自然。作者手稿；PMC 2009年8月26日发布。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院126842
一种控制血管生成的机械敏感性转录机制
,1 ,2 ,1 ,1 ,1 ,2 ,三，* ,2和1,4
阿基科·曼莫托
1马萨诸塞州波士顿市儿童医院和哈佛医学院病理外科血管生物学项目02115
基普·M·康纳
2马萨诸塞州波士顿市儿童医院和哈佛医学院眼科，邮编02115
塔达诺里·曼莫托
1马萨诸塞州波士顿市儿童医院和哈佛医学院病理外科血管生物学项目02115
庄永勇（Chong Wing Yung）
1马萨诸塞州波士顿市儿童医院和哈佛医学院病理外科血管生物学项目02115
Dongeun Huh公司
1马萨诸塞州波士顿市儿童医院和哈佛医学院病理外科血管生物学项目02115
克里斯托弗·阿德曼
2马萨诸塞州波士顿市儿童医院和哈佛医学院眼科，邮编02115
古斯塔沃·莫斯托斯拉夫斯基
三哈佛医学院遗传学系，哈佛医学院，美国马萨诸塞州波士顿，邮编02215
路易斯·史密斯
2马萨诸塞州波士顿市儿童医院和哈佛医学院眼科，邮编02115
唐纳德·英格勃
1马萨诸塞州波士顿市儿童医院和哈佛医学院病理外科血管生物学项目02115
4马萨诸塞州剑桥市怀斯生物启发工程研究所和哈佛工程与应用科学学院，邮编02139
1马萨诸塞州波士顿市儿童医院和哈佛医学院病理外科血管生物学项目02115
2马萨诸塞州波士顿市儿童医院和哈佛医学院眼科，邮编02115
三哈佛医学院遗传学系，哈佛医学院，美国马萨诸塞州波士顿，邮编02215
4马萨诸塞州剑桥市怀斯生物启发工程研究所和哈佛工程与应用科学学院，邮编02139
*现地址：马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院医学系02115
- 补充材料
补充图S 1。
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补充图S 10。
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补充图S 11。
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补充图S 12。
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补充图S 13。
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补充图S 2。
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补充图S3。
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补充图S 4。
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补充图S 5。
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补充图S 6。
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补充图S 7。
指南：AFEE8C4B-00DE-4D68-8981-933464694E60
补充图S 8。
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补充图S 9。
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供应表1。
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供应表2。
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摘要
血管生成受细胞和细胞外基质以及可溶性血管生成因子（如VEGF）之间的物理相互作用控制。然而，机械信号与其他微环境线索结合以调节新生血管形成的机制尚不清楚。这里我们显示Rho抑制剂p190RhoGAP控制毛细血管网络的形成体外和视网膜血管生成体内通过调节调节VEGF受体基因表达的两种拮抗转录因子TFII-I和GATA2之间的活性平衡，血管内皮生长因子2此外，这种新的血管生成信号通路对细胞外基质弹性以及可溶性VEGF敏感。这是已知的第一种控制组织形态发生的转录因子之间的功能性交叉拮抗，并对机械和化学提示作出反应。
关键词：VEGFR2、p190RhoGAP、TFII-I、GATA2、机械传导、血管生成、毛细血管内皮细胞
血管生成（毛细血管的生长）的失调会导致许多疾病的发展，包括癌症、关节炎和失明1,2FDA批准的血管生成抑制剂仅针对氧敏感性血管内皮生长因子VEGF；然而，新生血管也受到其他微环境信号的控制，包括细胞外基质（ECM）传递的机械力。例如，虽然毛细血管的发育是由促血管生成的有丝分裂原驱动的，但细胞对这些可溶信号的敏感性可以通过细胞和ECM之间的物理交互作用来调节，这些交互作用可以改变细胞形状和细胞骨架结构三-8通过改变ECM的弹性、粘附性或形貌、施加机械应力或改变细胞产生的牵引力，可以使毛细血管细胞的形状和功能发生类似的变化三-8机械张力也刺激毛细血管生长和血管重塑体内9ECM力学和细胞形状的区域变化似乎介导了相邻细胞如何进行局部生长和分化差异，从而驱动三维组织模式的形成10,11但ECM传递的机械信号与生长因子诱导的信号会聚，以控制血管生成控制所需的基因转录的机制尚不清楚。
VEGF及其受体VEGFR2在血管生成中特别重要，因为它们对正常血管发育至关重要12,13放松对这些因素的调控会导致各种病理状况1,2,14因此，我们研究了VEGF和VEGFR2在这些机械力调节毛细血管发育的机制中的作用。血管生成过程中的细胞机械传导分析表明，小GTPase（Rho）介导生长控制体外10,15以及血管发育体内9通过调节控制细胞形状的机械力平衡。应激诱导的毛细血管细胞骨架畸变通过控制其上游抑制剂p190RhoGAP调节Rho活性16p190RhoGAP与转录因子TFII-I结合，并将其固定在成纤维细胞的细胞质中17TFII-I是一种多功能转录因子血管内皮生长因子2大血管内皮细胞的表达18 19虽然尚不清楚它是否在血管生成中起作用，但TFII-I缺失与心血管缺陷相关20这些发现增加了TFII-I也可能参与血管网络形成过程中机械力触发的细胞内信号机制的可能性。
p190RhoGAP和TFII-I调节VEGFR2
为了探索p190RhoGAP是否通过改变基因转录来调节血管发育，我们敲除了p190 RhoGAP（Rho间隙）在使用siRNA的人微血管内皮（HMVE）细胞中，TFII-I蛋白水平大约是敲除细胞核部分的1.5倍(补充图S2a)荧光显微镜证实了这一点(补充图S2b). 如纤维母细胞所示17，我们发现p190RhoGAP与TFII-I共沉淀（反之亦然）(补充图S2c)提示p190RhoGAP也可能结合TFII-I并将其隔离在人毛细血管细胞的细胞质中。
TFII-I通过结合血管内皮生长因子2发起人18。但是TFII-I型HMVE细胞的敲除增加（而不是减少）蔬菜2mRNA和蛋白质水平是对照细胞的2到3倍，并且过度表达TFII-I型（δ亚型21)使用慢病毒转导产生了相反的效果(,补充图S3a). 这可能是因为大血管和微血管内皮细胞经历了不同的形态发生程序（产生大管而不是分支毛细血管）。
TFII-I和GATA2控制血管内皮生长因子2通过p190RhoGAP表达a） 血管内皮生长因子2和TFII-I型用以下物质处理的细胞中的mRNA水平TFII-I型相对于对照细胞的siRNA或慢病毒载体（病毒）（*，第页< 0.05; 未配对学生的t检验贯穿始终）。b）免疫印迹显示经TFII-I型或p190 RhoGAP（Rho间隙）siRNA，或两者兼而有之。c）显示对照组和对照组GATA2分布和细胞核DAPI染色的免疫荧光显微照片p190 RhoGAP（Rho间隙）用0.3%血清（bar，5μm）培养击倒细胞。d） 血管内皮生长因子2转染细胞的mRNA水平p190 RhoGAP（Rho间隙）siRNA单独或与GATA2协议siRNA（*，第页<0.01).血管内皮生长因子2启动子活性（e）和mRNA水平（f）转染有GATA2协议或TFII-I型siRNA单独或组合（*，第页<0.01; **,第页<0.05).g）ChIP分析显示血管内皮生长因子2转染GATA2或TFII-I抗体的细胞中启动子协同免疫沉淀TFII-I型或GATA2协议siRNA（Ct，对照；n=3；误差条=整个s.e.m.）。
TFII-I与血管内皮生长因子2基因启动子，以及该启动子的较小部分（人类血管内皮生长因子2：-225至+268、-570至+268和-780至+268）与全长启动子（4kb）相比活性相似或更高18,22当这些不同血管内皮生长因子2使用荧光素酶分析在人脐静脉内皮细胞（HUVE）中鉴定启动子，TFII-I型敲除增加TFII-I型使用DNA转染减少，血管内皮生长因子2启动子活性分别为正常水平的1.5至2倍和五分之一(补充图S3b). 无启动子pGL3碱性报告子未显示启动子活性（未显示）。此外血管内皮生长因子2Inr（-780+268；780MUT）降低了对照组和对照组的启动子活性TFII-I型击倒细胞(补充图S3b)，确认TFII-I减少血管内皮生长因子2通过Inr区域的启动子活性。重要的是，这些效应的特异性TFII-I型通过证明TFII-I型可以逆转这些影响(补充图S3c).
接下来我们问p190RhoGAP是否刺激血管内皮生长因子2通过限制TFII-I的核转位表达(补充图S2a，b).TFII-I型击倒次数增加，并且p190 RhoGAP（Rho间隙）击倒减少，血管内皮生长因子2相对于对照细胞的启动子活性（-780+268）(补充图S3d). 两次击倒p190 RhoGAP（Rho间隙）和TFII-I型表现出与TFII-I型敲低细胞(补充图S3d). 然而，p190 RhoGAP（Rho间隙）击倒没有减少血管内皮生长因子2mRNA和蛋白质水平；事实上，它增加了VEGFR2蛋白水平(,补充图S3d). 此外，p190 RhoGAP（Rho间隙）和TFII-I型两次击倒产生了类似或略高水平的血管内皮生长因子2mRNA和蛋白质表达(,补充图S3d)与两者相比p190 RhoGAP（Rho间隙）或TFII-I型独自击倒。这些结果提出了一种有趣的可能性，即可能存在一种TFII-I活性拮抗剂，它也有助于p190RhoGAP依赖性控制血管内皮生长因子2表达式。
GATA2上调VEGFR2
GATA2是另一种结合血管内皮生长因子2启动子并调节其活性23,24因为许多GATA家族成员在启动子位点拮抗其他转录因子的作用25-28，我们探讨了GATA2是否介导p190RhoGAP依赖性控制血管内皮生长因子2通过反对TFII-I活性表达。什么时候？p190 RhoGAP（Rho间隙）免疫印迹显示，尽管GATA2总水平保持不变，但细胞核中GATA2水平相对于对照细胞显著增加（>10倍(补充图S3e)和荧光显微镜(). p190RhoGAP也与GATA2共免疫沉淀，反之亦然(补充图S3f). 重要的是，核GATA2的增加明显高于使用p190 RhoGAP（Rho间隙）小干扰RNA(补充图S2a，b)，表明p190RhoGAP在细胞质中比在毛细管细胞中的TFII-I更有效地结合和螯合GATA2。GATA2协议使用siRNA敲除减少血管内皮生长因子2启动子活性以及mRNA和蛋白质水平(补充图S4a、b)如前所述23，同时GATA2协议过度表达产生了相反的效果。这些影响GATA2协议siRNA开启血管内皮生长因子2启动子活性和蛋白质表达是特定的，因为它们被加塔2重建(补充图S3c). 有趣的是，p190 RhoGAP（Rho间隙）击倒增加了血管内皮生长因子2mRNA和蛋白质，以及与GATA2协议抑制了这些影响(,补充图S4c). 因此，GATA2似乎上调了监管血管内皮生长因子2启动子活性并介导p190RhoGAP对血管内皮生长因子2毛细血管细胞中的基因表达。然而p190 RhoGAP（Rho间隙），释放的GATA2比TFII-I更多，并且增加血管内皮生长因子2表达，没有增加血管内皮生长因子2启动子活性(补充图S3d). 这可能是因为手机TFII-I型水平比GATA2协议级别（未显示）。我们还测量了血管内皮生长因子2仅使用其启动子的一部分的启动子活性，因此，TFII-I和GATA2也可以在其他启动子位点发挥调节活性；或者，p190RhoGAP可能引发影响mRNA稳定性的信号。
接下来，我们询问GATA2和TFII-I是否直接对立。同时击倒TFII-I型和GATA2协议消除彼此对血管内皮生长因子2启动子活性()，mRNA生成()和蛋白质表达水平(补充图S4e)，同时过度表达TFII-I型和GATA2协议产生了类似的效果(补充图S4d，e). 这些影响是针对血管内皮生长因子2作为击倒TFII-I型或GATA2协议未更改的表达式血管内皮生长因子受体1或蔬菜3HMVE细胞中(补充图S5a). 重要的是，尽管p190RhoGAP是一种Rho抑制剂，但通过组成型活性RhoA、可渗透膜的C3外显酶或指向另一种抑制Rho的RhoGAP的siRNA来改变Rho活性(p73 RhoGAP（Rho间隙）)29没有更改血管内皮生长因子2mRNA或蛋白质水平(补充图S5b，c). 因此，p190RhoGAP似乎可以控制血管内皮生长因子2仅通过其隔离这些转录因子的能力来表达。
对这种功能性交叉拮抗机制的分析表明，GATA2和TFII-I相互关联，就像GATA2与TFII-I-共同免疫沉淀一样，反之亦然(补充图S6a). 此外，GATA2甚至与TFII-I在p190 RhoGAP（Rho间隙）敲除细胞并将其转化为p190RhoGAPTFII-I型敲低细胞(补充图S6b). 这些结果表明，TFII-I、GATA2和p190RhoGAP的不同异二聚体组合存在于不同的池中，这些异二聚物随后结合形成更大的三元络合物(补充图S1).
染色质免疫沉淀（ChIP）分析显示TFII-I型与对照细胞相比，敲除细胞显示GATA2向GATA结合位点（-150-+150）的募集增加，反之亦然()而对照IgG没有免疫沉淀这些DNA().p190 RhoGAP（Rho间隙）敲除减少了TFII-I而不是GATA2向该启动子位点的招募，这导致GATA2在此位点的招募相对净增加(补充图S6c). 因此，TFII-I和GATA2相互竞争，争夺血管内皮生长因子2启动子，由p190RhoGAP控制。
VEGFR2的机械控制
可溶性生长因子、与ECM结合的整合素和细胞骨架的机械变形都调节细胞中的p190RhoGAP活性30细胞与生长因子的结合以及与ECM的粘附接触也控制血管内皮生长因子2表达31,32可溶性有丝分裂原（5%血清加VEGF、bFGF和PDGF）增加HMVE细胞中TFII-I和GATA2的核转位(补充图S7a). 因此，我们接下来探讨了细胞和ECM之间机械相互作用的变化是否也调控这一途径。当HMVE细胞在不含有丝分裂原的情况下培养在具有不同弹性（杨氏模量150至4000Pa）的纤维连接蛋白涂层聚丙烯酰胺凝胶上时，它们在软凝胶上呈圆形，而在较硬的凝胶上呈扁平状，如前所述33,34，这是基于它们物理抵抗细胞牵引力的能力的差异8,33,34更硬凝胶上的细胞核GATA2水平显著升高，而无论ECM硬度如何，细胞核都表现出类似的高TFII-I水平()在多种可溶性因子或VEGF单独存在的情况下也得到了类似的结果(补充图S7b). 此外，血管内皮生长因子2在较硬的（4000帕）凝胶上，细胞中的mRNA和蛋白质水平较高(,补充图S7c). 有趣的是，这种相对坚硬但仍顺从的ECM凝胶似乎支持该信号通路的最佳反应性，如血管内皮生长因子2在硬质玻璃ECM基质上培养的细胞中，mRNA和蛋白质水平显著降低(,补充图S7c). 因此，ECM弹性可以调节血管内皮生长因子2优先通过GATA2表达，尤其是在本研究分析的刚度范围内。
矩阵弹性控制蔬菜2通过TFII-I和GATA2表达a）免疫荧光显微镜显示GATA2和TFII-I在不同硬度（杨氏模量150和4000 Pa）的纤维结合蛋白包被凝胶培养的HMVE细胞中的分布，EBM2中含有0.3%的血清（bar，5μm）。b） 血管内皮生长因子2在刚性纤维粘连蛋白涂层玻璃或不同弹性凝胶（150、1000和4000 Pa；归一化为最软凝胶上细胞的mRNA水平；*，第页<0.01, **,第页<0.05).c） 血管内皮生长因子2经转染后的软凝胶（150 Pa）上HMVE细胞的mRNA水平TFII-I型或GATA2协议siRNA单独或组合（归一化为最硬凝胶上的细胞；*，第页<0.01).d） 血管内皮生长因子2转染HMVE的软凝胶中HMVE细胞的mRNA水平p190 RhoGAP（Rho间隙）或GATA2协议siRNA单独或组合（标准化为最硬凝胶上的细胞；*，第页<0.01). 误差条表示3个复制实验的标准误差。
进一步分析表明TFII-I型击倒恢复血管内皮生长因子2软凝胶上细胞的表达水平与硬凝胶上细胞相似，并用GATA2协议（减少了蔬菜2表达）废除TFII-I效果(,补充图S7d).p190 RhoGAP（Rho间隙）击倒也增加了血管内皮生长因子2mRNA和蛋白质，以及与GATA2协议抑制软凝胶的这些作用(,补充图S7d). 这些数据表明，p190RhoGAP和相互拮抗的TFII-I和GATA2转录因子介导ECM弹性对血管内皮生长因子2在这些细胞中的表达，在较硬的凝胶上优先转移到GATA2。
血管生成的转录控制
接下来，我们通过分析毛细血管细胞迁移和分化（管形成）来探讨GATA2和TFII-I之间这种拮抗作用的功能相关性体外当HMVE细胞转染TFII-I型siRNA，并使用Transwell迁移分析进行分析，VEGF刺激的细胞活力增加了2倍，而这种诱导通过敲低GATA2协议与…同时TFII-I型(). VEGFR2激酶抑制剂SU5416完全抑制这些细胞的迁移()，证实这些效应是由VEGFR2信号介导的。此外，GATA2协议过度表达使VEGF诱导的细胞迁移增加了3倍，同时过度表达GATA2协议和TFII-I型消除了这些影响(). 这些效应在重建TFII-I型或加塔2扭转了击倒的影响TFII-I型或GATA2协议分别为(补充图S8a).
GATA2和TFII-I之间的拮抗作用控制毛细血管细胞迁移和管形成体外a）转染人siRNA或转染编码慢病毒载体的HMVE细胞的运动性GATA2协议或TFII-I型单独或组合使用Transwell迁移测定法进行定量（*，第页< 0.01). 如有指示，将VEGF（10 ng/ml）添加到下腔，并在两个腔中添加SU5416。误差条表示3个复制实验的标准误差。b）显微照片显示体外VEGF（10 ng/ml）在转染siRNAs或转导编码慢病毒载体的HMVE细胞中诱导试管形成GATA2协议或TFII-I型单独或组合使用。
然后我们研究了在ECM凝胶（Matrigel）中培养的HMVE细胞形成毛细血管的过程，这种凝胶的灵活性在一定程度上支持了血管生成。VEGF以剂量依赖的方式刺激试管形成，而bFGF和PDGF无效，并且VEGF的作用被SU5416抑制(补充图S8b).GATA2协议击倒和TFII-I型过度表达抑制了VEGF刺激的毛细血管发育，并且再次击倒或过度表达这两种转录因子同时抵消了这些作用(,补充图S8c).TFII-I型击倒或GATA2协议单独的过表达对试管的形成没有产生显著的影响，显然是因为它在这些条件下已经得到了最佳的刺激(); 敲除或过度表达p190 RhoGAP（Rho间隙）也没有改变管子的形成(补充图S8d). 因此，GATA2和TFII-I在血管内皮生长因子2转录转化为毛细血管细胞行为的生物相关变化，这是形成3D毛细血管网络所必需的。
体内血管生成的控制
接下来我们研究了ECM力学是否控制血管形成体内使用改良的Matrigel植入物分析。与或多或少刚性凝胶（分别为900或700 Pa）中的细胞相比，中等硬度（800 Pa）的Matrigel中观察到最大水平的细胞浸润、毛细血管形成和VEGFR2表达(和补充图S9a、b). VEGFR2、GATA2和TFII-I均位于CD31-阳性微血管衬层细胞内(补充图S9c). 血管生成所需的最佳ECM刚度体内（800 Pa）与观察到的不同体外（4000 Pa）可能是由于细胞在2D ECM上培养与在3D ECM凝胶中培养时的不同要求；这也可能与Matrigel是如何随着时间的推移而重塑的有关体内.
基质弹性通过TFII-I和GATA2控制血管形成体内浅色（H和E染色）（a，b顶部），免疫荧光显微照片（a，b底部）和每个高功率场的容器密度（c、d）在小鼠体内植入不同弹性的Matrigel 7天后，显示细胞浸润和VEGFR2表达（a、c）或使用TFII-I型或加塔2siRNA（b、d）（巴，25μm）。VEGFR2阳性血管的数量被标准化为700Pa凝胶中的血管数量（c）和用对照siRNA处理的凝胶中的（d）（n=6，平均值±S.E.M.，*，第页< 0.01).
接下来，我们在体内基质分析。有趣的是，TFII-I型敲除增加了软凝胶中细胞的细胞浸润、毛细血管形成和VEGFR2表达，因此它模拟了细胞在中等硬度凝胶上的行为，而加塔2击倒产生了相反的效果(和补充图S10a)、和p190 RhoGAP（Rho间隙）击倒也增加了软凝胶中的血管形成水平(补充图S10b). 这些结果表明，TFII-I、GATA2和p190RhoGAP介导ECM机制对血管形成的信号作用体内.
为了明确证实TFII-I、GATA2和p190RhoGAP之间调节相互作用的功能和临床相关性，我们调节了它们在新生鼠视网膜中的表达，因为生长器官中的血管生成受到VEGF及其受体的严格调节14,35,36TFII-I、GATA2和VEGFR2定位于出生后第15天小鼠血管所在的视网膜的三层(补充图S11a，b). 与一致体外数据，敲入TFII-I型将siRNA玻璃体内注射到p14小鼠后素食者2视网膜中的表达和高度扭曲扩张血管的出现以及血管密度的显著增加，而加塔2击倒被抑制素食主义者2表达、破坏毛细血管网络形成和降低血管密度(,补充图S12a，b). 击倒p190菱形间隙也增加了素食者2表达和血管密度，但它导致毛细血管生长模式略有不同，部分原因可能是它对血管通透性的已知影响37(和补充图S12a，b). 在含有快速生长微血管的早期（P5）视网膜中也观察到类似的效果(补充图S13). 此外TFII-I型和GATA2协议对P14视网膜的血管密度产生相反的影响，这两种因子同时过度表达消除了这些影响，证实了体外调查结果(和补充图S12c). 击倒p190 RhoGAP（Rho间隙）或TFII-I型没有显著变化素食主义者视网膜中的表达水平，而加塔2击倒增加（而不是减少）了它的表达(补充图S12d). 减少素食者2表达似乎足以消除这一点素食主义者中的响应加塔2击倒视网膜，从而抑制血管生成。因此，p190RhoGAP控件素食者2通过调节TFII-I和GATA2活性之间的平衡，使TFII-I活性占主导地位（和素食者2表达被抑制）。
TFII-I、GATA2和p190RhoGAP调节视网膜血管形成体内a）共聚焦荧光显微照片显示对照小鼠眼睛与转染Alexa 594-isolectin的眼睛视网膜中血管的投影图像TFII-I型,加塔2，或p190 RhoGAP（Rho间隙）siRNA（巴=0.1毫米）。b）共聚焦荧光显微照片显示对照小鼠眼睛视网膜中Alexa 594-isolectin染色的血管投影图像与过度表达的眼睛对比TFII-I型或GATA2协议，单独使用或两者结合使用（bar=0.1 mm）。
讨论
转录因子在发育过程中以时空方式改变其活性，从而指定细胞命运38,39在这里，我们发现p190RhoGAP，它被证明受生长因子、ECM结合和细胞骨架畸变的调节，也控制血管内皮生长因子2表达和血管生成体外和体内通过改变两种相互拮抗的转录因子TFII-I和GATA2之间的平衡(补充图S1). 此外，我们证明p190RhoGAP和这种下游转录控制机制是由ECM弹性变化所传递的机械信号控制的。这种机制类似于造血细胞和乳腺上皮使用的其他发育机制38-40 28; 然而，这是首次证明转录交叉拮抗可以控制组织分化和组织形态发生，并对机械和化学信号敏感。
我们的数据表明，可能需要适当水平的ECM刚度才能达到最佳血管内皮生长因子2表达与血管发育体外和体内事实上，不同细胞类型的命运对不同的ECM弹性值非常敏感，这些值通常与宿主组织显示的值相匹配41ECM机制的局部突变也伴随着活组织中功能性毛细血管网络在活跃生长和静态分化之间的转换42细胞趋圆通过改变p190RhoGAP与细胞骨架蛋白的结合，在1至2小时内抑制其活性16类似的基于细胞骨架的效应可以调节ECM弹性对后期p190RhoGAP活性的影响，从而控制TFII-I:GATA2平衡和血管内皮生长因子2转录。由于VEGFR2在视网膜的神经元和内皮细胞中都有表达，因此我们观察到的一些基因敲除效应可能并非毛细血管细胞所特有。但即使这些改变也可能与血管发育的控制有关，因为神经-血管相互作用对于正常的微血管功能和模式必不可少43.
总之，这些数据揭示了一种以前未知的机械敏感性信号通路，它控制血管内皮生长因子2启动子活性和表达，这代表了调节毛细血管形态发生的所有三类微环境信号的收敛点。因此，开发这种途径的特异性修饰物可以为各种血管生成依赖性疾病带来新的治疗方法，包括未来的增殖性视网膜病、关节炎和癌症。
方法总结
的表达式TFII-I型,GATA2协议、和血管内皮生长因子2用qRT-PCR和免疫印迹法进行评价。荧光素酶报告试验用于测量血管内皮生长因子2启动子活性。测试TFII-I和GATA2对血管内皮生长因子2表达与血管生成体外在HMVE细胞中进行siRNA介导的敲除或慢病毒转导。体外使用Transwell迁移和Matrigel管形成分析进行血管生成分析，使用天然和生长因子减少型Matrigel获得类似结果。采用皮下Matrigel血管生成试验分析ECM机制对毛细血管形成的影响体内还研究了新生C57BL/6小鼠的视网膜血管形成，并通过玻璃体内注射siRNA或DNA到P5或P14的眼睛中来控制整个活体视网膜的基因表达。
方法
材料
抗-GATA2多克隆抗体来自Abcam（马萨诸塞州剑桥市）；来自Covance（新泽西州普林斯顿）的抗HA单克隆抗体；来自转导实验室（肯塔基州列克星敦）的抗TFII-I、p190RhoGAP、PECAM（CD31）和paxillin的单克隆抗体；来自Chemicon的抗GAPDH抗体（Temecula，CA）；来自Upstate（纽约州普莱西德湖）的抗层粘连单克隆抗体；来自细胞信号转导的抗VEGFR2抗体（Danvers，MA）；来自圣克鲁斯（加州圣克鲁斯）的抗myc抗体。蛋白质G-sepharose来自Amersham-Pharmacia（瑞典乌普萨拉），SU5416来自Calbiochem（加州圣地亚哥）。VEGF-A来自NIH；bFGF和PDGF分别来自Roche（瑞士巴塞尔）和Biovision（加州山景城）。细胞渗透性Rho抑制剂（C3外酶）来自细胞骨架（丹佛，CO）。在所有实验中，HMVE和HUVE细胞（Cambrex，Walkersville，MD）在含有5%FBS和生长因子（VEGF，bFGF和PDGF）的EBM2培养基中培养16除了使用含0.3%血清的EBM2进行核易位分析外。细胞被镀在塑料皿上进行分子生物化学分析，被镀在涂有纤维连接蛋白的玻璃盖玻片上进行细胞染色，但使用柔性底物的实验除外。
质粒构建与基因敲除
第GL3页-血管内皮生长因子2-225（-225+268）、-570（-570+268）、-780（-780+268）用来自HUVE细胞的基因组DNA通过逆转录（RT）-PCR构建，并在SacI/XhoI位点亚克隆到pGL3载体（Promega）中。对于pGL3-血管内皮生长因子2-780Inr-MUT，使用QuickChange突变试剂盒（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫纳）对Inr（CACT到GTGC）进行点突变。对于慢病毒构建，人类myc-TFII-I型（δ亚型），HA-GATA2型、和HA-p190RhoGAP型使用来自Open Biosystems（美国亚利桑那州亨茨维尔）和H.Sabe（日本大阪OBI）的模板质粒通过PCR构建。用于构建逆转录病毒，小鼠myc-TFII-I型（γ亚型）和HA-Gata2分别使用来自Open Biosystems和T.Nakano（日本大阪大阪大学）的模板质粒构建。为了生成小鼠TFII-I的δ亚型，从γ亚型中删除256-274和294-314aa。先前描述了组成活性RhoA的构建和病毒载体的产生37对于基因敲除，按照所述进行siRNA转染16.siRNA序列如所示补充表S1.
生物化学方法
对于荧光素酶报告检测，使用Superfect（QIAGEN）转染HUVE细胞，并使用双荧光素酶报告检测试剂盒（Promega）进行检测。使用光度计（TD20/20，Turner Designs）重复测量荧光素酶活性。使用核提取试剂盒（Chemicon）制备细胞质和核细胞提取物。
分子生物学方法
使用Quantitect SYBR Green RT-PCR试剂盒（QIAGEN），使用ABI7300实时PCR系统（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行定量RT-PCR；β2微球蛋白或亲环素控制cDNA含量。使用的引物如所示补充表S2对于ChIP分析，转染对照或TFII-I型根据制造商说明（Active Motif），用GATA2抗体或对照免疫球蛋白免疫沉淀siRNA（Jackson ImmunoResearch），反之亦然。用5′-GTAAAATGGGCTTGGGAGCTG-3′和5′-GGCGGCTGCAGGGCGTCT-3&prime；引物扩增GATA2-和TFII-I-结合区；。
细胞分析方法
如前所述制备柔性聚丙烯酰胺凝胶培养基34,44并涂有纤维连接蛋白（1μg/cm2). 通过改变丙烯酰胺（2–4%）和双丙烯酰胺（0.1–0.5%）的浓度来控制基底的柔韧性；杨氏模量（刚度）的测定如下所述45HMVE细胞在凝胶上培养6小时，并用Leica SP2共聚焦显微镜进行免疫染色和分析15对于细胞迁移分析，Transwell膜（Coster，NY）涂有0.5%明胶，细胞接种（105细胞/100μl）与0.3%的FBS/EBM2混合。16h后用Giemsa溶液对细胞进行染色，并在10个随机域（×400）中计数。对于体外血管生成试验，HMVE细胞（104细胞/150μl EBM-2）被镀在MatrigelTM（BD biosciences）上，并在VEGF（10 ng/ml）存在下培养12-16小时；在10个随机场（4×）中评估试管形成。
体内基质植入试验
所有动物研究均由波士顿儿童医院动物护理和使用委员会审查和批准。将不同弹性的基质塞铸入4×4mm（ID×H）聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具中，37℃孵育过夜，然后将其皮下植入C57BL/6小鼠背部。通过使用微生物谷氨酰胺转胺酶改变ECM蛋白交联，Matrigel的硬度在窄范围内（即，不使其变硬）进行调节（2.5-20 U/g；日本味之素）46使用AR-G2流变仪（TA Instruments），使用标准20mm铝平行板（1Hz，1%应变，37°C）测量凝胶的储存模量（G′）。等效聚丙烯酰胺凝胶的杨氏模量通过E=2*G′（1+ν）计算，平均泊松比（ν）为0.5。7天后，收集、固定并冷冻切片含有凝胶塞的PDMS模具。按照说明进行H&E染色和免疫染色15 47。使用Velocity4.4（Improvision，PerkinElmer）编辑光学切片（20μm厚）堆叠，形成3D图像。通过计算注射到尾静脉或5个不同区域（n=6）的VEGFR2中荧光结合ConA染色阳性的血管数量来评估血管形成，通过DAPI染色鉴定单个细胞核。细胞回收液（BD Biosciences）用于从回收的Matrigel塞中收集细胞。在一些研究中，将siRNA（7μg）混合到Matrigel中，并在3天后将10μg额外的siRNA注射到植入的Matrigel中（n=6）；同样数量的干扰siRNA被用作对照。通过计算在五个不同区域表达每个基因的细胞数量来评估基因敲除。
视网膜血管形成的体内分析
对于活体视网膜中的基因敲除，将每个基因的siRNA（0.5μg）在P5或P14处玻璃体内注射到C57BL/6小鼠的一只眼睛中，并将相同数量的对照siRNA注射到另一只眼睛。为了过度表达基因TFII-I型和/或GATA2协议将jetPEI转染试剂（Polyplus转染，CA）注射到P14处的眼睛。注射后2天，使用平贴、荧光素偶联的isolectin染色和免疫组织化学分析评估视网膜中的血管网络形成（n=7）。纯化视网膜RNA，并使用qRT-PCR定量基因表达（n=7）。使用Adobe photoshop对血管密度进行量化。
致谢
我们感谢T.Polte、E.Pravda、M.de Bruijn和K.Johnson的技术建议和帮助，感谢T.Nakano和H.Sabe提供质粒，感谢NIH提供VEGF，感谢D.Weitz在流变学测量方面提供帮助。这项工作得到了NIH（给D.E.I.、L.E.H.S.和K.M.C.）、V.Kann Rasmussen基金会（给L.E.H.S）、儿童医院智障和发育障碍研究中心（给L.C.H.S.）、预防失明研究Lew Wasserman优秀奖（给L.E.H.S.的）、AHA（给a.M.）、，以及儿童医院院长发展奖（授予a.M.）；D.E.I.是国防部乳腺癌创新者奖的获得者。
脚注
作者贡献：A.M.构思了实验，并在K.M.C.、T.M.、C.W.Y.、D.H.、C.M.A.、G.M.、L.E.H.S.和D.E.I.A.M.的协助下进行了实验、设计研究和分析数据。A.M.与D.E.I.一起撰写了手稿，并由L.E.H.S提供输入。
工具书类
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