美满霉素金属蛋白酶的催化结构域^*

摘要

金属蛋白酶

肽键的断裂对生命至关重要，而导致肽断裂的因素无处不在。其中包括议员，2它们大多是锌依赖的肽键水解酶。它们通过广泛和非特异性蛋白质降解以及特定肽键的受控水解参与新陈代谢(1). 对如此巨大的降解潜力的放松管制会导致疾病，此外，MP也可能在中毒和微生物感染期间充当毒力因子。如此广泛的生物功能使得对这些蛋白质的结构研究对于理解其功能以及设计新型、高度特异的治疗药物来调节其活性都是不可或缺的(2).

大多数MP是蛋白酶族锌蛋白的成员，它们拥有一个短的共有氨基酸序列，HEXX年H.该基序包含催化锌和谷氨酸的两个蛋白质配体，在催化过程中充当普通碱/酸(三，4). 第三种金属配体是溶剂分子，进一步与谷氨酸结合并被谷氨酸极化。这种溶剂对结合底物的键羰基碳进行亲核攻击，形成四面体宝石-由带正电的金属离子和邻近蛋白质残基稳定的二元酸反应中间体(5). 在普通碱/酸的协助下，中间体随后的演变最终导致键断裂。

锌素分为葡萄糖锌素、阿司匹林锌素和甲锌素家族(4，7). 后者主要包含多域蛋白质，其中一个N末端前体域参与潜伏期维持，一个催化蛋白酶域，以及参与蛋白-蛋白质和细胞-细胞相互作用及其他调节功能的下游域。蛋白酶域的特征是C末端延伸的锌结合基序HEXX年H（H）XX年G公司XX年（H/D），带有标志性甘氨酸和第三种锌结合组氨酸或天冬氨酸。此外，蛋氨酸存在于保守的下游转弯处，即Met-turn(三，7，8). Metzincins可分为多个家族，其中七个家族至少有一个成员在结构水平上得到了表征：astacins、ADAMs/adamalysin/reprolysins、serralysins、基质金属蛋白酶、snapalysins、利什曼原虫和pappalysins。此外，基因组测序项目报告的一系列序列表明，还有一些结构上没有特征的家族，暂时被称为脆弱溶素、配子溶素、古埃米菌素、苏云金杆菌素、空肠溶素、抗坏血菌素、螺旋溶素和胆汁溶素（详细综述见参考文献。7).

Metzincin褶皱

迄今为止，已将至少包含催化结构域的200多个metzincins结构存放在蛋白质数据库中(补充的表1）。在这篇综述中，讨论了上述每个家族的七个领导结构：无刺无刺虾青素，鳄鱼adamalysin II，铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌素、人类中性粒细胞胶原酶（MMP-8）、，头状链霉菌中性蛋白酶（snapalysin），大型利什曼原虫利什曼洛林，和乙酸甲烷八叠球菌乌利赖氨酸(9——15). 这些原型涵盖了不同的生命王国，代表了古生菌、细菌、原生动物、甲壳动物、爬行动物和哺乳动物。结构显示，metzincins共享一个共同的支架和活性位点环境，但每个家族都有不同的结构元素。成熟的催化结构域是约130–260个残余球状部分，相对于中央活性位点裂开，其分为上部NSD和下部CSD。基底以近似延伸的构象从左到右水平地与裂缝结合(补充的图1A类). （所有拓扑指示均指本图中显示的标准方向。）

NSD在顶部显示一个五股扭曲的β板（利什曼洛林除外，利什曼诺林有四股）(补充的图1A类). 除第四条外，所有链（βI–βV）彼此平行，并与缝隙中结合的任何基质平行。反平行链，βIV，形成该子域的下边缘，并形成活性位点缝隙的上边缘或北壁(16). 这条链以反平行的方式结合底物，主要是在无底物一侧。连接链βIII和βIV的环段（称为LβIIIβIV）导致凸起元素的出现，主要影响子岩石S₁'和S₂'（见参考。17用于蛋白酶中的子网站命名）。这导致活性位点裂口的启动侧酶-底物相互作用发生广泛变化。NSD还包含两个长α-螺旋，分别为αA和αB，以及背螺旋和活性中心螺旋。在所有metzincin结构中，两者以相同的方式布置在β板的凹侧(补充的图1B类). 螺旋αB在所有七个结构中叠加良好(图1A类)并包含锌结合基序的前半部分，包括前两个锌结合组氨酸残基(图1A类和补充的图1）。在螺旋αB末端，多肽链在共有序列甘氨酸的介导下急剧向下翻转。不同铅结构中该残基的主链角表明，除尤利赖氨酸外，任何其他残基都将处于高能构象，因此不受欢迎（见下文）。

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图1。

作为C的七个原型通用的结构段重叠^α地块。 A类活性位点螺旋αB（包括锌配体组氨酸和天冬氨酸的侧链以及一般碱/酸）和Met-turn（含蛋氨酸侧链）。蓝色，虾青素；青色，adamalysin II；红色利什曼洛林；绿色MMP-8；白色铜绿假单胞菌素；黄色的，snapalysin；橙色，乌利赖氨酸。这个洋红色弧形箭头指出利什曼洛林中插入额外域的位置。B类，上域β-片（链βI–βV，in青色，蓝色，绿色，橙色、和黄色的后螺旋αA(红色)和C端螺旋αC(紫色)正如在七条线索中发现的那样。利什曼原酶缺乏链βII。

CSD开始于甘氨酸之后，链通向第三个锌配体，组氨酸或天冬氨酸，从下面接近金属(补充的图1）。该亚结构域包含少量重复的二级结构元素，主要是多肽链末端的C末端螺旋αC。螺旋体αB和αC通过长度和构象不同的结构连接。然而，所有结构都在一个保守的1,4-β-圈上重合，该圈在位置3（Met-turn）含有一个蛋氨酸，通过连接不同结构中6-53个氨基酸的片段从第三个锌结合组氨酸中分离出来。Met-turn是重叠的（包括蛋氨酸侧链的构象）(图1A类)位于催化锌的下方²⁺，形成疏水枕头。然而，未观察到与金属直接接触。突变研究表明，这种蛋氨酸在催化结构域的折叠和稳定性中起作用，尽管这种残留物的严格保守性仍有待解释(18，19).^三S系列₁甲锌素的口袋在顶部由LβIIIβIV制成的凸起物形成，在底部由插在Met圈和C末端螺旋αC之间的残基组成的成壁段形成(16). 该片段在所有七个参考结构中的结构和长度不同（Met-turn蛋氨酸和螺旋αC的第一个残基之间的残基从11到37不等）。

锌结合遗址

催化锌离子大致位于活性中心缝隙底部的中心。它由N^ϵ2三种共有组氨酸的原子（两种组氨酸N^ϵ2原子和一个天冬氨酸O^δ2snapallysin中的原子）和催化溶剂分子，在酶/抑制剂-产物复合物中被其他配体取代(补充的，补充的表1）。一些甲锌素以酪氨酸O的形式在距离催化阳离子稍远的地方显示出额外的蛋白质配体^η原子，如在未结合的虾青素和serralysins中所见，以及在ulilysin中所假设的(21). 这个酪氨酸残基位于蛋氨酸前面的两个位置。在（未结合的）snapalysin中，酪氨酸位于金属结合天冬氨酸下游的两个位置，但不再位于锌离子的结合距离内。这些酪氨酸残基在底物锚定、裂解和产物释放期间以一种称为酪氨酸开关的运动来回翻转。在这方面，它们可能在底物和催化溶剂结合以及四面体中间体或产物氨基的稳定中发挥作用(7，9，22——24). 这种作用是由缺乏酪氨酸的甲锌素中的其他非接触残基发挥的。

家庭之间的结构相关性

基于结构的序列比对表明，除了包含锌结合共有序列的区域外，metzincins之间的序列一致性可以忽略不计，尽管存在明显的结构相关性。基于这种对齐，在潜在客户之间进行两两比较(补充的图2）显示了41和118之间的拓扑等效C^α3.3和4.0Å之间的位置和均方根偏差，即高于阈值2 C^α位置可视为结构等效（3.0Å）(25). 序列一致性介于3%和20%之间，即序列相关性明显低于暮色值（25–35%）(26). 最接近的结构对是铜绿假单胞菌素和MMP-8(Z轴-得分=15.8）(补充的图2和补充的参考文献。1和2)、MMP-8和snapalysin（15.2）、adamalysin II和ulilysin（14.4）以及adamalysion II和leishmanolysin（143）。最远的对是阿斯他星和adamalysin II(Z轴-评分=2.9），MMP-8和ulilysin（6.2），snapalysin和ulilasin（6.6）。

每个家庭的不同特点

海星是小龙虾中残留的200种消化酶A.无星体也是结构分析中的第一个虾青素家族成员(9). 通过蛋白质降解、生长因子激活、细胞外基质周转和细胞外被膜降解（孵化），虾青素参与消化、发育、组织重塑和分化等多种生物过程(例如促进软骨、骨形成和胶原合成）(27).

虾青素的三维结构显示出一个类似袋鼠的球形结构和两个大小近似相等的亚畴(补充的图1A类) (9). 虽然这种蛋白酶仅包含一个前肽和一个催化MP结构域，但大多数其他虾青素显示额外的C末端MATH、MAM、CUB-like、Ser/Thr-rich、I（插入）-、表皮生长因子样、Tox1和跨膜模块（有关详细信息，请参阅参考文献。8，27、和28). 虾青素家族具有CSD中最长的区域，缺乏规则的二级结构元素，只有一个小螺旋和一个短的β-带，尽管这是metzincins中顺序最保守的连接段（参见参考文献中的表1）。7). 蛋白质支架由四个保守的半胱氨酸残基交联，形成两个二硫键(补充的，补充的图1）。成熟酶的前两个残基埋藏在CSD的内腔中，N末端α-氨基与第三个锌结合组氨酸旁边的保守谷氨酸建立相互作用。由于Met-turn下游存在第四不变量，尽管有点远，酪氨酸锌配体，催化锌的未结合配位为三角双锥(补充的图1A类). 除了虾青素外，最近还报道了人tolloid样蛋白酶-1和骨形态发生蛋白-1的结构(29).

Serralysins是致病性γ类蛋白菌以自激活酶原形式分泌的～50-kDa细菌毒性因子(30). 这些微生物可引起脑膜炎、心内膜炎、肾盂肾炎、鼠疫、皮炎、软组织感染、败血症、类鼻疽、肺炎和其他呼吸道和泌尿道感染等人类疾病。由于它们能够产生外科伤口感染和感染新生儿，因此在医院获得性感染中发挥着重要作用。作为这些细菌毒力潜力的一部分，serralysins针对凝血因子和防御蛋白、蛋白酶抑制剂、溶菌酶和转铁蛋白，并可能引起过敏反应。

第一个进行生化和结构表征的serralysin是铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌素(10). 其成熟的220-残留催化结构域缺乏二硫键连接，其C末端两侧是钙稳定的β-滚动结构域。与虾青素一样，它的两个亚结构域大小相似。多肽链始于CSD中的α-螺旋（该家族的特征），该螺旋通过C末端螺旋αC的保守盐桥锚定在分子体上(补充的图1B类). NSD的特点是有一个由细长的LβIαa组成的瓣，并穿过β片的凸面。该皮瓣在serralysins之间差异很大（据报道有20种结构）(补充的表1），明显影响底物结合。铜绿假单胞菌素的CSD在连接Met-turn和成壁拉伸的节段内呈现一个额外的α-螺旋，以及由连接节段残余物形成的第二个瓣。这些元素还调节底物结合。铜绿假单胞菌素与结合四肽复合物的比较(10)，具有紧密相关的未绑定结构粘质沙雷菌serralysin揭示了未连接的锌配位类似于虾青素（三角双锥基）。它还包括在底物结合时发生铰链运动的酪氨酸(31).

盲肠链球菌snapalysin是一种分泌的中性蛋白酶，包含一个132-残留催化结构域，前面是一个富含丙氨酸的100氨基酸N末端延伸，包括一个信号肽和一个前体蛋白。其他类似序列也有报道链霉菌物种，它们被称为SnpA（Prt和snapalysin）、MprA和SnpA。它们表现出水解牛奶的活性。

Snapalysin是最小的metzincin，也是唯一具有结构特征的家族成员。它的结构让人联想到一个扁平的椭球体，并分叉成两个不对称的子域(12). 它显示了由短回路连接的所有特征金属特征。区别元素是一个小的LβIIβIII，从NSD内的上片突出，活性位点裂缝的底漆侧顶部有一个小凸起，LβVαB中有一个短螺旋，以及钙结合位点(补充的图1A类). 此外，在第三个锌结合组氨酸的位置发现了天冬氨酸，在序列的两个位置，一个保守的酪氨酸接近但不结合金属。

基质金属蛋白酶是47年前发现的分泌型或膜结合型蛋白酶，在蝌蚪到青蛙的变态过程中参与尾巴的吸收。它们主要存在于高等哺乳动物中，尽管在鱼类、两栖动物、昆虫、植物、原核生物和病毒中也发现了相关序列。通过细胞外基质蛋白的转换，MMPs参与组织的吸收、重塑和修复，如胚胎发生和发育、分支和器官形态发生以及血管生成过程中所观察到的那样。然而，它们强大的蛋白水解潜能或其缺失也可能导致炎症、溃疡、类风湿性关节炎和骨关节炎、牙周炎、心力衰竭和心血管疾病、纤维化、肺气肿、癌症和转移(32). 最近，人们观察到基质金属蛋白酶参与有限蛋白水解后的激活事件，如在细胞凋亡和肠道防御蛋白激活中观察到的，也参与中风、人类免疫缺陷病毒相关痴呆、动脉粥样硬化、多发性硬化、细菌性脑膜炎、，和阿尔茨海默病。基质金属蛋白酶包括细胞外蛋白，如其他（前）蛋白酶、抑制剂、凝血因子、抗菌肽以及趋化和粘附分子。与ADAM（见下文）一样，基质金属蛋白酶也参与生长因子、生长因子结合蛋白、激素和激素受体、细胞因子和细胞因子受体从细胞表面的外域脱落(33).

与其他甲锌素家族一样，基质金属蛋白酶是由一系列插入物和结构域组成的镶嵌蛋白。这些可能包括～20残基分泌信号肽、～80残基前肽、160-170残基锌和钙依赖性催化蛋白酶结构域、连接子区域和4倍螺旋桨血红素样C末端结构域。进一步插入可能包括纤维连接蛋白II型相关结构域；胶原型V样和玻璃体凝集素样插入域；富含半胱氨酸、富含脯氨酸和白细胞介素-1受体样结构域；免疫球蛋白样结构域；糖基磷脂酰肌醇连锁信号；膜锚；和一个细胞质尾巴。MMPs的命名历史上始于成纤维细胞胶原酶作为MMP-1，目前已达到MMP-28，在人类中有23种不同的形式(34). 那些包含膜锚的基质金属蛋白酶产生了膜型基质金属蛋白酶亚家族(16，32). 在MMPs中，Zymogen的激活根据半胱氨酸开关或Velcro机制进行。这将删除前域并从非活动状态切换，其中S^γ保守基序PRCGVPD中半胱氨酸残基的原子将锌配位球中的催化溶剂分子替换为完全可获得的活性酶(35，36). MMPs是结构上研究最为深入的甲锌素家族，据报道其结构超过120个(补充的表1）(37). 人中性粒细胞胶原酶（MMP-8）的成熟催化域(13，37)有一个浅活性位点空腔，将较大的NSD（～120个残基）与较小的CSD（～40个氨基酸）分开，通常具有深疏水性S₁'口袋。结构中不存在二硫键。N-末端α-氨基锚定在螺旋αC中嵌入的两个保守天冬氨酸中的第一个。NSD显示出一个S形双环连接链βIII和βIV，其中包含一个结构锌阳离子和一个紧密结合的钙离子。这一段的下游残留物形成一个突出的凸起，突出到活性部位凹槽中。LβIVβV和LβIIβIII有助于NSDβ板顶部的第二个钙结合位点(补充的图1，A类和B类). 在CSD中，MMP-8链显示了metzincins中最短、最保守的连接段。

ADAMs/adamalysins/repelysis分为三个亚组，蛇毒MP、哺乳动物ADAMs和同样的哺乳动物ADAMTS(38——41). 前者通过消化毛细血管周围的细胞外基质成分，导致组织坏死，从而导致感染后出血。反过来，ADAM最初被描述为在哺乳动物生殖道的受精和精子功能中发挥作用。它们参与肌肉发生、发育、神经发生、成骨细胞分化、细胞迁移调节和肌肉融合。他们还参与人类疾病，如哮喘、心脏肥大、肥胖相关脂肪生成和恶病质、类风湿性关节炎、内毒素休克、炎症和阿尔茨海默病。如前所述，它们也在MMPs的蛋白外结构域脱落中起主要作用。最后，一些缺乏跨膜结构域的家族成员，携带血小板反应蛋白1样重复序列和CUB结构域的多个拷贝，产生了一个独特的可溶性细胞外蛋白酶亚家族，ADAMTS(42). 这些酶通过与整合素结合来抑制细胞粘附。它们还参与性腺形成、胚胎发育和血管生成、前胶原激活，以及炎症过程、关节炎疾病中的软骨（aggrecan）降解、出血疾病和胶质瘤侵袭。

所有ADAMs/adamalysins/replysins都是细胞外多域蛋白，含有催化锌和钙依赖的MP结构域。此外，它们可以显示前体蛋白和C末端去整合素样、富含半胱氨酸、C型凝集素、表皮生长因子样、血小板反应蛋白1样和/或跨膜结构域以及细胞质结构域。潜伏期由前体蛋白维持，激活被认为发生在基质金属蛋白酶中，即根据半胱氨酸开关样机制通过前体蛋白的裂解(7，36，43). 第一个要分析的催化结构域是来自C.金刚石蛇毒(11). 这是一个紧凑的203-残余分子，扁椭球形，在外围有缺口，形成相对平坦的基质填充裂缝。该裂缝将大的～150残留NSD与小的～50残留CSD分开(补充的图1A类). N端和C端均位于表面；前者通过盐桥连接到C端螺旋αC(7). Adamalysin II在保守的规则二级结构元件中与metzincin共有序列的偏离最大，尤其是在链βI和螺旋αA和αC处(图1B类). 插入通用脚手架后，在NSD内发现两条额外的螺旋。在CSD中，两个二硫键交联不规则连接段，并分别将螺旋αC连接到NSD。钙离子位于表面，与活性部位相对，靠近C末端(补充的图1A类). S系列₁'口袋，以显著的隆起段LβIVβV为特征，具有疏水性和深度，令人想起一些基质金属蛋白酶。除adamalysin II外，迄今为止还对一些蛇毒MP（ADAM-17、ADAM-33和ADAMTS-1、-4和-5）进行了结构分析(补充的表1）。

利什曼原虫素是存在于大多数锥虫、疟原虫和肉孢子虫原虫中的细胞表面蛋白质。它们构成前鞭毛虫表面的主要成分，对多肽底物具有酶活性。它们切割人类T细胞表面的CD4分子，并保护前鞭毛体免受补体蛋白的裂解，这表明它可能是一种毒力因子。相关序列已在哺乳动物（此处称为invadolysin）、果蝇、水芹、线虫和细菌中发现(7，44). 唯一经过结构分析的家族成员是L.主要利什曼洛林。它被合成为内质网中的一种602-残基非活性前体，带有一个信号和一个100-残基前肽，其中包括一个高度保守的半胱氨酸残基，可能充当半胱氨酸开关（见上文）。活化释放出约280个残基的成熟MP，然后是约200-残基的C末端结构域。在长共有基序的甘氨酸和第三锌结合组氨酸之间观察到63个残基插入域(补充的，补充的图1A类). MP结构域是美他嗪类中最不对称的，具有175-残留NSD和一个～45-氨基酸CSD。其N端位于左后表面。NSD以缺乏链βII的β-片为特征(补充的图1，A类和B类)以及两个独特的～40-氨基酸插入皮瓣的存在，这是该家族其他蛋白质大小差异的主要原因。NSD由两个二硫键交联。前链βIV，一个略微突出的隆起段位于浅、中等S的顶部₁'口袋，由成壁段和活性中心螺旋αB的起点分隔。在CSD的末端，螺旋αC后面是一个延伸构象的片段，它从左到右穿过后表面(14).

结构上最新的家族是pappalysins。它们是以人类PAPP-A命名的，PAPP-A是一种高度糖基化的170-kDa多域蛋白，专门裂解胰岛素样生长因子结合蛋白(45). 脯氨酸蛋白酶是一种38-kDa的古细菌蛋白质acetivorans支原体与PAPP-A序列相似，但仅包含前体蛋白和催化结构域(15). 前体蛋白可能会经历半胱氨酸开关介导的激活，正如前体蛋白中存在保守半胱氨酸所暗示的那样。钙的存在会自动激活。成熟的ulilisin有262个残基，是所有metzincin催化域中最大的MP。作为区别特征，它在NSD中呈现出一个环，将链βII分为两个子带（βII和βII′），并在LβIIIβIV中插入一条β带，该条带从分子表面突出，并在其底漆侧框定活性位点。连接螺旋αA和链βII的片段是美津霉素中最大的，以斗篷状的方式覆盖了从NSD到CSD的几乎所有分子背面，并包括两个独特的α-螺旋。锌结合基序的甘氨酸在ulilisin和一小部分pappalysins中被天冬酰胺取代，主链角略有变化，这与高能构象无关，而与左旋α螺旋相对应。总的来说，这个残留物侧面的链迹与其他甲锌素无法区分(补充的图1）(7). CSD显示两个二硫键和一个独特的双钙位点。这个位点是活性的分子开关，因为蛋白酶可以通过钙螯合剂被可逆地抑制(15，20，21). 最后，在缺乏未结合结构的情况下，ulilisin可以拥有Met-turn提供的第五个锌结合酪氨酸配体，该配体在底物结合时摆动。

结论

metzincins组成了一个普遍存在于所有生命王国中的议员家族，对生理学和病理学至关重要。到目前为止，已经对七个家庭进行了结构分析。该家族代表了一个与乌美辛不同的进化案例，乌美辛看起来与最小的成员斯纳帕利辛没有太大区别。在这样一个最小的支架中，进化引入了每个家族中保守的独特结构元素。基于存在一个扩展的锌结合一致序列模式，已经建议多个家庭扩大家族，尽管需要未来的结构分析来确认其归属。七个家族中每个家族的结构信息可能有助于阐明共同的催化和加工机制，并确定新发现基因序列编码的蛋白质的功能。

补充材料

致谢

参考文献