞裂解物，用抗Sp100或抗α-微管蛋白进行免疫印迹分析。（B） 转染48小时后，用hdAd-prok或-euk（MOI，1IU/cell）感染细胞。第二天，测定细胞裂解物的β-Gal活性（平均值±标准误差；n个= 3). 星号表示存在显著差异。（C和D）HeLa细胞转染pcDNA3或携带FLAG标记的Sp100A、Sp100B或Sp100HMG的质粒。（C） 20小时后，收集全细胞裂解物，用抗FLAG和抗α-微管蛋白进行免疫印迹分析。（D） 转染后第1天，用hdAd-prok或-euk（MOI，1IU/cell）感染细胞。第二天，测定细胞裂解物的β-Gal活性（平均值±标准误差；n个=2）。

我们感谢凯西·波林、亚当·史密斯、凯瑟琳·巴雷特、罗伯特·穆伦布鲁克和凯伦·鲍威尔提供的出色技术援助；杰弗里·迪尔沃思（Jeffrey Dilworth）、大卫·皮克茨（David Picketts）和迈克尔·鲁德尼基（Michael Rudnicki）对手稿提出了有益的建议和批判性评价；以及Frank Graham、Gary Felsenfeld、Hans Will、Robert Kalejta、Susanna Chiocca和Philip Ng提供试剂。

这项工作得到了加拿大卫生研究院、加拿大肌营养不良协会、加拿大肌萎缩侧索硬化学会、杰西·戴维森基因和细胞治疗基金会以及加拿大癌症研究学会的资助。P.J.R.得到了加拿大自然科学与工程研究委员会研究生和研究生奖学金的支持。