Lim-HD蛋白Lhx9和Lhx1对背侧中间神经元轴突导向和分类的转录控制

dI1轴突的轴突投射

dI1神经元产生两个亚群，它们的细胞位置、轴突投射和Lim-HD蛋白的转录不同：dI1_通信群体，位于背侧神经管，更多位于腹侧/内侧，向底板投射轴突并穿过底板；和dI1_{智能电源接口}位于腹侧/外侧位置的种群，其轴突向同侧投射。在Lim HD蛋白Lhx2和Lhx9的转录中，分裂为两个亚群也是明显的。dI1型_通信神经元表达Lhx2_高的和Lhx9_低的，而dI1_{智能电源接口}神经元表达Lhx9[16,28].

利用电穿孔神经管的开本制剂，在E6研究了神经管内dI1神经元的轴突投射模式。在EdI1增强子的控制下，用GFP标记的dI1神经元以正反方向投射轴突（图3A、B). 对10个胚胎的神经管进行了分析，得出了类似的轴突模式（表​（表1）。1). 对侧突出的轴突横穿底板，在脑室索（VF）处沿底板旋转并伸长数段。随后，它们沿对角线和横向偏离底板（图3A、A2、A3). 在侧索（LF），dI1_通信轴突转向吻侧，同时汇聚成纵向束。在颈部，仅在左前可见纵向筋膜。对侧心室纤维性颤动的轴突全部转向左前。dI1型_{智能电源接口}轴突在左前（图3A、A4、A5). 在骶骨水平，很少能看到尾部突出的轴突（图3A、A1、A3，洋红色箭头）。对对侧骶骨水平的尾部与嘴侧投射轴突的数量进行计分。12.5±4.4%（n=6）的轴突尾侧转。然而，不能排除的是，除E6外，更多的骶部dI1神经元也将其轴突投射到尾部，或者，也可能被消除。

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图3

dI1神经元的轴突投射模式.（A）在第16阶段（左侧）用EdI1增强子和Cre依赖性GFP质粒（EdI1:：Cre+pCAGG-LoxP-STOP-LoxP-GFP）电穿孔鸡胚。在E6，脊髓被移除、固定并作为开卷准备进行分析。完整的神经管（骶骨至颈椎）。使用Photoshop软件拍摄共焦图像并进行照片融合。（B）该示意图说明了dI1神经元群的轴突投射模式。Rostral出现在图片和示意图中。星号代表四肢的水平。dI1神经元有两条主要的吻侧轴突投射通路（A）：同侧（A4、A5、黄色箭头）和对侧（A、A2、A3、白色箭头和箭头）。穿过底板（FP）后，dI1_通信神经元沿着腹索（VF；白色箭头）的底板伸长数段，随后转向外侧索（LF；白色箭头。dI1型_{智能电源接口}轴突在腰椎、胸椎和颈椎水平（A、A4、A5）的左前侧纵向和头向旋转。骶尾部水平dI1_{智能电源接口}轴突向尾部突出（A、A1、洋红色箭头）。（C、D）dI1的相对位置_同侧和dI1_通信在对dI1进行差异标记后，研究了LF处的筋膜_{智能电源接口}和dI1_通信轴突。在LF，dI1_{智能电源接口}和dI1_通信形成一个束（（D）中的绿色+红色箭头）。（E）示意图，方框区域表示（C，D）的框架。（E）中仅显示了头向旋转的轴突。c、 宫颈水平；b、 臂水平；FP，地板；l、 腰椎水平，s，骶骨水平；t、 胸部水平。比例尺：150μm（A，D）；100μm（A1–A5）；300微米（C）。

纵向dI1的位置_{智能电源接口}和dI1_通信沿着背侧/腹侧轴的LF处的束状突起看起来相似。因此，可以想象dI1_通信神经管一侧的轴突和dI1_{智能电源接口}另一侧的轴突束在一起。为了验证这个假设，GFP或taumyc分别在神经管的两半表达（见材料和方法）。dI1的投影_通信朝向dI1的GFP阳性轴突_{智能电源接口}检查了牛磺酸轴突（图3C、D、E). dI1型_通信轴突斜向dI1_{智能电源接口}捆绑。当他们联系dI1时_{智能电源接口}束，dI1_通信用dI1束状的轴突_{智能电源接口}然后转过头（图​（图3D）。三维). 因此，dI1之间的亲同相互作用_通信和dI1_{智能电源接口}可能促进dI1的轴突转向_通信在LF。

dI2神经元的轴突投射

Ngn1增强子先前用于标记转基因小鼠中dI2神经元的轴突。交叉切片和开卷准备证明dI2神经元将轴突投射到地板上[17,20,27]. 然而，报告基因的双对称表达排除了dI2轴突轨迹的详细绘图。

利用三种范式研究了dI2轴突的轴突线索：EdI2/V1增强子-V1神经元仅在同侧投射轴突[29,30]因此，EdI2/V1增强子可用于研究dI2神经元（六个胚胎；表​表1）；1); 当使用dI1/2增强子时，Ed1/2增强器与dI1轴突模式的差异可归因于dI2神经元（四个胚胎；表​表1）；1); EdI2/V1和EdI1/2增强子的分子交叉-我们设计了一种方法，能够标记共同表达上述增强子（四个胚胎；表​表11).

在EdI2/V1的控制下，鸡神经管中GFP的单侧表达表明，dI2神经元在对侧有两种不同的轴突投射模式（图​（图4A，4A级，表​表1）。1). 在胸部水平的三分之二的吻侧以及肱颈水平，dI2轴突向底板生长并穿过底板。在底板的对侧，轴突正向旋转（dI2_罗斯特; 图4A、A3). 与dI1相同_通信轴突，dI2_罗斯特轴突沿着底板伸长几段，随后在白质中横向和对角转动，并在LF处束状（图​（图4A）。4A级). dI2轴突在腰椎和骶骨的尾部，以镜像模式向尾部转向头部突出的轴突（dI2_根). 具体地说，它们朝着底板腹侧生长，在底板的对侧尾端转向（图4A、A1). 然后，它们横向转动，形成dI2_根在对侧LF的束。沿着胸椎水平的三分之一尾侧，可见尾侧和吻侧突出的轴突混合，在对侧形成交叉模式（图4A、A2). 当使用dI1/2增强子时，观察到类似的对侧轴突通路（图​（图4B）：4B类)：吻侧（图4B、B3)，交叉（图4B、B2)和尾侧（图4B、B1). 由于dI1神经元不在尾部投射，因此利用dI1/2增强子可以看到的尾部投射归因于dI2神经元。

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图4

对侧投射dI2神经元的轴突投射模式.在第16阶段（左侧）用电穿孔法对鸡胚胎进行电穿孔（A）EdI2/V1和（B）EdI1/2增强子和Cre依赖性GFP质粒（EdI2/V1:：Cre或EdI1/2：：Cre+pCAGG-LoxP-STOP-LoxP-GFP）。在E6，脊髓被移除、固定并作为开卷准备进行分析。展示了整个神经管（骶骨至颈部）。使用Photoshop软件拍摄共焦图像并进行照片融合。Rostral出现在图片和示意图中。对侧骶骨水平dI2_根轴突向尾部转动（A、A1、B、B1、品红色箭头）；在胸椎尾侧水平，轴突要么向尾侧，要么向头侧旋转，形成交叉模式（a、A2、B、B2、白色和洋红色交叉箭头）。在胸部水平的头端三分之二处，肱骨和颈部水平dI2_罗斯特轴突向吻侧旋转（A、A3、B、B3、白色箭头）。在骶骨和颈部，轴突从腹索（VF）转向侧索（LF）（A、A1、A3、B）。c、 宫颈水平；b、 肱平面；FP，地板；l、 腰椎水平，s，骶骨水平；t、 胸部水平。星号代表四肢的高度。比例尺：200μm（A）；50微米（A1–A3）；150微米（B）；30微米（B1–B3）。

dI2+V1神经元或dI2+dI1分别利用EdI2/V1和EdI1/2增强子的共同表达，排除了同侧投射轴突的识别。为了单独标记dI2神经元，采用了增强子交叉技术。EdI2/V1和EdI1/2增强子并非仅限于dI2神经元；然而，它们的交叉发生在dI2神经元中。为了标记共表达EdI2/V1和EdI1/2增强子的神经元，我们结合了Cre/LoxP和Gal4/UAS系统。Cre在EdI1/2增强子下表达，Gal4在EdI2/V1增强子上表达。报告质粒包含Gal4和Cre双重控制下的GFP（UAS-LoxP-STOP-LoxP-GFP；有关更多详细信息，请参阅材料和方法）。EdI1/2和EdI2/V1增强子交叉的GFP表达神经元为Lhx1/5⁺/Pax2（帕克斯）^-（100%，n=22；图​图2F），2楼)，Pax2^-/En1型^-（100%，n=18；图​图2G）2G（2G）)和Lhx2/9^-/岛屿1^-（100%，n=29；图​图2H）。2小时). 因此，它们是dI2神经元。

使用E6开卷标本研究了同侧和对侧dI2神经元的轴突通路（图​（图5）。5). 用交叉技术标记的dI2连合轴突的轴突模式与EdI2/V1和EdI1/2增强子观察到的模式相似（图​（图4）。4). 即dI2_罗斯特轴突从胸廓三分之二的吻侧向吻侧旋转（图5A、A4)在胸部水平的三分之一处，在头部或尾部（图5A、A2、A3)和dI2_根轴突从后肢水平向后翻转（图5A、A1). 由于对侧dI2神经元的轴突丰富，很难估计每一水平的尾侧和吻侧转向程度。然而，对几个神经管的检查表明，颈部绝大多数神经元为dI2_罗斯特（附加文件2年)在骶骨水平是dI2_根（附加文件2B型).

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图5

dI2神经元的轴突投射模式.（A、B）在第16阶段用三种质粒电穿孔鸡胚胎：dI1/2:：Cre、dI2/V1:：Gal4和UAS:：LoxP-STOP-LoxP-GFP。示意图（B）说明了dI2神经元群的轴突投射模式。在对侧骶骨和腰椎水平，dI2_根轴突转向尾部（A，A1，洋红色箭头）。在对侧的尾侧胸椎水平，明显可见轴突的交叉模式，即向头侧或向尾侧旋转（a、A2、A3、白色和洋红色交叉箭头）。在头胸部水平和颈部水平，dI2_名册轴突向吻侧旋转（A，A4，白色箭头）。沿着整个纵轴，dI2轴突最初在对侧腹索（VF；a、A1、A2中的箭头）形成束，随后轴突转向侧索（LF；a、A4）。在同侧只有少数轴突纵向投射（A5，黄色箭头）。大多数轴突向底板生长（A，A6）。c、 宫颈水平；b、 肱平面；FP，地板；l、 腰椎水平，s，骶骨水平；t、 胸部水平。星号代表四肢的水平。比例尺：150μm（A）；75微米（A1、A2、A4、A6）；35微米（A3、A5）。

在同侧，可见少量纵向突出的轴突（图​（图5A，5A级，A5中的黄色箭头；其他文件2年). 大多数轴突沿圆周向底板突出（图5A、A6; 其他文件三). 在VF或LF处均未观察到纵向轨迹。为了估计dI2神经元的同侧和对侧轴突选择的比率，对同侧/对侧轴轴突在颈部的范围进行了评分。在这个水平上，同侧没有标记细胞体。只有一根神经管（n=4）在颈部同侧可见纵向投射的轴突（附加文件三). 在神经管中，同侧和对侧轴突的比率为8.6%。因此，dI2神经元主要有连合轴突，根据其沿纵轴的位置，这些轴突可以纵向伸长，也可以纵向伸长。

Lim HD交叉抑制

在运动神经元中，Isl1和Lhx1之间的相互交叉抑制确保了LMC亚群之间的清晰边界[4]. 不同的细胞边界（图​（图11和​和2）2)提示类似的Lim-HD机制可能是dI亚分化的原因。为了测试dI1和dI2神经元的Lim-HD编码是否通过交叉阻遏得以维持，每个Lim-HD在鸡半管的第19阶段被均匀表达（图​（图6）。6). 测量电穿孔神经元中dI倒数神经元共表达异位Lim-HD蛋白和内源性Lim-HD蛋白质的神经元比例。在用nGFP电穿孔的神经管中，96%的电穿孔dI1神经元共同表达nGFP和Lhx2/9，98%的dI2神经元共同表达n GFP和L hx1（图6C、D). Lhx9的异位表达导致共同表达Lhx8和Lhx1的神经元数量显著减少（图​（图6A）。6A级). 只有15.76%的Lhx9和Lhx1共同表达（图​（图6C）。6厘米). 同样，Lhx1影响了Lhx9蛋白表达的类似减少（图​（图6B）。6亿). 异位Lhx1导致16.7%的神经元与Lhx9共表达​（图6D第6天).

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图6

Lhx9和Lhx1相互抑制.（A、C）Lhx9和（B、D）克隆于pCIG质粒中的Lhx1在第19阶段被电穿孔到鸡神经管中。在E4，胚胎被固定并用同源Lim-HD蛋白的抗体（Ab）染色。Lhx1/5（A）在Lhx9异位表达后显著减少。Lhx1异位表达导致Lhx2/9（B）降低。对于定量（C，D），表达异位Lim-HD（Lim-HD）的dIx特异性神经元之间的比率^外太空的)加上他们自己的Lim-HD（Lim^x)并给出了电穿孔dIx神经元的总数。共表达Lim的神经元^外太空的和Lim^x是核GFP（nGFP）+/Lim^x+. 为了估计电穿孔dIx神经元的总数，nGFP-/Lim的数量^x+从Lim的数量中减去电穿孔侧的神经元^x+控制侧的神经元。商加上nGFP+/Lim的数量^x+等于电穿孔dIx神经元的数量。比例尺：200μm。

交叉表达可能由细胞命运的改变引起。因此，Lhx9或Lhx1的异位表达可能分别决定dI1和dI2的命运，从而导致相互作用的Lim-HD蛋白的下调。然而，在相对较晚的阶段（第19阶段）抑制的能力表明，交叉抑制可以在有丝分裂后细胞中介导，而不会影响细胞命运。在Lhx9和Lhx1异位表达后，研究dI1/2细胞命运标记的表达。dI2神经元表达Foxd3。Lhx1异位表达后Foxd3的表达没有上调（图7A、B). 因此，Lhx1不足以强加dI2细胞命运的完整范围。

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图7

Lhx9和Lhx1不会改变dI细胞的命运.现场dI-特异基因杂交狐狸3（dI2），以及长x2和Atoh1号机组（dI1）在用电穿孔的胚胎切片上进行（A、B）Lhx1-IRES-GFP，（C、D）Lhx9-IRES-nGFP和（E-H）Lhx9-IRES-GFP。相邻切片用于GFP检测（A、E、G）和就地杂交（B、F、H）。或者，通过抗体染色和就地在同一玻片上进行杂交（C，D）。Lhx1的异位表达不会激活福克斯D3（A、B）。Lhx9的异位表达下调Lhx2（C，D）和Atoh1（E，F）的表达，而不影响Foxd3的表达（G，H）。箭头指向dI2神经元（B，H）和dI1神经元（D，F）。箭头指向V1神经元（B，H）。比例尺：150μm。

利用Lhx9异位表达后Lhx2的表达来研究dI1细胞的命运获得。表达Lhx9的神经元下调Lhx2的表达（图7C、D)表明dI1的分离_{智能电源接口}神经元，表达Lhx9和dI1_通信神经元，表达Lhx2_高的/长x 9_低的，由Lhx9和Lhx2之间的交叉抑制介导。通过Lhx2的异位表达（YH和AS，数据未显示），Lhx9的相互下调支持了这一假设。Atoh1在dI1前体神经元中表达，在分化后的dI1神经元中表达下调。Lhx9的异位表达导致Atoh1的下调（图7E、F)表明Lhx9在有丝分裂后dI1神经元上调时是Atoh1的阻遏物。巴尔勒1/2基因在啮齿动物dI1神经元中表达[31]. 然而，鸡基因组中不存在同源基因。由于缺乏有丝分裂后dI1标记，研究了Lhx9异位表达后dI2细胞命运的可能抑制。Foxd3在表达Lhx9的神经元中不受抑制（图7G，高). 因此Lhx9不足以抑制dI2细胞的命运。因此，Lhx9和Lhx1相互抑制，而不改变细胞命运的完整范围。然而，Lhx9和Lhx1可能控制分化dI神经元的某些特征。以下实验研究了Lhx9和Lhx1在轴突导向中的作用。

通过异位表达改变dI1和dI2神经元的Lim-HD编码-一般考虑

在互惠的Lim-HD基因异位表达后内源性Lim-HD的抑制导致Lim-HD代码的替换。为了研究Lim-HD编码在dI1和dI2神经元轴突投射模式分配中的作用，交替使用它们的Lim-HD码。在随后的异位表达实验中，考虑了以下因素。首先，为了研究细胞自主效应，利用EdI增强子（dI2为Lhx9，dI1为Lhx1）在相互作用的dI神经元中特异性表达Lim-HD蛋白。其次，为了追踪操纵神经元的轴突轨迹，将taumyc或GFP与来自同一质粒的异位Lim-HD蛋白共同表达。第三，Lim HD的异位表达可能导致细胞特性的改变，随后导致其自身的下调。例如，利用EdI2/V1增强子在dI2中表达的Lhx9可能上调某些dI1特征，最终导致EdI2/V1增强子下调。稳定的Cre/Lox系统用于稳定异位表达。第四，异位表达可能导致外源蛋白水平的高水平非生理水平。将异位Lhx9水平与内源性Lhx2和Lhx8水平（神经管非电穿孔侧）进行比较。利用Cre/Lox系统，外源性和内源性Lhx9水平相似（附加文件4).

Lhx1控制尾旋

Lhx1控制LMCl轴突向后肢的投射。外周表达Lhx1的LMC神经元位于外侧LMC并将其轴突投射到后肢[4]. 为了测试Lhx1是否也可以控制dI2神经元的轴突投射，将其在dI1神经元中体外表达。EdI1增强子驱动Cre重组酶，与Lhx1/taumyc-Cre条件质粒（pCAGG-LoxP-STOP-LoxP-Lhx1-IRES-taumyc；图​图8；8; 表​表11).

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图8

Lhx1使尾侧轴突投射到尾侧dI1_通信神经元.（A、B）Lhx1和taumyc在dI1神经元中异位表达，利用Cre/lox系统和EdI1增强子（EdI1：：Cre+PCGG-OxP-STOP-OxP-Lhx1-IRES-taumyc）。以下dI2特异性轴突线索由连合dI1假定^长x1神经元：在腰骶部水平dI1^长x1轴突向尾侧旋转（A，A1）；在胸椎水平，轴突要么向前或向后转动，形成交叉模式（a，A2）；在颈部，轴突向头侧旋转（A，A3）。dI1表型的图示^长x1表外表达神经元见（B）。c、 宫颈水平；b、 肱平面；FP，地板；l、 腰椎水平，s，骶骨水平；t、 胸部水平。星号代表四肢的水平。白色箭头指向头部突出的轴突。洋红色箭头指向尾部突出的轴突。交叉箭头指向交叉轴突模式。箭头指向纵向同侧轴突。比例尺：150μm（A）；75微米（A1–A3）。

连合dI1和dI2轴突模式在两个方面不同（图​（图3，三,​,44和​和5）：5)：腰骶神经管中所有dI2_根轴突投射在尾部，而只有骶尾部dI1_{智能电源接口}轴突向尾部投射；在胸椎水平的三分之一尾侧，dI2轴突要么向前或向后旋转，在对侧形成“交叉”轴突模式，而dI1轴突_通信轴突只向吻侧转动。dI1神经元异位表达Lhx1的后果（dI1^长x1)重点研究了上述特征（图​（图8）。8). 腰骶部dI1^长x1轴突向尾部转动（图8A、A1). 在胸椎尾侧，神经管的对侧明显可见轴突的交叉模式，即向头侧或向尾侧旋转（图8A、A2). 因此，所有dI2_考德轴突特征由连合dI1假定^长x1神经元（图​（图8B8B类).

dI1的纵向轴突轨迹^长x1位于同侧（图​（图8A）。8安). 因此，Lhx1不抑制dI1的同侧投影_{智能电源接口}神经元。然而，dI1^长x1在ipsi-VF和ipsi-LF处观察到筋膜，而dI1_{智能电源接口}轴突只形成一个ipsi-LF束。同侧VF是V1轴突的特征[29]（图​（图4A），4A级)，也表示Lhx1。因此，Lhx1足以将dI2样和V1样轴突轨迹施加到dI1_通信和dI1_{智能电源接口}神经元。

Lhx9控制吻侧旋转

利用Cre/LoxP系统在dI2和V1神经元中表达Lhx9（EdI2/V1:：Cre+pCAGG-LoxP-STOP-LoxP-Lhx9-IRES-GFP；图​图9；9; 表​表1）。1). 对侧侧的dI2特异性轴突轨迹如下所述。表达Lhx9/GFP的dI2神经元（dI2^{长x 9})它们的轴突在头侧和尾侧投射，在尾神经管水平形成尾侧投射的筋膜（图9A、A1)之后是一个交叉模式和顶部突出的轴突（图9A、A2). 然而，尾侧、交叉和嘴侧投影之间的过渡点已向尾侧移动。野生型dI2轴突从腰椎水平向尾部转动，而dI2^{长x 9}轴突仅在骶尾部水平向尾部转动（图9A、A2). dI2轴突的交叉模式仅限于胸椎水平的尾侧三分之一，而dI2^{长x 9}轴突要么在吻骶水平形成交叉模式（六分之四胚胎），要么根本不形成（六分二胚胎）（图​（图9B）。9亿). 嘴侧转向仅限于嘴侧至胸椎水平尾端三分之一的水平，其尾端延伸至整个胸椎水平（六分之五胚胎），甚至延伸至腰椎水平（六个胚胎中有三个胚胎）（图​（图9B）。9亿). 因此，Lhx9似乎以牺牲尾侧转向为代价来激活吻侧转向（图​（图9C）。9摄氏度). Lhx2（四个胚胎；表​表1；1; 其他文件5)或Lhx2加Lhx9在dI2神经元中表达（一个胚胎；表​表1；1; 其他文件6). 因此，dI2^{长x 9}轴突轨迹是dI1和dI2轴突线索的混合。而尾部突出的dI2较少^{长x 9}轴突比dI2轴突，尾部突出的轴突仍然比dI1轴突更常见。

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图9

Lhx9介导dI2轴突从尾侧到嘴侧的改变利用Cre/lox系统和EdI2/V1增强子（EdI2/V:：Cre+pCAGG-LoxP-STOP-LoxP-Lhx9-IRES-GFP）在dI2和V1神经元中体外表达Lhx9和GFP。（A）在骶尾部水平，连合dI2^{长x 9}轴突向尾部转动（A，A1）。在头骶水平，轴突向头侧和尾侧转动，形成交叉模式（a，A2）。罗斯特拉尔至腰椎dI2^{长x 9}轴突向吻侧旋转（A、A3、A4）。在底板（A，A4）的内侧和对侧，存在腹索（VF）的纵向束。（B）三个控制神经管（dI2）尾侧/吻侧轴突投射的示意图^GFP公司)和六个操纵的神经管（dI2^{长x 9}). 垂直线表示肢体的位置。（C）dI2表型示意图^{长x 9}轴突线索。c、 宫颈水平；b、 肱平面；FP，地板；l、 腰椎水平，s，骶骨水平；t、 胸部水平。星号表示肢体的高度。白色箭头指向头部突出的轴突。洋红色箭头指向尾部突出的轴突。交叉箭头指向交叉轴突模式。比例尺：200μm（A）；150微米（A1、A3–A5）；100微米（A2）。

dI轴突投射的多样性

特异性增强子的结合、利用Cre/LoxP和Gal4/UAS系统增强表达水平以及鸡电穿孔为破译基因定义的神经元组的轴突通路提供了快速有效的工具。新出现的画面是由dI1和dI2亚群引起的轴突线索的复杂分歧。dI1和dI2分别产生两个亚群，由轴突投射的方向确定。两个神经元群dI1+dI2和dI1的同时分子和空间限制标记_{智能电源接口}+dI1型_通信，强调了dI1和dI2轴突的轴突结构：dI1_{智能电源接口}和dI1_通信在LF处束在一起；左前叶dI1和dI2轴突轨迹分离。

先前使用diI注射绘制了脊髓肌腱的轴突通路[32-34]. Kadison和Kaprilian描述了交叉轴突的四个主要轴突投射：中间纵连合（ILC）、内侧纵连合、分叉纵连合和叉横连合[34]. ILC轴突以弓状方式向头侧移动，延伸至脊髓的心室颤动区域，然后在LF处第二次转向纵向平面。反向横向投射的dI1和dI2神经元以ILC模式投射轴突。MLC轴突沿心室颤动处的底板边界延伸超过100 mm，BLC轴突分叉为吻侧和尾侧突起，FTC轴突形成三齿状或叉状突起，在当前研究中未发现。当前研究中使用电穿孔范式实现的多个神经元标记可能会模糊这些投影模式。注射DiI后，观察到适量（10%）的交叉轴突向尾部方向延伸[34]. 然而，我们的研究指出有更多的尾部投射神经元。在骶骨水平dI1_{智能电源接口}和所有dI2_根轴突向尾部延伸。在腰部和胸部水平的尾部三分之一处，大约一半的dI2轴突向尾部突出。因此，尾侧投射明显从吻侧到尾侧逐步增加。将DiI注射到骶骨水平的神经元中可能会显示更多的尾部投射轴突。

轴突导向的转录控制

轴突生长沿同侧/对侧和尾侧/吻侧轴的差异可能源于转录因子的细胞类型特异性表达。即dI1_通信和dI2_通信理论上，基因可以在反向投射的dI1中表达_通信和dI2神经元。这种机制的一个可能候选是Lhx2，它仅用dI1表示_通信神经元。然而，Lhx2和Lhx9的基因靶向实验表明，Lim-HD编码不能控制同侧与对侧轴突的投射[16]. 类似地，Lhx1在仅ipsi群体V1和相反群体dI2中表达。因此，Lhx1可能与dI2神经元对侧投射的控制无关。或者，通用数据通信和同基因可能在所有的dIN中表达_通信和dIN_{智能电源接口}神经元。转录因子，如Unc4和NSCL1，在所有中间神经元中表达[35,36]仅连合基因的重叠模式TAG1（标签1）和机器人3，是控制决策机构委员会指导选择的候选对象。

类似的转录机制可能解释了尾侧和吻侧轴突的选择。转录代码可以区分纵向水平。因此d尾部在尾神经管表达长x1可能导致尾部突出。潜力dI音频和地层学这些因素可能是Hox蛋白。Hox编码决定运动神经元的头/尾身份，Hox和Lim-HD编码的组合决定运动神经元池的亚类化[37,38]. 尾部表达霍克斯10和霍克斯11基因可能赋予腰骶dI2神经元尾部转向，霍克斯8除此之外，可能会导致嘴部转向。尾胸交叉模式可能受以下因素控制霍克斯9+/霍克斯8-代码。Lhx1异位表达后，轴突投射的头端到尾端的变化可能使Lhx1成为Hoxcaudal公司基因霍克斯10和霍克斯11补充地，Lhx9可能通过抑制长x1和/或霍克斯10和霍克斯11表达式。或者，Lhx9可以抑制Hox10型和霍克斯11表达，Lhx1可能通过抑制其抑制物Lhx9来揭示Hox10和Hox11的活性。

什么样的轴突线索可能支配尾旋？由于轴突线索不同或对常见线索的反应不同，轴突可能转向不同的方向。我们的数据不支持差异线索理论。在胸椎尾侧水平，dI2轴突在相同的头/尾侧水平上，向头侧或尾侧转动。轴突方向性的转换可能由受体或将吸引力转换为排斥力的信号分子自主控制细胞。连合神经元沿底板的吻侧转向是通过增加尾侧到吻侧Wnt蛋白水平介导的[39]吸引轴突；并降低Shh的尾侧至嘴侧水平[40]排斥轴突。谨慎转动的神经元可能表达受体或信号分子，将Wnt吸引力转化为排斥和/或Shh排斥转化为吸引力。体外用Wnts和Shh攻击的尾侧dI2神经元的测定应阐明反应性的细胞自主变化是否支配背侧和尾侧转向。

细胞类型特异性表达策略

脊髓开卷准备

E6电穿孔鸡脊髓组织作为一种开本制剂，通过使用锋利的钨微针沿着顶板从后脑向下至尾部进行纵向切口来制备。然后将背根神经节（DRG）与脊髓分离，使底板保持完整。用木炭粉标记后肢和前肢，然后将脊髓从身体上分离出来，在室温下用4%多聚甲醛在磷酸盐缓冲盐水中固定1h，然后将组织展开，制成平板制剂。

免疫组织化学

胚胎在4%多聚甲醛/0.1M磷酸盐缓冲液中于4°C固定过夜，用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，在30%蔗糖/磷酸盐缓冲盐水中孵育24小时，并包埋在最佳切割温度溶液（OCT）中。在Superfrost Plus载玻片上收集冷冻切片（14μm），并保持在-70°C。抗原提取用于石蜡切片。切片在微波炉中用煮沸的10 mM柠檬酸（pH 6）处理10分钟。使用了以下抗体：兔多克隆GFP抗体（分子探针，美国俄勒冈州尤金）、Pax2（美国马萨诸塞州剑桥市Abcam）、myc（9E10）、Isl1（4D5）、Lhx1/5（4F2）、Engraided、Lhx2/9（兔血清）（均由美国纽约哥伦比亚大学T Jessell提供）。使用Cy2、RRX和cy5作为荧光色素。使用数码相机（DP70；奥林巴斯）或共焦显微镜（FV1000；奥林匹斯）在显微镜（Axioscope 2；Zeiss）下拍摄图像。

DNA

利用引物[ATGAGCTCATCCCTTTGCTCAC]和[ATGCTAGCGGTGTGTGGTGTGACAGCAG]从基因组小鼠DNA中通过PCR扩增EdI1增强子元件。利用引物[ATGAGCTCTCTCTGCCTACCTCCAGC]和[ATGCTAGCAACCTAGTGCCCTTGCACAC]扩增EdI2/V1。增强子被克隆到5'囊I/3’Nhe公司适当Cre和Gal4质粒的I位点[23]. 13G Ngn1增强子（EdI1/2）是利用引物[ATTGCGGCCGCATCAGGCCCGGATCACTTTG]和[GATCTAGACCTCACCATCGTTAACACTGG]通过PCR从小鼠基因组DNA中产生的，并克隆到5’不是I/3’Xba公司Cre质粒的I位点。小鸡Lhx2和Lhx9取自汤姆·杰塞尔。小鸡Lhx1取自阿图尔·卡尼亚。鸡Foxd3和Atoh1是从鸡表达序列标签测序项目中获得的[44].