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免疫。作者手稿；PMC 2010年6月19日发布。
以最终编辑形式发布为：
免疫。2009年6月19日；30(6): 912–925.
2009年6月11日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.immuni.2009.05.006
预防性维修识别码：项目经理2709841
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院127496
PMID：19523850

组蛋白甲基化的全基因组分析揭示了染色质状态对CD8记忆T细胞差异基因转录和功能的复杂调控

荒木靖国,1,# 王志斌,2,# 崇治藏,三 威廉·伍德（William H.Wood），III,4 达斯汀·斯科恩斯,2 崔凯荣,2 大英·卢,2 布拉德·洛茨基,5 罗伯特·沃斯托,6 彭伟群,三 凯文·贝克尔,4 赵克吉,2,*和南平翁1,*
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补充资料

总结

记忆淋巴细胞的特点是对回忆抗原表现出快速反应的能力，其中差异转录起着重要作用，但其潜在机制尚不清楚。我们报告了两个组蛋白H3赖氨酸残基（H3K4me3和H3K27me3）上组蛋白甲基化的全基因组分析以及幼稚和记忆CD8 T细胞中的基因表达谱。我们发现，基因表达水平与整个基因体的H3K4me3（正相关）和H3K27me3（负相关）水平之间存在普遍相关性。这些相关性显示了四种不同的模式：抑制、活跃、平衡和二价，反映了这些基因的不同功能。此外，每个基因的允许染色质状态是通过不同组蛋白修饰的组合建立的。我们的发现揭示了组蛋白甲基化对差异基因表达的复杂调控，并提示组蛋白甲基化可能与记忆CD8 T细胞功能有关。

关键词：染色质状态、差异基因表达、记忆T细胞、组蛋白甲基化、ChIP-Seq、微阵列

介绍

免疫记忆为疫苗接种提供了基本基础，但免疫系统如何实现这种长期增强的功能，以再次遇到同一病原体，这一问题尚未解决。免疫记忆的中心是记忆淋巴细胞，它们能够产生快速而有力的细胞反应，并具有自我更新的干细胞样能力(Dutton等人，1998年;Antia等人，2005年). 记忆性T细胞是异质性群体，可分为两个功能亚群：中央记忆（T细胞）厘米)和效应器记忆（T相对长度单位)T细胞，基于其不同的归巢能力和效应器功能(Lanzavecchia和Sallusto，2005年). 记忆T细胞的功能特性是在幼稚细胞激活后获得的，其中特定基因的转录调控在记忆细胞的生成和随后的维持过程中起着核心作用。

抗原刺激导致原始CD8 T细胞的系列转录改变，并导致其分化为能够消除受感染靶细胞的效应CD8 T淋巴细胞(Williams和Bevan，2007年). 已经确定了一些对这种分化过程至关重要的转录因子，包括TBX21（T-bet）、EOMES和PRDM1（BLIMP1）(Sullivan等人，2003年;Pearce等人，2003年;Martins等人，2006年). 这些转录因子的激活反过来诱导效应功能相关基因的表达，包括干扰素γ、穿孔素和颗粒酶B。在清除感染细胞和病原体后，记忆细胞出现并表达不同于原始和效应CD8细胞的基因图谱(Kaech等人，2002年). 在存储器CD8 T细胞亚群中，T厘米表达一些归巢和抗凋亡基因，而T相对长度单位表达与效应器功能、促凋亡信号和某些趋化因子相关的基因(Willinger等人，2005年;Chtanova等人，2001年;Klebanoff等人，2005年). 识别记忆CD8 T细胞亚群中这些差异表达基因为记忆CD8 T细胞功能提供了转录基础。然而，在记忆T细胞中建立和维持这种差异基因表达的机制目前尚不清楚。

常染色质状态促进基因表达，而异染色质状态与基因沉默相关(Li等人，2007年). 越来越多的证据表明，组蛋白N末端尾部的共价修饰，如乙酰化、甲基化和磷酸化，可以调节染色质状态(库扎里德斯，2007年;伯杰，2007). 在不同的组蛋白修饰中，组蛋白乙酰化，如组蛋白3赖氨酸9（H3K9ac）和H3K14ac的乙酰化通常与常染色质和活性基因转录有关(Roh等人，2006年;Wang等人，2008)组蛋白甲基化与染色质状态的关系更为复杂(Barski等人，2007年;Guenther等人，2007年). 组蛋白H3赖氨酸4、36和79（H3K4、H3K36和H3K79）的甲基化与常染色质有关，而H3K9、H3K27和H4K20的甲基化则与异染色质和基因沉默有关(Barski等人，2007年;Guenther等人，2007年). 组蛋白尾部残基的甲基化有三种形式，对应于单甲基、二甲基和三甲基的添加，每种形式的甲基化在染色质状态的形成中可能有不同的结果(Klose和Zhang，2007年;Barski等人，2007年).

细胞因子基因中发现组蛋白高乙酰化(Il4、Il7r，和Ifng）在Th1和Th2 CD4 T细胞中(Yamashita等人，2004年;Fields等人，2002年)CD8 T细胞亚群(诺斯罗普等人，2006年;Chandele等人，2008年). 此外，在记忆CD8 T细胞的许多差异表达基因的位点中发现了超乙酰化(Fann等人，2006年)尤其是细胞因子和效应基因(诺斯罗普等人，2008年;Araki等人，2008年). 更重要的是，在这些基因位点中诱导的高乙酰化或低乙酰化导致CD8 T细胞中基因表达的增加或减少。总之，这些发现表明组蛋白乙酰化调节差异基因表达，从而调节记忆CD8 T细胞的功能。与组蛋白乙酰化相比，在相同的细胞因子基因位点中发现了有限数量组蛋白尾部残基的甲基化(Il4号机组和Ifng）在CD8 T细胞中(Makar等人，2003年;Shnyreva等人，2004年). 然而，组蛋白甲基化在从幼稚到记忆CD8 T细胞分化过程中调节差异基因表达的作用以前还没有被研究过。

为了探讨组蛋白甲基化与记忆性CD8 T细胞差异基因表达和功能之间是否存在关联，我们对组蛋白甲基化作了一项全局分析，同时对原始和记忆性CD8T细胞亚群进行了全基因组基因表达谱分析。我们发现了基因表达水平与组蛋白甲基化分布之间的一般关系，即基因表达与CD8 T细胞亚群中H3K4me3水平呈正相关，与H3K27me3水平呈负相关。此外，我们确定了记忆CD8 T细胞中基因表达和组蛋白甲基化之间的四种不同形式的关系：抑制型、活性型、平衡型和二价型。这些不同的关联模式为研究记忆CD8 T细胞中基因表达和功能的复杂调控提供了新的见解。最后，我们证明了活性表达的基因和允许染色质可以与不同的组蛋白修饰（H3K4me3和H3K9ac）有关，并且H3K9ac水平的降低与记忆细胞中mRNA水平的降低有关。

结果

组蛋白甲基化（H3K4me3和H3K27me3）与幼稚和记忆（T厘米和T相对长度单位)CD8 T细胞

为了确定整体组蛋白甲基化状态及其与CD8 T细胞分化中基因表达的关系，我们分离了原始和记忆性CD8 T淋巴细胞亚群（T厘米和T相对长度单位)通过细胞分选从健康成人外周血中提取，并通过ChIP-Seq分析H3K4me3和H3K27me3的全基因组分布，以及通过安捷伦人类全基因组芯片分析这些CD8 T细胞亚群的全球基因表达谱(图1). 我们通过微球菌核酸酶（MNase）消化产生了主要含单核小体的天然染色质，并使用抗H3K4me3和抗H3K27me3抗体进行了ChIP分析。如前所述，使用Illumina-Selexa 1G基因组分析仪对ChIP DNA片段进行测序(Barski等人，2007年;Wang等人，2008). 总共产生了约2800万个序列标签（每个CD8亚群的约300万个H3K4me3标签和约600万个H3G27me3标签）用于天真和记忆（T厘米和T相对长度单位)细胞并映射到人类基因组。同时，测定了静止时和用抗CD3加抗CD28抗体（抗CD3/CD28）激活16小时后相同亚群CD8 T细胞的整体基因表达谱。通过ANOVA（FDR≤0.01）、强度变化（≥2倍）和最小表达强度（≥1.5）（完整数据集可在NCBI基因表达总览中找到，登录号为GSE14422标准). 我们通过定量PCR和RT-PCR证实了H3K4me3或H3K27me3水平与mRNA之间的相关性。

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ChIP-Seq组蛋白甲基化全基因组平行分析方案和CD8 T细胞亚群微阵列基因表达

通过细胞分选分离出天真和记忆性CD8 T细胞亚群。对两名个体进行了H3K4me3和H3K27me3的ChIP-seq实验，随后在另外三名个体中进行了PCR验证。微阵列基因表达分析使用来自3个池中9个个体的RNA，随后用RT-PCR对另外3个个体进行确认。

为了评估H3K4me3-和H3K27me3-相关染色质状态与基因表达的关系，我们通过量化基因体（定义为转录起始点上游1kb）中H3K4me3和H3K27me3的水平来分析16314个注释基因基因末端除以序列标签总数）和mRNA水平（完整数据集可在NCBI基因表达总览中找到，登录号为GSE12616标准). H3K4me3水平与幼稚和记忆中的mRNA水平普遍呈正相关（T厘米和T相对长度单位)CD8 T细胞(图2A). 记忆单元（T厘米和T相对长度单位)回归系数值较高（R2=0.870（两个T）厘米和T相对长度单位)比原始细胞（R2=0.511). 此外，记忆细胞（T厘米和T相对长度单位)具有更多H3K4me3水平较高的基因（>2×10−5每个基因位点的标签）比原始细胞：T相对长度单位, 4878 (30%); T型厘米, 3290 (20%); 和天真，2064（13%）(图2C). 相反，H3K27me3的水平与相应基因的mRNA水平普遍呈负相关(图2B). 与H3K4me3类似，内存（T厘米和T相对长度单位)细胞也有较高的回归系数值（T厘米：R2=0.834和T相对长度单位：R2=0.806）高于幼稚细胞（R2=0.697). 然而，与H3K4me3不同，高水平H3K27me3（>1×10−5幼稚和记忆细胞亚群中每个基因位点的标签：T相对长度单位, 1662 (10%); T型厘米, 1058 (8.1%); 和幼稚，1372（8.4%）（>1×10−5每个基因位点的标签）(图2C). 这些发现显示了组蛋白修饰水平与从幼稚到记忆CD8 T细胞亚群的基因表达水平之间的一般相关性。

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CD8 T细胞亚群中基因表达与组蛋白甲基化的整体相关性

（A） 基因表达水平与静止时幼稚和记忆CD8 T细胞亚群中H3K4me3水平呈正相关。

（B） 基因表达水平与静止时幼稚和记忆CD8 T细胞亚群中H3K27me3的水平呈负相关。图中的每个点（A和B）代表100个基因的平均值，这些基因是根据mRNA水平从最高到最低的等级进行分组的。

（C） 显示了幼稚和记忆CD8 T细胞亚群中高水平H3K4me3或H3K27me3的基因数量。

幼稚和记忆CD8 T细胞中高水平H3K27me3的基因组区域

H3K27me3主要由多梳抑制复合物2（PRC2）催化，并与基因沉默相关(曹等人，2002;舒伯特等人，2006年). 当我们扫描每个CD8 T细胞亚群中大规模H3K27me3富集区的基因组时，我们发现在原始或记忆性CD8 T淋巴细胞亚群中有几个区域不同程度地富集了H3K26me3(表S1). 确定了10个基因组区域，大小从0.2到1 Mb，幼稚细胞中H3K27me3水平高于记忆亚群(表S1，其中三个显示在中图3A). 每个区域都包含多个与细胞信号相关的功能基因(RALGPS1和GARNL3)，转录(邮政编码2,聚乙二醇3,齐姆3,DUXA公司,和ZNF264)，新陈代谢(USP29和B3GALT5)，运输(SLC2A8系列)，电池连接(IGSF5型)和细胞粘附(DSCAM公司). 染色体9q上的一个代表性H3K27me3结构域在幼稚细胞中的H3K27me3水平始终高于记忆细胞，尤其是在T细胞中相对长度单位(图3B). 同时，我们还在记忆性CD8 T细胞中鉴定了10个具有高水平H3K27me3的基因组结构域（区域跨度为0.2–0.45 Mb）(表S1)三个域的详细信息如所示图3C这些区域有多个基因，包括与I型干扰素有关的基因(国际食品标准化协会13,国际食品标准化协会2,国际单项体育联合会8,国际财务报告准则第1号、和干扰素1)，凋亡(BCL2L14型)，细胞粘附(C21或f29)，信号(轻轨6号线)，运输(TRPM2号机组)和细胞骨架(KRTAP10-1、2、3、4、5、6、，和7). 人类I型干扰素染色体9p上的基因簇标记为T中高水平的H3K27me3相对长度单位单元格(图3D). 考虑到干扰素在免疫功能中的作用，了解这些聚集的高水平H3K27me3在幼稚和记忆CD8 T细胞功能调节中的作用是非常有趣的。

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幼稚和记忆CD8 T细胞中的H3K27me3结构域

（A） 在原始CD8 T细胞中富集H3K27me3区域。显示了染色体位置、驻留基因位点及其转录方向（实验程序中讨论了选择的扫描方法）。

（B） 在原始CD8 T细胞中有一个代表性的H3K27me3岛。

（C） 记忆CD8（T）中富集的H3K27me3区域相对长度单位)T细胞。显示了染色体位置、驻留基因位点及其转录方向。

（D） CD8 T中一个具有代表性的H3K27me3岛相对长度单位细胞。

记忆CD8 T细胞组蛋白甲基化和基因表达之间四种不同的关系模式

基因表达分析发现记忆性CD8 T细胞与原始性CD8细胞相比有三种不同的基因表达模式：1）抑制基因（静息性记忆细胞的mRNA水平显著低于静息性原始细胞），2）活性基因（静坐性记忆细胞中的mRNA含量显著高于原始性细胞），和3）稳定基因（静息记忆和幼稚CD8 T细胞之间没有显著差异，但在激活的记忆细胞中比在激活的幼稚细胞中显著诱导）。为了进一步表征组蛋白修饰和基因表达之间的关系，我们确定了记忆CD8 T细胞（无论是T细胞还是T细胞）中基因表达与组蛋白甲基化（H3K4me3和H3K27me3）的四种不同关联模式厘米或T相对长度单位或两者）与相应的原始CD8 T细胞相比：1）抑制基因与静息记忆CD8 T淋巴细胞相应位点的H3K4me3低水平和H3K27me3高水平相关；2） 活性基因与静息记忆CD8 T细胞相应位点相对较高水平的H3K4me3相关，但H3K27me3水平较低；3） 突变基因的H3K4me3和H3K27me3模式与静息记忆CD8 T细胞中的活性基因相似；和4）双价基因与静息记忆CD8 T细胞中高水平的H3K4me3和H3K27me3相关。

抑制基因

271个基因在原始CD8 T细胞中高度表达，但在记忆中显著降低（T厘米和/或T相对长度单位)CD8 T细胞。在这些基因中，105个在两个T厘米和T相对长度单位（记忆共同抑制基因），150个在T厘米只有16人在T区受到抑制相对长度单位独自一人。这些基因的功能多种多样，从细胞粘附到信号传递到转录(表S2). 与受抑制的mRNA表达状态类似，记忆亚群中相应的H3K4me3水平显著低于原始CD8 T细胞(图4A). 两个代表性的抑制基因，SH3结构域结合谷氨酸丰富蛋白样2(SH3BGRL2型)和突触结合蛋白III(SYT3型)，进行了详细分析(图4B).SH3BGRL2型参与氧化还原依赖过程的控制，并与PKCθ相互作用，从而抑制c-Jun、AP-1和NF-κB(Mazzocco等人，2002年).SYT3型对CXCR4循环至关重要，并在T细胞迁移中发挥作用(Masztalerz等人，2007年). 它们的差异表达模式表明，它们可能参与幼稚和记忆性CD8 T细胞的分化和/或维持。

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记忆CD8 T细胞亚群中的抑制、活性和平衡基因

（A） 幼稚和记忆CD8 T细胞亚群中抑制基因位点中H3K4me3水平的比较。比较记忆CD8 T细胞亚群和原始CD8 T淋巴细胞中105个常见抑制基因的平均H3K4me3。

（B） 两种具有代表性的常见抑制基因(SH3BGRL2型,SYT3型)介绍了记忆中的CD8 T细胞，指出了它们的基因位点、静息状态下CD8 T淋巴细胞中H3K4me3和H3K27me3的水平，以及静息状态和16小时抗CD3/28刺激后幼稚和记忆中CD8 T亚群中mRNA的表达（完整的基因列表可在表S2).

（C） 幼稚和记忆CD8 T细胞亚群活性基因位点中H3K4me3水平的比较。比较记忆CD8 T细胞亚群和原始CD8 T淋巴细胞中150个共享活性基因的平均H3K4me3。

（D） 两个具有代表性的共享活性基因(PRDM1、KLRG1)介绍了记忆中的CD8 T细胞，指出了它们的基因位点、静息状态下CD8 T淋巴细胞中H3K4me3和H3K27me3的水平，以及静息状态和16小时抗CD3/28刺激后幼稚和记忆中CD8 T亚群中mRNA的表达（完整的基因列表可在表S3).

（E） 幼稚和记忆CD8 T细胞亚群中平衡基因位点中H3K4me3水平的比较。幼稚和T之间平衡基因位点的平均H3K4me3厘米（N=46）或介于天真和T之间相对长度单位（N＝6）。

（F） 两个具有代表性的平衡基因(ID2、PLAGL1)在CD8 T中厘米或T相对长度单位分别给出了它们的基因位点、静息期CD8 T细胞中H3K4me3和H3K27me3的水平，以及静息期和16小时抗CD3/28刺激后幼稚和记忆期CD8细胞亚群中mRNA的表达（完整的基因列表可在表S4). P值由所有数字中使用的星号表示（*P<0.01，**P<0.05）。

活性基因

共鉴定出434个基因。在这些基因中，150个在T厘米和T相对长度单位（记忆共同激活基因），55个在T中激活厘米只有229个在T中有效相对长度单位独自一人。这些在记忆CD8 T细胞中高表达的基因也显示出不同的功能，其中许多与记忆CD8 T细胞功能有关(表S3). 与它们的差异表达基本一致，记忆性CD8 T细胞亚群中活性基因位点中的H3K4me3水平显著高于原始CD8 T淋巴细胞(图4C). 我们选择了6个有代表性的活性基因进行进一步研究(图4D和图S1). PR域包含1，带有ZNF域(PRDM1型，也作为蓝色IMP1)是一种记忆共同活性基因，已被证明在CD8 T细胞的分化中起重要作用(Martins等人，2006年). 杀伤细胞凝集素样受体亚家族G，成员1(KLRG1号机组)是另一个记忆共同活性基因，在效应器和记忆CD8 T细胞中表达，最近被证明是区分短期效应细胞和长期记忆前体效应细胞的标记(Beyersdorf等人，2001年;Joshi等人，2007年) (图4D). 趋化因子（C-C基序）受体4(CCR4型)，T中的一个活性基因厘米是CCL17和CCL22的受体，在T细胞归巢到皮肤和T细胞迁移到炎症组织中发挥作用(Sallusto等人，2000年). 颗粒酶A(GZMA公司)和穿孔素1(PRF1项目)，T中的活性基因相对长度单位，与颗粒酶B一起在CD8 T细胞介导的细胞毒性中起核心作用(GZMB公司) (罗素和莱伊，2002年;Voskoboinik等人，2006年). 始中胚层蛋白同源物(EOMES公司)，T中的一个活性基因相对长度单位对记忆CD8 T细胞的效应器功能至关重要(Pearce等人，2003年) (图S1). 我们的分析表明，这些在记忆CD8 T细胞亚群（T厘米和/或T相对长度单位)与这些记忆细胞的功能密切相关，从而为记忆CD8 T细胞提供特征基因。

泊松基因

共鉴定出52个基因(表S4). 在这些基因中，有46个在T厘米仅6个在T中表达相对长度单位在两种T细胞中均未发现表达厘米和T相对长度单位我们发现这些稳定基因位点中的H3K4me3水平在T厘米或T相对长度单位比原始CD8 T细胞(图4E). 我们分析了四个有代表性的平衡基因以获得更多细节(图4F和图S2). DNA结合抑制剂2，显性负螺旋环螺旋蛋白(标识2)，T中的一个稳定基因厘米，调节影响CD8 T细胞存活和效应器反应大小的基因(Cannarile等人，2006年). 丛状腺瘤基因样1(广场1)，T中的一个稳定基因相对长度单位，诱导凋亡细胞死亡和细胞周期G1阻滞(Varrault等人，1998年) (图4F). 类Src适配器(服务水平协议)参与胸腺细胞发育过程中的TCR信号(Myers等人，2005年)和核因子、白细胞介素3调节(NFIL3)是Ca2+在细胞生存信号传递中起关键作用的调节基因(西村和田中，2001年). 两者都是服务水平协议和NFIL3T中有稳定的基因厘米(图S2). 因此，这些T厘米平衡基因(ID2、SLA和NFIL3)可以促进记忆细胞从静息状态到激活状态的快速转变。

二价基因

研究表明，具有二价组蛋白修饰的基因在胚胎干细胞发育中起着重要作用(Bernstein等人，2006年). 在此，我们确定了25个二价基因，其基因座中H3K4me3和H3K27me3均高水平，这些基因在静息记忆CD8 T细胞中不表达，但在激活（定义为1）后显著诱导，激活后的记忆细胞中的mRNA水平比静息记忆细胞增加了至少2倍，2）激活记忆中的mRNA水平比激活初学者增加至少2倍，且FDR<0.01）。在这些基因中，在两个T厘米和T相对长度单位; 在T中有9个是二价的厘米独自一人；在T中有13个是二价的相对长度单位独自一人(表S5). 这些二价基因在记忆CD8 T细胞中的功能并不局限于发育调节(图5A). 然而，与干细胞一样，记忆T细胞也具有自我更新和进一步分化的能力。KIAA1804混合谱系激酶4(MLK4（MLK4）)，MAPK激酶激酶的成员(MAPKKs公司)控制细胞凋亡(加洛和约翰逊，2002年)和莫霍克同源盒(MKX公司)在两个T中都是二价基因厘米和T相对长度单位(图5B和图S3)而缝隙连接蛋白β7(GJB7型，也称为连接蛋白25)是T中的一个二价基因相对长度单位(图S3). 为了确定激活后mRNA水平的增加是否与H3K4me3水平的增加相关，我们检测了记忆CD8 T细胞中mRNA和H3K4me3的水平，发现其与激活后的mRNA水平增加平行MLK4（MLK4）信使核糖核酸和H3K4me3在MLK4（MLK4）两个T的轨迹厘米和T相对长度单位(图5C). 这一发现证实了激活后从二价状态转换为开放染色质与表达增加有关。

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记忆CD8 T细胞亚群中含有双价染色质的基因

（A） T二价染色质基因厘米和/或T相对长度单位CD8 T细胞按细胞功能分类（结果和方法中描述了双价基因的标准表S5).

（B） 一个具有代表性的常见二价基因(百万美元4)显示了其基因座以及在幼稚和记忆性CD8 T细胞亚群中静息时H3K4me3和H3K27me3的水平。

（C） H3K4me3水平和mRNA表达的变化MLK4（MLK4）CD8 T中抗CD3/28刺激后0和72小时的基因厘米和T相对长度单位如图所示。平均值和SEM来自5名独立捐赠者。

H3K4me3水平与T细胞间差异基因表达的相关性厘米和T相对长度单位

T之间的功能差异厘米和T相对长度单位已有报道，但其功能差异的分子基础尚不完全清楚。我们假设差异表达的基因解释了它们的功能差异，并且这些基因位点中的组蛋白甲基化不同是导致它们差异表达的原因。我们已经鉴定了137个在T细胞中差异表达的基因厘米和T相对长度单位（71在T中高度表达厘米和66英寸T相对长度单位，详见实验程序）。这些基因的功能总结如下图6A（完整的基因列表可以在表S6). 与全基因组基因分析一致(图2)比较mRNA水平（T厘米/T型相对长度单位)和H3K4me3水平（T中H3K4me3标签的数量厘米/T中H3K4me3标签的数量相对长度单位)在这些差异表达的基因中，显示出正相关（n=137，R2=0.39）在基因表达水平和H3K4me3水平之间(图6B). 这表明H3K4me3可能在记忆CD8 T细胞亚群的差异基因表达中起重要作用。然而，并不是所有差异表达的基因都表现出mRNA和H4K3me3之间的这种相关性。

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差异表达基因与CD8T组蛋白甲基化相关厘米和T相对长度单位

（A） T细胞的差异基因表达谱厘米和T相对长度单位安捷伦人类全基因组芯片分析。T组差异的选定基因厘米和T相对长度单位由>3倍显示（完整的基因列表可以在表S6).

（B） 差异基因表达与T细胞中H3K4me3水平呈正相关厘米和T相对长度单位T厘米和T相对长度单位按照上述和实验程序选择。T厘米和T相对长度单位与T厘米和T相对长度单位在它们相应的基因中（N=137，R2=0.39). 日志10图中使用了值。

H3K9ac和H3K4me3在活性转录基因中的相对贡献

虽然允许的染色质相关组蛋白修饰，如H3K4me3和H3K9ac，通常在同一位置发现，并且似乎协同作用(Wang等人，2008)目前尚不清楚不同的修饰是否在不同的基因位点中发挥不同的作用。我们对H3K4me3和mRNA谱的分析表明，一些基因的H3K4me3水平较低，但mRNA水平较高。例如，肿瘤坏死因子受体超家族，成员9(TNFRSF9或4-1BB)是CD8 T细胞活化的重要共刺激受体(Shuford等人，1997年).TNFRSF9公司在记忆CD8 T细胞中，H3K4me3在其基因位点高表达，但水平较低。为了确定其他活性组蛋白修饰是否有助于mRNA水平的测定，我们分析了该基因座中的H3K9ac，发现记忆细胞亚群中H3K9 ac的水平显著高于原始细胞，而亚群中的H3 K4 me3水平没有差异(图7A). 这一发现表明H3K9ac而非H3K4me3与TNFRSF9公司然而，大多数活跃表达的基因在其基因座中都有高水平的H3K4me3和H3K9ac。例如，向淋巴细胞活化分子家族成员1发送信号(SLAMF1（SLAMF1）亦称为SLAM公司)是一种活化T细胞和树突状细胞的自抗原受体，在其位点H3K4me3和H3K9ac均高水平的记忆细胞中高度表达(图7B).

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HAT抑制剂调节记忆CD8 T细胞的染色质结构和基因转录

（A） 高水平的基因表达与H3K4me3无关，但与H3K 9ac相关TNFRSF9公司记忆基因CD8 T细胞亚群。

（B） 高水平基因表达与H3K4me3和H3K9ac在SLAMF1（SLAMF1）记忆基因CD8 T细胞亚群。

（C） mRNA水平的完全降低仅与H3K9ac水平的降低有关TNFRSF9公司记忆CD8 T细胞亚群中姜黄素治疗的基因。mRNA水平的部分降低与H3K9ac水平的降低相关，但与SLAMF1（SLAMF1）姜黄素治疗记忆性CD8 T细胞亚群的基因。这个行动委员会基因显示为阴性对照。平均值和SEM来自4名独立捐赠者。

为了进一步确定较高水平的H3K9ac在这两个基因表达中的作用，我们用姜黄素（一种组蛋白乙酰转移酶（HAT）抑制剂，抑制p300/CBP）处理记忆CD8 T细胞亚群(Balasubramanyam等人，2004年;Araki等人，2008年). 预计姜黄素会降低这两个基因座中H3K9ac的水平，但对T细胞中H3K 4me3的水平没有明显影响厘米和T相对长度单位在我们测试的条件下(图7C). mRNA、H3K9ac和H3K4me3水平行动委员会姜黄素处理后基因没有改变。同时TNFRSF9公司和SLAMF1（SLAMF1）姜黄素处理的细胞中表达量显著降低。然而TNFRSF9公司mRNA水平（~7倍）高于SLAMF1（SLAMF1）（约2倍）。总之，这些结果表明H3K9ac和H3K4me3都有助于基因表达，但相对重要性可能因基因而异。

讨论

染色质与基因表达的四种不同关系对记忆CD8 T细胞功能的控制

幼稚CD8 T细胞向记忆（T）分化过程中特定基因的基本转录变化（激活或抑制）厘米和T相对长度单位)抗原刺激后的CD8 T细胞已开始鉴定(Kaech等人，2002年;Willinger等人，2005年;Chtanova等人，2001年;Klebanoff等人，2005年)然而，基因表达变化与染色质状态之间的全基因组关系尚未得到解决。这里的发现揭示了组蛋白甲基化介导的染色质基础在记忆中的差异基因表达（T厘米和T相对长度单位)CD8 T细胞，为组蛋白甲基化在记忆CD8 T淋巴细胞分化和功能中的作用提供了新的见解。这些发现至少在两个方面具有重要意义。

首先，他们证明了染色质水平的转录控制是严格调控的，并且专门针对记忆CD8 T细胞（T厘米或T相对长度单位或两者兼而有之）。例如，编码信号分子的基因(ID2、SLA、，和NFIL3)在静息T中以类似水平表达厘米和幼稚的CD8 T细胞，但T厘米具有允许的染色质状态（平衡），而幼稚细胞在这些基因位点具有抑制性染色质状态。抗原刺激后，T厘米更快地转录ID2、SLA和NFIL3用于增强信号(Williams和Bevan，2007年)而不是天真的细胞。因此，记忆CD8 T细胞（T厘米)只有在激活后，不需要的激活信号才被严格控制在静止状态。此外，双价染色质状态为基因表达的快速增加提供了另一层灵活性。MLK4（MLK4）和MKX公司可以提供增强的信号，促进记忆CD8 T细胞基因转录从静止状态快速过渡到激活状态。

其次，本文的发现也提供了直接证据，证明记忆CD8 T细胞中的差异基因表达与组蛋白修饰的表观遗传变化有关。这些表观遗传变化是在原始细胞分化为记忆CD8 T细胞的过程中获得的，并促进了对记忆CD8 T-细胞功能至关重要的转录程序。因此，组蛋白修饰可能为快速而有力地诱导效应功能和延长记忆CD8 T细胞的寿命提供染色质基础。需要进一步研究，以直接测试组蛋白修饰在调节记忆CD8 T细胞差异基因表达和功能中的作用。

基因位点特异性组蛋白修饰

组蛋白修饰的复杂性表明，组蛋白N末端尾部不同残基上的不同类型修饰可能在基因表达调控中发挥不同的作用(斯特拉尔和艾利斯，2000年). 在过去的几十年里，许多组蛋白修饰被鉴定出来，并且它们与允许染色质或异染色质之间的联系也越来越清楚(库扎里德斯，2007年). 以前使用CD4 T细胞的研究表明，某些组蛋白修饰（例如H3K9ac、H3K4me3等）与允许的染色质以及其他修饰（例如，H3K27me3和H3K9 me3）与异染色质之间存在普遍关联(Roh等人，2005年;Barski等人，2007年). 此外，H3K4me3可能在转录启动下游或再启动期间发挥作用(Sims，III等人，2007年). 最近，一项对CD4 T细胞基因组中39种不同组蛋白修饰的分析表明，许多修饰可能协同作用以制备用于转录调控的染色质(Wang等人，2008). 然而，目前尚不清楚维持活性转录需要多少活性修饰，以及不同类型的修饰是否可以互换以维持开放染色质状态。此外，还未确定H3K9ac是否在活性转录之前或期间起标记作用，而H3K4me3是否起到记忆过去转录的作用。

这里的研究结果表明，一些活性转录基因与高水平的H3K4me3无关，而是与其基因启动子中的高水平H3K9ac相关，这表明不同的组蛋白修饰可以独立地建立基因位点的允许染色质状态。此外，降低H3K9ac水平会导致记忆细胞中差异高表达基因的下调。不同程度的减少TNFRSF9公司和SLAMF1（SLAMF1）mRNA水平表明H3K4me3和H3K9ac均参与基因表达的调控。然而，它们在基因表达调控中的相对重要性可能取决于它们在特定基因位点中的水平。因此，了解这些不同的修饰是如何在特定基因位点中建立和维持的，以及建立基因位点的开放染色质状态所需的不同组蛋白修饰的最小数量或组合是非常有意义的。

总之，我们已经证明了幼稚和记忆CD8 T细胞（T厘米和T相对长度单位)在基因组范围内。基于H3K4me3、H3K27me3和mRNA的相对水平，我们确定了四种不同的关系（抑制、活性、平衡和二价）。这些不同的联系为基因表达的差异调节提供了一种手段，并解释了快速而强大的记忆T细胞反应是如何在转录水平上进行控制的。记忆性T细胞亚群的扩展分析进一步证实组蛋白甲基化差异是T细胞间差异基因表达和功能的潜在染色质基础厘米和T相对长度单位细胞。最后，我们证明了活性基因转录相关的开放染色质可以通过不同的组蛋白修饰实现，如H3K4me3或H3K9ac，并且它们的相对重要性可能是基因特异性的。总之，这些发现表明组蛋白甲基化可能是调节基因表达和记忆CD8 T细胞功能的染色质基础。进一步的研究无疑将为记忆性T细胞独特特征的机制提供新的线索，并为评估记忆反应和提高疫苗效率提供新的途径。

实验程序

抗体和试剂

本研究中使用的抗体如下：荧光素异硫氰酸盐（FITC）结合的抗CD45RA和藻红蛋白（PE）结合的抗CD62L购自eBioscience（加州圣地亚哥）；来自Invitrogen的三色（TC）共轭抗CD8（Carlsbad，CA）；抗istone H3（三甲基K4，ab8580）、抗组蛋白H3（三甲基K27，ab6002）和抗组蛋白H1（乙酰基K9，ab4441）来自Abcam（马萨诸塞州剑桥）；来自Upstate Biotech（马萨诸塞州Billerica）的纯化兔IgG。微球菌核酸酶（MNase）购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。

幼稚、中央记忆和效应记忆CD8 T细胞的分离和刺激

通过NIA临床核心设施（IRB-批准的方案MRI2003-054）从健康成人获取外周血。先前描述了分离和刺激幼稚和记忆CD8 T细胞的程序(Fann等人，2006年). 简言之，外周血单个核细胞（PBMC）通过Ficoll（伊利诺伊州芝加哥GE Healthcare）梯度离心分离。然后，通过与一组抗CD4、CD19、CD11b、CD14、CD16、MHC II类、红细胞、血小板和CD45RO（用于富集原始细胞）或CD45RA（用于富集记忆细胞）的小鼠单克隆抗体孵育，通过去除其他类型的细胞来富集原始和记忆CD8 T细胞。随后，通过用抗鼠IgG结合磁珠（加利福尼亚州巴伦西亚的齐亚根）孵育去除抗体结合细胞。这些富含天真和记忆的CD8 T细胞进一步纯化为CD8+CD45RA+CD62L型+原始T细胞，CD8+CD45RA−CD62L型+T型厘米和CD8+CD45RA−CD62L型−T型相对长度单位通过细胞分选机（MoFlo；Dako Cytomation，Carpentaria，CA）。排序幼稚，T厘米和T相对长度单位CD8 T细胞纯度超过98%，可以立即使用，也可以在含有10%胎牛血清和青霉素（10 U/ml）/链霉素（10μg/ml）（Invitrogen）的RPMI-1640中，以1:1的细胞-珠比，用抗CD3/CD28耦合磁珠（Invit罗gen）孵育16小时。新鲜分离和刺激的细胞用于ChIP-Seq和基因表达微阵列分析。

更改IP序列

ChIP-Seq的程序如前所述(Barski等人，2007年). 简言之，2×107新分类的幼稚，T厘米和T相对长度单位CD8细胞在37°C水浴中用MNase（2个单位）消化10分钟，以生成主要由单核小体组成的天然染色质模板。然后将天然染色质模板与抗组蛋白H3K4me3或H3K27me3抗体孵育，并提取抗体结合的DNA片段。在通过实时PCR用已知基因确认免疫沉淀的特异性后，根据制造商手册（Illumina/Selexa，San Diego，CA）修改DNA片段以构建测序文库，并进行最终的18周期PCR扩增。从2%琼脂糖凝胶中选择性回收约200bp的DNA片段（单核小体DNA+接头），用于进一步的簇生成和使用Solexa/Illumina 1G基因组分析仪测序。按照Illumina分析管道将测序标签导出并映射到人类基因组。然后使用UCSC基因组浏览器通过将分析管道的输出转换为浏览器可扩展数据（BED）文件来显示数据。

ChIP-seq数据分析

使用“岛”法分离信号和噪声，并考虑到不同文库的标签数量不等，确定了大规模H3K27me3富集基因组区域。该方法识别出H3K27me3富集信号的显著聚集，这些信号不太可能偶然出现。简单地说，首先确定了所有符合条件的50kb摘要窗口。合格窗口定义为满足基于泊松背景模型的所需富集p值0.2。连续的合格窗口合并形成一个孤岛，在随机背景模型下根据其概率进行评分。重要孤岛的得分阈值由背景模型中此类孤岛的预期数量为1的要求确定。如果H3K27me3域与其他细胞类型中的域不重叠，则该域是特定于细胞类型的。我们进一步选择了细胞特异性富集区，标准是幼稚和记忆（T厘米和/或T相对长度单位)应大于1.4倍。

通过以下程序计算基因位点中的标签。标签被放入200 bp的非重叠窗口中。为了滤除噪声，只选择标签号高于阈值的窗户进行进一步分析。阈值由p值10决定−3基于泊松背景模型。基因位点的标准化序列标签数是通过转录起始位点上游1 kb到基因末端的选定窗口中的标签数除以整个基因组的序列标签总数来计算的。比较幼稚和记忆的标签比率（T厘米和T相对长度单位)CD8 T细胞。一般来说，幼稚和记忆（T厘米和T相对长度单位)细胞被用来定义被抑制、活跃或稳定的基因。对于双价基因，每个基因体上H3K4me3的标准化标记数≥5×10−6且H3K27me3≥2×10−6。

DNA微阵列实验

DNA微阵列分析的程序之前已经描述过(Fann等人，2005年). 从新鲜分离和刺激（16小时）的幼稚T细胞中提取总RNA厘米和T相对长度单位来自9个不同健康成人供体的CD8 T细胞形成3个RNA池。总RNA的质量和数量由安捷伦生物分析仪（安捷伦科技，加利福尼亚州帕洛阿尔托）进行分析。在微阵列实验中使用了三个RNA池。我们根据制造商的程序，使用安捷伦全人类基因组44K寡核苷酸芯片（安捷伦科技）进行基因表达分析。使用总RNA（400 ng）通过一轮扩增制作探针，然后在0.3 mM菁3-CTP（Cy3）存在下合成cRNA。同时，花青5-CTP（Cy5）被用于标记通用人类参考RNA（Stratagene，La Jolla，CA）。通过NanoDrop（安捷伦科技公司）测量扩增的cRNA的量，并将750 ng Cy3标记的cRNA和750 ng Cy5标记的参考cRNA在60°C下与基因芯片在500μl的杂交溶液中混合17小时。经过标准清洗步骤后，用氮气对载玻片进行空气干燥，并用安捷伦微阵列扫描仪进行扫描。输出文件由每个基因芯片使用特征提取软件（安捷伦科技公司）处理的40943个靶点（约16314个带注释的基因，具有定义的基因组位置）的Cy3和Cy5荧光通道的信号强度组成。对每个原始细胞进行三个独立的微阵列实验厘米和T相对长度单位刺激前后。对日志转换数据进行改进的方差分析，并使用基于网络的分析软件（NIA阵列分析，http://lgsun.grc.nia.nih.gov/ANOVA/).

符合三个标准（1）FDR小于0.01，（2）强度差异大于2，以及（3）高表达基因强度大于1.5）的基因被定义为差异表达。记忆细胞抑制基因的标准是：1）静息期原始细胞（N0）与静息期记忆细胞（M0）的表达强度差异≥2倍，2）FDR≤0.01，3）N0中基因的表达强度≥1.5。记忆细胞活性基因的标准是：1）M0在N0上的表达强度差异≥2倍，2）FDR≤0.01，3）M0中的基因表达强度≥1.5。记忆细胞平衡基因的标准是：1）N0和M0之间的表达强度差异在±1.5倍以内，2）激活记忆细胞（MS）与激活原始细胞（NS）的表达强度差≥2倍，3）FDR≤0.01，4）该基因在MS中的表达强度≥1.5。

实时定量RT-PCR

如前所述，该程序是标准的(Fann等人，2006年). 简而言之，通过Stat 60（Tel-Test，Friendswood，TX）从12名正常供体的新鲜和刺激的幼稚和记忆CD8 T细胞中提取总RNA，形成四个混合RNA。总RNA的数量通过NanoDrop（安捷伦科技公司）测量使用500 ng总RNA通过逆转录酶（SuperScript II，Invitrogen）合成cDNA。在ABI Prism 7400（Applied Biosystems）上使用SyBr Green试剂盒（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）在20μl总体积中使用0.4μM引物进行40个周期的PCR。通过琼脂糖（1.5%）凝胶电泳证实了RT-PCR产物的特异性扩增。PCR引物是使用Primer Express软件（Applied Biosystems）设计的，由Integrated DNA Technologies（IA Coraville）制造。用于确认的基因的引物序列可以在表S7。

姜黄素对记忆性CD8 T细胞的治疗作用

将HAT抑制剂姜黄素（Sigma）溶解在10 mM的乙醇中。在有或无20μM姜黄素的情况下培养记忆CD8 T细胞2小时，然后用抗CD3/28抗体刺激6小时(Araki等人，2008年). 然后采集细胞进行mRNA分析和常规ChIP分析。

统计分析

双尾Student t检验用于mRNA和组蛋白甲基化水平的分析。显著性定义为P值≤0.05。

补充材料

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致谢

我们感谢Richard Hodes和Mike Pazin博士对手稿的批评性阅读。我们感谢流式细胞仪部门的Francis J.Christ和Cuong Nguyen进行细胞分类，感谢Alexei Sharov帮助微阵列分析，感谢NIA单采单位的Karen Madara和Sandy Alcorta收集血液样本。这项研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）国家老龄研究所和国家心脏、肺和血液研究所的校内研究项目的支持。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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