癌细胞中葡萄糖代谢的改变被称为Warburg效应，它描述了大多数癌细胞尽管有可用的氧气，但仍有贪婪地摄取葡萄糖并将其主要转化为乳酸的倾向1,2尽管人们对Warburg效应重新产生了兴趣，但癌细胞还依赖于持续的线粒体功能进行代谢，特别是谷氨酰胺分解，分解谷氨酰胺生成ATP和乳酸三谷氨酰胺，高度转运至增殖细胞4,5是生物合成的能量和氮的主要来源，也是癌细胞合成代谢过程的碳底物，但谷氨酰胺代谢的调控尚不清楚1,6在这里，我们报告了c-Myc（或Myc）致癌转录因子，已知其调节miRNAs7,8刺激细胞增殖9，转录抑制miR-23a和miR-23b，导致其靶蛋白线粒体谷氨酰胺酶（GLS）的表达增加。这导致谷氨酰胺分解代谢上调10GLS将谷氨酰胺转化为谷氨酸，谷氨酸通过TCA循环进一步分解代谢，以产生ATP或作为谷胱甘肽合成的底物11本文报道的Myc调节GLS的独特方式揭示了Myc调节miRNAs、谷氨酰胺代谢以及能量和活性氧物种（ROS）稳态之间先前未被怀疑的联系。
癌基因和抑癌基因现已与葡萄糖代谢的调节联系在一起，从而将癌症的基因改变与其葡萄糖代谢表型联系在一起1,2特别是，MYC癌基因产生MYC蛋白，该蛋白直接调节葡萄糖代谢酶以及参与线粒体生物生成的基因9,12在这方面，我们试图确定MYC在改变线粒体蛋白质组中的作用，以进一步了解肿瘤代谢的调控。我们研究了携带四环素再抑制MYC构建物的人类P-493 B细胞，因此四环素停药可快速诱导MYC和线粒体的生物发生，随后是细胞增殖12,13通过比较四环素处理和未处理的Myc高表达细胞的线粒体蛋白质组，我们发现8种线粒体蛋白在对Myc的反应中明显差异表达(和表S1). 我们注意到线粒体谷氨酰胺酶或GLS（MW～58kDa）对Myc的反应增加了～10倍。因此，我们在使用抗GLS抗体的时间进程研究中确定了谷氨酰胺酶对Myc诱导的反应10()发现GLS水平随着Myc表达的降低而降低，并在Myc再诱导后恢复。然而，线粒体蛋白TFAM的水平几乎保持不变。GLS水平也与另一个人类B细胞系（CB33）和一个具有组成性Myc表达的细胞系（CB 33-Myc）中的Myc水平相关14由于人类前列腺癌与Myc表达有关15，我们试图确定人类PC3前列腺癌细胞系中siRNA减少Myc表达是否也与GLS表达减少相关(). 与人类淋巴细胞相似，PC3细胞也显示出Myc和GLS水平之间的相关性。
1a、。扩展的二维凝胶插入物显示Myc在P493-6 B细胞中诱导谷氨酰胺酶（GLS；以白色圆圈突出显示）。在每种条件下，将350μg线粒体蛋白裂解物在18cm固定化pH梯度（IPG）条带上解析为第一维，然后将10%双三链SDS-PAGE解析为第二维，并用分子质量标记进行标记。通过银染色观察蛋白质斑点。针对每种情况进行了六项独立的生物学实验。表S1总结了具有与图中所示相同编号系统的点的标识。
1b、。线粒体蛋白质一维SDS-PAGE凝胶的抗GLS抗体免疫印迹（20μg/lane）验证了Myc在TFAM代表一种控制线粒体蛋白。
1c个用四环素（Tet）处理P493-6细胞不同时间以抑制Myc表达，或先用四环素处理48h，然后冲洗（Wash）以去除四环素，并注明冲洗后的时间。然后采集细胞进行GLS或c-Myc的免疫印迹分析。使用抗tubin抗体和抗TFAM作为负荷对照。
1天用抗c-Myc（siMYC）或对照siRNA（siCont）的siRNA转染的人CB33淋巴母细胞细胞、CB33-Myc细胞和PC3细胞进行免疫印迹分析。实验得到了类似的结果。
然后，我们试图确定对Myc的反应中GLS水平的显著变化是否与Myc诱导的细胞增殖有关。虽然有两种主要的已知组织特异性GLS亚型，GLS1和GLS216,17，我们的数据显示只有GLS1主要在P493-6或PC3细胞中表达(图S1). 我们首先确定通过PC3细胞过度表达获得GLS1功能是否可以挽救与siRNA介导的Myc减少相关的生长速度下降(图S2)发现仅异位GLS1表达不足以刺激生长。鉴于没有一个单一的基因可以取代Myc18,19Myc是一种多效性转录因子9这一结果并不特别令人惊讶。因此，我们通过RNA干扰（siGLS）降低了GLS1（以下简称GLS）的表达，并发现P-493-6细胞增殖被siGLS显著抑制，而不是被对照siRNA抑制(). 同样，人PC3前列腺癌细胞系的增殖被siGLS抑制()表明GLS对细胞增殖是必要的。
2a个.顶部面板，免疫印迹证明，与未转染（No tx）或对照siRNA（siCont）相比，用GLS1的siRNA转染细胞（siGLS）降低了GLS蛋白水平；下部面板siGLS对P493和PC3细胞的生长抑制。结果显示为平均值±SD，n=3。
2亿在对照、葡萄糖或谷氨酰胺缺乏条件下培养的P493和PC3细胞的生长抑制。结果显示为平均值±SD，n=3。
2厘米将细胞与正常培养基或不含葡萄糖（（−）gluc）或谷氨酰胺（（−）Q）的培养基培养48小时，然后按照方法一节中的描述进行ATP测定。结果显示（平均值±SD，n=2）为对照（Cont）正常培养基组每微克总蛋白的相对ATP水平。
二维.对照细胞（Cont）或转染有GLS siRNA的细胞（siGLS）或对照siRNA（siCont）中的ATP水平。转染72h后取细胞进行ATP检测。结果显示（平均值±SD，n=2）是与未转染对照组（Cont）标准化的每微克总蛋白的相对ATP水平。
2个细胞转染GLS（siGLS）或对照siRNA（siCont）的siRNA，并与10mM N-乙酰半胱氨酸（NAC）或5mM草酰乙酸（OAA）培养，或不添加对照。左侧面板显示转染后72h不同组的细胞计数（平均值±SD，n=5）；完整的细胞生长曲线可在图S5.右侧面板显示转染后72h的细胞死亡百分比。细胞死亡百分比表明Annexin阳性+AnnexinV和7-AAD阳性细胞。主要数据如所示图S4.
中的所有实验至少重复了两次。所有使用P493细胞的实验都没有四环素。（*）表示显著不同的平均值（±SD）(P（P）<0.05 byt吨测试）。
因为谷氨酰胺被GLS转化为谷氨酸，在TCA循环中进一步分解代谢，以前的研究表明，Myc的过度表达使人类细胞对谷氨酰胺戒断诱导的凋亡敏感11，我们测定了P493-6或PC3细胞对谷氨酰胺缺乏的代谢反应(). 谷氨酰胺停药后两种细胞系的生长均显著下降，而葡萄糖停药后细胞系的增长则略有下降。谷氨酰胺戒断也导致ATP水平下降()与细胞耗氧量降低有关(图S3a和S3b). RNAi降低GLS也降低ATP水平(). 因为谷氨酰胺是谷胱甘肽的前体20流式细胞术测定谷胱甘肽水平，发现随着谷氨酰胺的退出或RNAi介导的GLS降低，谷胱甘苷水平降低(图S4和表S2)这也与活性氧水平的增加有关(图S3c)和P493-6细胞中的细胞死亡（图和第5章). 值得注意的是，在发现MYC原癌基因后不久，发现携带v-MYC癌基因的MC29逆转录病毒能够增强可移植禽肝肿瘤细胞中的谷氨酰胺分解代谢和线粒体呼吸21因此，我们的发现在功能上将历史观察与Myc、谷氨酰胺酶和谷氨酰胺代谢联系起来。
由于GLS分解代谢谷氨酰胺以合成ATP和谷胱甘肽，其减少可能分别通过ATP的消耗和ROS的增加影响增殖和细胞死亡。因此，我们试图用TCA循环代谢物草酰乙酸（OAA）和氧自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）拯救P493-6细胞11OAA和NAC都部分挽救了失去GLS的P493-6细胞增殖减少和死亡（图和S6系列). 同样，OAA和NAC都部分挽救了谷氨酰胺脱氢P493-6细胞(图S5和S6). 这些发现支持了这样的观点，即通过GLS的谷氨酰胺分解代谢对Myc诱导的细胞增殖以及对Myc增强线粒体功能产生的ROS的保护至关重要11,20.
鉴于GLS对细胞增殖至关重要，并且是由Myc诱导的，我们确定了Myc调节GLS的机制。因为Myc是一种转录因子9，我们假设Myc作为靶基因直接激活GLS。尽管GLS基因内含子1中存在典型的Myc结合位点（5′-CACGTG-3′），但GLS mRNA水平对P493-6细胞中Myc水平的改变没有反应，表明GLS在转录后水平受到调节(). 因此，我们假设GLS可以由miRNAs调节，而miRNAs-又由Myc直接调节。TargetScan算法预测miR-23a和miR-23b可以靶向GLS 3′UTR种子序列。有趣的是，我们早期的研究发现，在P493-6细胞中，miR-23a和miR-23b都被Myc抑制7，并且这两种miR-23在人类前列腺癌中都减少22与Myc表达升高有关15.
3a、。用四环素（Tet）处理P493-6细胞不同时间以抑制Myc表达，或先用四环素处理48h，然后冲洗（Wash）以去除四环素，并注明冲洗后的时间。然后按照方法一节所述，采集RNA用于GLS1的实时PCR。数据显示为平均值±SD，n=3 PCR反应。
3b、。Northern分析经或不经四环素处理24h，然后转染反义miR-23a和miR-23b LNA或加扰对照LNA的P493细胞中miR-23a和miR-23 b的表达。转染48小时后，收集细胞，并按照方法部分所述进行northern blot分析。以U6 snRNA探针作为负载对照。
3c、。P493细胞的染色质免疫沉淀（ChIP）分析证明Myc与C9orf3启动子区域结合，其转录物被处理为miR-23b。扩增子的位置如条形图下方C9orf3基因的卡通所示（平均值±SD，n=3），表明Myc在扩增子2区域以四环素依赖的方式结合。抗-HGF是一种非特异性抗体控制。
3d。miR-23对GLS-3′-UTR萤光素酶报告基因的抑制作用。上部面板谷氨酰胺酶报告子（野生型GLS-3′UTR或突变型Mut-GLS-3’-UTR）或对照（PGL3）荧光素酶构建物用以下寡核苷酸转染到MCF-7细胞：扰乱对照LNA（cont-LNA）核苷酸或反义（miR-23-LNA）。显示了标准报告者与控制荧光素酶活性的比率。用100ng报告载体和4ng pSV-Renilla联合转染细胞，然后用10nM LNA反义miR-23或对照LNA联合转染。24小时后，使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）测量荧光素素酶活性。数据显示荧光素酶活性（RLU=相对光单位）归一化为对照组（平均值±SD，n=4）。（*）表示显著不同的平均值（±SD）(P（P）<0.05到t吨测试）。下部面板图示了miR-23a、miR-23b、GLS-3′UTR和MutGLS-3’UTR序列。
3e、。用对照（Cont-LNA）或反义miR-23 LNA（miR-23-LNA）处理的P493和PC3细胞中GLS蛋白水平的分析。左侧面板用四环素处理或不处理P493细胞24h，然后用反义miR-23a和miR-23b LNA或Scramble-control探针转染P493细胞。72小时后，收集细胞，用抗Myc和抗GLS抗体进行免疫印迹分析。Tubulin用作加载控制。右侧面板，用MYC siRNA（siMyc）或对照siRNA（siCont）转染PC3细胞。24h后，用miR-23a和miR-23b的LNA敲除探针或Scramble对照探针转染细胞。细胞培养72h，然后收获用于免疫印迹分析。每个实验重复两次，并显示一个具有代表性的实验。
为了验证miR-23a和miR-23b（以下称为miR-23）被Myc抑制，并可被反义miR-23锁定核酸（LNA）寡聚体减弱，进行了northern分析，miR-23被Myc压制，并被反义miR-23 LNA显著减弱(). 使用定量实时PCR，我们记录(图S7)miR-23水平随着Myc表达的减少而增加，然后随着Myc的再诱导而降低，其方式与GLS蛋白水平相一致我们还发现，在CB33人淋巴细胞和PC3前列腺癌细胞系中，Myc与miR-23a和miR-23b的水平呈负相关(图S8). 此外，如其他Myc miRNA靶点所示，Myc直接结合转录单位C9orf3，包括miR-23b7染色质免疫沉淀法(). 由于涉及miR-23a的转录单位尚未绘制，因此我们没有在此背景下研究miR-23a。这些观察结果证明，Myc抑制miR-23a和miR23b，而miR-23b似乎是由Myc直接调控的。
接下来，我们确定miR-23是否通过3′UTR靶向并抑制GLS的表达。在这方面，我们克隆了GLS的3′UTR序列，包括miR-23与pGL3荧光素酶报告载体的预测结合位点，并转染MCF-7细胞，已知其表达miR-2323GLS 3′UTR通过与反义miR-23 LNA共转染而阻断荧光素酶活性，但与对照LNA无此抑制作用(). 接下来，我们通过定点突变策略对预测的结合位点进行突变8并观察到突变体3′UTR没有像野生型序列那样抑制荧光素酶活性。在PC3细胞中使用这些报告物，我们观察到siRNA-介导的Myc表达减少导致野生型荧光素酶活性降低，但突变型3′UTR报告物没有降低(图S9). 最重要的是，在Myc表达降低后，GLS蛋白水平降低()，被反义miR-23 LNA拯救(). 反义miR-23 LNA还部分挽救了与RNAi介导的PC3细胞Myc表达降低相关的GLS水平降低().
我们还研究了GLS上游和下游的事件24发现谷氨酰胺转运体SLC7A5是由Myc在P493-6细胞中在转录水平上诱导的（核运行的5倍，未发表的数据），其mRNA水平的诱导率大于7倍。谷氨酰胺转运体ASCT2由Myc在mRNA水平上诱导2倍，而谷氨酸脱氢酶mRNA水平似乎没有改变（未公布的数据）。此外，我们发现人类前列腺癌中Myc蛋白的升高与GLS的水平相对应，而GLS在同一患者的伴随正常组织中没有增加(图S10). 有趣的是，与正常前列腺组织相比，人类前列腺癌中的miR-23a和miR-23b显著降低22值得注意的是，反义抑制引起的GLS功能的丧失在体内显著抑制了埃利希腹水肿瘤细胞的肿瘤发生25我们的研究结果揭示了一种途径，即Myc抑制靶向GLS的miR-23，通过增加线粒体谷氨酰胺酶的表达来增强谷氨酰胺分解代谢。综上所述，这些观察结果为人类癌症中谷氨酰胺酶和谷氨酰胺代谢的高表达提供了涉及Myc和miRNAs的调控机制。
