雷帕霉素是移植受者常用的一种免疫抑制药物，能特异性抑制细胞内激酶mTOR5最近的几项研究表明，雷帕霉素对免疫系统有多种作用，例如抑制浆细胞样树突状细胞产生I型干扰素6，调节T细胞贩运7和调节调节性T细胞中Foxp3的表达8,9然而，mTOR通路在调节CD8 T细胞反应中的作用尚不清楚。为了解决这个问题，我们在急性LCMV感染过程中用雷帕霉素治疗B6小鼠，并监测病毒特异性CD8 T细胞反应(). 我们惊奇地发现，雷帕霉素增强了LCMV特异性CD8 T细胞反应。淋巴组织和非淋巴组织中的抗原特异性CD8 T细胞数量增加(和补充图1）。这一结果的惊人之处在于雷帕霉素治疗组T细胞反应的收缩减少。在感染后第8天T细胞反应高峰时，两组小鼠的病毒特异性效应物CD8 T细胞的频率相似，但雷帕霉素治疗组的T细胞收缩最小(). 为了确定雷帕霉素治疗组感染后第8~30天T细胞收缩减少是否是由于细胞增殖增加和/或细胞死亡减少所致，在有或无雷帕霉素的情况下，用LCMV感染小鼠，然后在第10~22天的T细胞收缩期给予BrdU（补充图2）。我们发现，在两组小鼠中，抗原特异性CD8 T细胞与BrdU的结合最小，这表明在雷帕霉素存在下T细胞收缩减少并不是由于细胞增殖增加所致。因此，雷帕霉素的主要作用似乎是提高抗原特异性CD8 T细胞的存活率。
雷帕霉素提高病毒特异性记忆CD8 T细胞的数量和质量一，经雷帕霉素治疗的LCMV感染的B6小鼠PBMC中内源性GP33表位特异性CD8 T细胞的动力学（感染后第1天至30天；阴影区）（无Rapa，n=3只小鼠；Rapa Tx，n=6）。b条，感染后第36天脾脏内源性DbGP33四聚体阳性细胞的表型分析。c（c）在有或无雷帕霉素的情况下产生GP33表位特异性P14转基因记忆CD8 T细胞（感染后第34天），CFSE标记，然后过继转移到幼年小鼠中，以监测其稳态增殖。显示了移植后30天时P14细胞的CFSE稀释度，该数字表示分裂两倍以上的记忆细胞的百分比。d日过继转移来自雷帕霉素治疗或未治疗小鼠的记忆P14细胞，并用表达GP33表位（VVGP33）的痘苗病毒攻击小鼠。显示了激发后PBMC中P14细胞的动力学以及感染后第30天脾脏中的P14细胞总数（无Rapa，n=4；Rapa Tx，n=6）。误差条表示SEM。
接下来，我们检查了感染后第36天两组小鼠中存在的记忆CD8 T细胞的表型(). 为了研究这一点，我们使用四种有助于定义记忆性CD8 T细胞的标记物对病毒特异性记忆性CD8T细胞进行了表型分析：CD127；IL-7受体α与记忆性T细胞维持10-13，CD62L；淋巴结归巢受体与高增殖能力相关14，KLRG-1；与长寿命记忆细胞呈负相关15,16和Bcl-2；抗凋亡并在记忆T细胞中高水平表达12,17在雷帕霉素存在下产生的记忆性CD8 T细胞表达较高水平的CD127、CD62L和Bcl-2，并且KLRG-1的频率较高低细胞与对照小鼠的比较(和补充图3）。这些数据有力地表明，雷帕霉素对mTOR通路的抑制不仅增加了病毒特异性CD8 T细胞反应的幅度()但也提高了记忆CD8 T细胞的功能质量，因为记忆细胞具有表型（CD127高CD62L型高Bcl-2型高和KLRG-1低)与长期保护性免疫有关14-16为了直接测试这一点，我们检测了这些记忆CD8 T细胞进行自我平衡增殖的能力，这是长期记忆维持所必需的特性，并在再次暴露于抗原时作出重新激活反应。如所示经雷帕霉素治疗的小鼠产生的病毒特异性记忆CD8 T细胞在这两个标志性记忆特性方面均优于未经治疗的小鼠生成的记忆细胞。
在如所示的实验中在T细胞反应的整个过程中（感染后第1～35天），小鼠连续接受雷帕霉素治疗。接下来，我们研究了雷帕霉素仅在T细胞扩增期（感染后1~8天）给药时对CD8 T细胞反应的影响。这些结果()与我们之前看到的情况惊人地相似(); 即使在收缩期（第8~30天）停止雷帕霉素治疗，在药物存在下产生的效应CD8 T细胞的死亡率也很低。先前的研究表明，第8天效应CD8 T细胞群由两个亚群组成；末端效应器T细胞（CD127低、KLRG-1高)主要在随后的2～4周内死亡，记忆前体细胞（CD127高，KLRG-1型低)这些细胞大多存活下来并进一步分化，从而形成一个长寿命的记忆细胞池10,15,16我们的结果表明雷帕霉素促进了这些记忆前体细胞的形成。这确实是病例，雷帕霉素治疗小鼠产生的第8天病毒特异性效应物CD8 T细胞中含有较高比例的CD127高KLRG-1号机组低细胞和这些细胞也表达较高水平的Bcl-2(). 然而，我们注意到，在感染后第36天，药物治疗组和对照组小鼠的记忆CD8 T细胞表型相似(). 这与雷帕霉素连续治疗的结果不同（比较与). 综上所述，这些结果清楚地表明，雷帕霉素在幼稚到效应T细胞分化阶段增强了记忆前体的形成，但这些结果表明，雷帕霉素也可能调节效应到记忆过渡阶段。
T细胞膨胀期雷帕霉素治疗增加记忆前体的数量一，经雷帕霉素治疗的LCMV感染的B6小鼠PBMC内内源性GP33表位特异性CD8 T细胞动力学（感染后第1天至第8天；阴影区）（n=3~6；每个时间点）。b条、雷帕霉素处理的LCMV感染小鼠感染后第36天脾脏中DbGP33四聚体阳性细胞的平均数量（No-Rapa，n=9；Rapa-Tx日-1~8，n=3）。c（c）B6小鼠LCMV感染后8天，PBMC内源性DbGP33四聚体阳性细胞上CD127、KLRG-1和Bcl-2的表达。从感染后第1天到第8天服用雷帕霉素。d日，LCMV感染小鼠脾脏中DbGP33四聚体阳性细胞的表型分析（雷帕霉素治疗从感染后第1天到第8天）。误差条表示SEM。
为了验证这一假设，我们仅在急性LCMV感染后的T细胞收缩期（第8~35天）用雷帕霉素治疗小鼠(). 我们发现产生的记忆细胞数量不受药物影响()但这些记忆性CD8 T细胞的表型有显著差异(). 因此，在效应器到记忆过渡期，雷帕霉素治疗增强了记忆分化程序，导致具有高功能记忆细胞表型特征的病毒特异性CD8 T细胞数量显著增加（p值；<0.0001~0.0022）(). 重要的是要确定这是否代表已经表达这些记忆标记物的效应CD8 T细胞亚群的细胞增殖和生长，或者雷帕霉素是否真的在该效应-记忆分化阶段增加了存活效应T细胞中这些标记物的表达。为了解决这个问题，我们转移了一个高纯度（>99.7%）和CFSE标记的第8天CD62L群体低将抗原特异性效应器CD8 T细胞导入幼年小鼠，并监测这些转移的效应器细胞在雷帕霉素存在或不存在的情况下的细胞分裂和记忆分化(). 我们发现，在效应器到记忆的过渡期（移植后1～25天），没有细胞分裂，但在雷帕霉素存在下分化的记忆T细胞重新表达CD62L的速度要快得多(). 更重要的是，这些记忆CD8 T细胞功能优越，在受到表达LCMV GP33表位的痘苗病毒的攻击后，表现出更好的再呼叫反应和保护性免疫（病毒控制）(). 因此，在效应器-记忆过渡期抑制mTOR可以改善记忆T细胞的功能质量。
效应-记忆过渡期的雷帕霉素治疗加速记忆分化一，经雷帕霉素治疗的LCMV感染的B6小鼠PBMC中内源性GP33表位特异性CD8 T细胞的动力学（感染后第8天至36天；阴影区）（无Rapa，n=9只小鼠；Rapa Tx，n=8）。b条，LCMV感染后第36天脾脏内源性DbGP33四聚体阳性CD8 T细胞的表型变化（n=12；每组）。B6小鼠在效应-记忆T细胞过渡期（感染后第8~35天）用雷帕霉素治疗。c（c）纯化CD62L阴性第8天P14转基因效应CD8 T细胞，用CFSE标记，然后过继转移到幼鼠体内。其中一半的小鼠在转移后接受雷帕霉素治疗(d日)对血液中抗原特异性CD8 T细胞的CD62L转化进行纵向分析。e（电子）CD62L阴性效应T细胞转移后第27天，脾脏中抗原特异性记忆CD8 T细胞的CFSE谱和CD62L表达。（f）将CD62L阴性的第8天P14转基因效应CD8 T细胞过继性转移到幼鼠体内。这些小鼠用雷帕霉素治疗25天，并在转移后第28天用VVGP33攻击。激发后5天，P14在脾脏扩张(克)卵巢中的病毒滴度(小时)分析（n=4~6；每组）。流量数据在CD8 T细胞上进行门控。误差条表示SEM。
迄今为止的结果表明，雷帕霉素可以提高原发性病毒感染后CD8 T细胞反应的程度和质量。接下来，我们研究了在第二次反应中是否会出现类似的影响。如补充图4所示，当仅在LCMV继发感染期间进行药物治疗时，雷帕霉素也增强了再呼叫反应。因此，雷帕霉素可调节初级和次级T细胞反应，这对设计策略以提高初幼疫苗治疗期间记忆性T细胞质量具有重要意义。
为了确定我们在LCMV感染小鼠模型中的发现是否可以推广到其他系统，我们检测了雷帕霉素在用非复制疫苗免疫小鼠后的作用。在这些实验中，小鼠接种了由乙型肝炎核心抗原遗传融合到LCMV GP33表位的VLP（类病毒颗粒）18雷帕霉素再次增强了VLP诱导的记忆CD8 T细胞的数量和质量（补充图5）。应该指出，雷帕霉素治疗的效果非常持久；停止药物治疗后165天，记忆性T细胞数量仍然高出10倍（补充图5a）。我们还测试了这种方法在非人类灵长类动物模型中的适用性。在雷帕霉素存在或不存在的情况下，用MVA增强先前接种痘苗病毒的恒河猴，并通过细胞内IFN-γ染色分析抗原特异性CD8 T细胞反应。我们发现雷帕霉素治疗组和未治疗组猴子抗原特异性CD8 T细胞的频率存在明显差异。在雷帕霉素的存在下，观察到记忆性CD8 T细胞保持较高数量（补充图6a、b），与对照动物相比，T细胞收缩明显较慢（补充图6 c）。这些结果表明，在接种活疫苗或灭活疫苗后，雷帕霉素可增强小鼠和非人类灵长类动物的T细胞免疫。
我们的结果清楚地证明mTOR是记忆CD8 T细胞分化的主要调节器。然而，需要回答的一个关键问题是，mTOR是否在抗原特异性CD8 T细胞中固有地起作用，以调节记忆分化，或者雷帕霉素对记忆形成的影响是否是由免疫系统的一些其他细胞介导的。解决这个问题很重要，因为mTOR在许多细胞中普遍表达，最近的几项研究表明雷帕霉素可以调节免疫系统其他几个细胞的功能特性6,8,9,19,20为了解决这个问题，我们使用基于逆转录病毒的RNA干扰（RNAi）系统特异性地敲除抗原特异性CD8 T细胞中mTOR通路的各种基因（mTOR、raptor、S6K1、eIF4E和FKBP12）。使用以GFP标记并表达特定基因或对照逆转录病毒RNAi的逆转录病毒感染LCMV特异性转基因CD8 T细胞（P14细胞），然后将这些转导的细胞过继性转移到幼稚小鼠中，然后再进行LCMV感染（补充图7a）。该系统允许我们比较相同环境（即同一小鼠）中转导GFP阳性逆转录病毒的记忆性T细胞分化过程中发生的表型变化，以及转导的GFP阴性非转导抗原特异性CD8 T细胞的表型变化（补充图7b）。因此，这两个细胞群之间的记忆分化差异可以归因于抗原特异性T细胞中特定基因的内在效应。
首先，我们敲除抗原特异性CD8 T细胞中的mTOR本身。我们发现mTOR RNAi逆转录病毒转导的GFP+与非转导或对照载体转导的P14细胞相比，P14细胞表现出明显较高的典型记忆T细胞标记物（CD127、CD62L、Bcl-2、CD27）表达和较低的KLRG-1表达(). 这些数据表明，mTOR在抗原特异性CD8 T细胞中起内在作用，以调节记忆分化。然而，由于mTOR形成两种不同的复合物，即雷帕霉素敏感的mTOR复合物1（mTORC1）和雷帕霉素不敏感的mTORC25mTOR敲除并不完全模拟雷帕霉素治疗。为了区分这两种途径，我们敲除了猛禽基因，猛禽是mTORC1复合物的重要组成部分21,22。如所示，抗原特异性T细胞中猛禽的抑制产生的结果与mTOR敲除后的结果相同，确定mTORC1复合物是记忆分化的调节器。为了深入了解mTOR调节记忆形成的机制，我们研究了S6K1和eIF4E的作用5我们发现敲除这些mTORC1下游效应器显著增强了记忆CD8 T细胞分化（补充图8）。因此，我们的结果表明mTOR通过这两个下游分子发挥作用。
mTOR通过mTORC1途径在抗原特异性CD8 T细胞中发挥内在作用，调节记忆T细胞分化使用基于逆转录病毒的RNAi系统敲除特定基因（mTOR或猛禽）。将逆转录病毒转导的LCMV特异性P14转基因CD8 T细胞（以GFP表达为标志）过继性转移到幼鼠体内，然后感染LCMV。逆转录病毒转导细胞（GFP）的表型分析+)和非转导（GFP-)感染后14~16天对PBMC中的P14细胞进行检测。a、 和b，每个品系在单个动物的转导和非转导抗原特异性CD8 T细胞上显示指示的表型标记的表达。一，mTOR RNAi。b条，猛禽RNAi。面板中显示了相同的控制数据(一)和(b条).c、，将表达FKBP12 RNAi的逆转录病毒或对照逆转录病毒转导的P14转基因CD8 T细胞（以GFP表达为标志）过继性转移到幼年小鼠体内，然后感染LCMV。半数小鼠在感染期间接受雷帕霉素治疗。逆转录病毒转导细胞（GFP）的表型分析+)和非转导（GFP-)感染后14~16天对PBMC中的P14细胞进行检测。
为了进一步探讨mTOR在T细胞内在与外在记忆分化效应中的作用，我们通过敲除FKBP12蛋白制备了雷帕霉素敏感性抗原特异性CD8 T细胞。这种细胞内蛋白结合雷帕霉素，正是这种FKBP12-雷帕霉素复合物抑制了mTORC1通路。因此，通过敲低P14 CD8细胞中的FKBP12，我们使这些细胞对雷帕霉素的任何内在作用都不敏感，但该药物仍然可以有效作用于小鼠的所有其他细胞。该系统允许我们检测其他细胞中mTOR的抑制是否会影响记忆CD8 T细胞的分化。如所示当抗原特异性细胞本身对雷帕霉素不敏感时，抑制其他细胞中的mTOR并不影响记忆分化。雷帕霉素对记忆分化的影响在P14细胞中FKBP12被敲除后几乎消失，这些细胞没有表现出特征性记忆标记物（CD127、CD62L、Bcl2等）的增加表达（见). 因此，综合下列结果确定mTOR不仅在抗原特异性CD8 T细胞中起内在作用，而且在其他细胞中抑制mTOR对记忆性T细胞分化的影响最小或没有影响。
在过去几年中，在理解幼稚、效应和记忆性T细胞之间的谱系关系以及定义记忆性CD8 T细胞分化的表型和功能变化方面取得了相当大的进展1,23然而，对调节记忆T细胞生成的细胞内分子和途径知之甚少。在这项研究中，我们现在确定了一种调节记忆T细胞分化的分子途径，并提供了一种调控记忆细胞形成的策略。特别是，提高记忆T细胞功能质量的能力为增强疫苗对传染病和癌症的疗效提供了一种新的途径。
方法
小鼠、病毒感染、VLP和病毒滴定
12至16周龄的C57BL/6j小鼠购自杰克森实验室（马里兰州巴尔港）。携带DbGP33特异性TCR的Thy-1.1 P14转基因小鼠在我们的动物群中与C57BL/6小鼠完全回交。LCMV阿姆斯特朗（2×105PFU、IP）和重组痘苗病毒GP33（VVGP33，5×106表达LCMV GP33表位的PFU（IP）用于感染。如前所述，通过斑块试验测定卵巢中VVGP33的滴度14对于VLP免疫，小鼠皮下给予50μg VLP，其来源于与LCMV gp33-41表位（KAVYNFATM）基因融合的乙型肝炎核心抗原（HBcAg），并用CpG ODN包装。
小鼠服用雷帕霉素
在治疗期间，每天给小鼠注射雷帕霉素（惠氏，新泽西州麦迪逊）。采用三个不同的治疗期：1）在LCMV感染期间（感染前1天到记忆期，感染后35天）；2） T细胞扩增期（感染前第1天到感染后第8天）；或3）T细胞收缩期（感染后第8天至记忆期，第35天）。治疗1）和2）的雷帕霉素日剂量为75μg/kg（血浓度；5～20 ng/ml），治疗3）（收缩期治疗）的雷帕霉素日剂量为600μg/kg。对照组小鼠在上述相同时间段内接受假治疗（每天注射不含雷帕霉素的缓冲液）。
猕猴与疫苗接种
六只群体繁殖的SPF恒河猴(猕猴)根据美国食品和药物管理局指南，通过松土接种Dryvax（惠氏，新泽西州麦迪逊）。简单地说，将一根分叉的针浸入疫苗悬浮液中，并连续15次戳皮肤。在Dryvax疫苗接种后105天，给动物接种108肌肉注射PFU MVA。
雷帕霉素在恒河猴体内的应用
6只Dryvax免疫恒河猴中的3只在接种MVA前5天左右每天肌肉注射雷帕霉素（10~50μg/kg/天）。雷帕霉素的血浓度维持在5～15 ng/ml范围内。其他三只猕猴作为对照组未接受治疗。
效应和记忆T细胞亚群的产生和分离
为了产生LCMV特异性P14效应T细胞，将1×105过继转移的P14原始T细胞感染LCMV。感染后第8天，从脾脏分离出效应器P14细胞，并使用抗CD62L磁珠和CD8 T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec，Auburn，CA）纯化CD62L阴性CD8 T淋巴细胞。然后将这些细胞用于CD62L转化实验和保护性免疫反应实验。对于CD62L转化实验，CFSE标记CD62L阴性P14效应细胞（7~10×106细胞）过继性转移到幼稚小鼠体内。对于保护性免疫反应实验，3×105将CD62L阴性P14效应细胞过继性转移到幼年小鼠体内，给予雷帕霉素25天。在移植后第28天，用VVGP33攻击小鼠，以检查保护性免疫反应。为了获得雷帕霉素处理小鼠产生的记忆P14细胞，将1×105过继性转移P14原始T细胞，感染LCMV，然后在感染后第1天到第33天用雷帕霉素治疗这些小鼠。感染后第34天，从脾脏分离出在雷帕霉素存在下产生的记忆P14 T细胞。使用相同的方法获得控制记忆P14细胞，无需雷帕霉素处理。对于稳态实验，CFSE标记记忆P14细胞（1×106从雷帕霉素治疗或未治疗的小鼠中获得的细胞被过继性转移到不同的幼稚受体。对于回忆反应实验，1×104将来自雷帕霉素治疗或未治疗小鼠的P14记忆性T细胞过继性转移到单独的幼年小鼠中，转移后第二天这些小鼠感染VVGP33。为了研究雷帕霉素在继发性T细胞反应中的作用，2.5×104将P14记忆性T细胞（感染后>60天）过继转移至幼鼠，并开始雷帕霉素治疗。转移后第二天，这些小鼠感染了LCMV。
流式细胞术
在LSRII、CantonII或FACSCalibur（BD生物科学）上进行流式细胞术分析。如前所述制备MHC I类四聚体24除CD127、KLRG-1和CD27外，所有流式细胞术抗体均购自BD biosciences。CD127和CD27抗体从eBiosciences（加利福尼亚州圣地亚哥）购买，抗KLRG-1抗体从Southern biotech（阿拉巴马州伯明翰）购买。制备小鼠脾细胞、淋巴结、肝脏或PBMC的单细胞悬液，并按照前面所述进行直接体外染色14对于体内BrdU掺入，LCMV感染的小鼠每天在饮用水中喂0.8 mg/ml BrdU。根据制造商的说明，使用BrdU流动试剂盒（BD Biosciences）测量病毒特异性CD8 T细胞中的BrdU。检测恒河猴产生的痘苗病毒特异性CD8 T细胞，1.5×106将通过密度梯度离心分离的PBMC与感染倍数为1的痘苗病毒在37°C下孵育15小时，体积为300μl RPMI，含10%热灭活FBS。最后5小时孵育中添加Brefeldin a（5ug/mL）。细胞内细胞因子染色检测产生IFN-γ的痘苗病毒特异性CD8 T细胞。
基于逆转录病毒的RNAi
pMKO.1 GFP逆转录病毒载体（Addgene质粒10676，Cambridge，MA）由William Hahn博士提供。将针对mTOR、猛禽、FKBP12、S6K1和eIF4E的短发夹RNA（shRNA）的双链寡核苷酸克隆到pMKO.1 GFP中，位于AgeI和EcoRI位点之间。mTOR shRNA的序列为：5'-CCGGGCCAGAAATCCATCCATTCTCGAGAATGAATGGATTCTGGCTTTTG-3'（正链）和5'-AATTCAAAAAGCCAGAATCCATTCTCGAATGATATGGAT TCTGGC-3’（反义链）。猛禽shRNA的序列为：5'-CCGGGCCCGAGTCTGTGAATGTAATCGAGATACATCACACTCGGGC TTTTT G-3'（正链）和5'-AATTCAAAAAGCCGAGTGTGAGTAATCTCGATACTCACACACAC TCGGC-3’（反链）。FKBP12 shRNA的序列为：5'-CCGGGCCAAACTGAAATCTCCTCACTCGAGAGATTACAGTTGGCT TTTTG-3'（正链）和5'-AATTCAAAAAGACCAACTAACTCTCCACTCGGAGTGAGGAGATTCAG TTTGGC-3’（反链）。S6K1 shRNA的序列为：5'-CCGGCATGGAACATTGTGAGAAAATCGATTCTCACAATGTCCATGCT TTTTG-3'（正链）和5'-AATTCAAAAAGCATTGAGAATCGAGATTTCCACAATGCT CCATGCT-3'（反链）。eIF4E shRNA的序列为：5'-CCGGCGAAGATAGTGATTGTTATCCGAGATACCAATCACTATCGGTTTTTG-3'（正链）和5'-AATTCAAAAACCGATAGAGTGTTATCGCGAACTATCACTAT CTTCGG-3'。通过使用TransIT-293（Mirus，Madison，WI）在293T细胞中与pMKO.1 GFP和pCL-Eco（Imgenex，San Diego，CA）共转染制备重组逆转录病毒。转染48小时后收集培养上清液。为了用重组逆转录病毒转染P14细胞，用1×10感染P14转基因小鼠6静脉注射LCMV的PFU和24小时后，分离P14转基因脾细胞，然后在37°C下用含有8μg/ml聚brene（西格玛，圣路易斯，密苏里州）的肉样收集的逆转录病毒进行90分钟的自旋转染。5 × 105将逆转录病毒转导的P14脾细胞过继转移到幼年小鼠体内，然后感染LCMV（2×105PFU、IP）。GFP+感染后第7~8天用FACS纯化P14 CD8 T细胞，然后用western blotting分析蛋白表达水平（补充图10）。
统计分析
对于RNAi实验的统计分析，双尾配对学生t吨使用了测试。为了确定病毒滴度的统计意义，我们使用了非参数Mann-Whitney检验。所有其他统计分析均使用双尾非配对学生的t吨测试。
