肝脏再生

摘要

肝脏是一个有趣的器官，具有高再生能力和复杂的功能(Michalopoulos和DeFrances，1997年;Taub，2004年;米哈洛普洛斯和汗，2005c;Fausto等人，2006年). 肝脏通过门静脉接受小肠和大部分大肠以及脾脏和胰腺的所有流出循环。肝细胞（肝脏的主要功能细胞）独特的基因和蛋白质表达模式，使其具有抵抗有毒化学物质进入食物的生化防御功能，并作为被吸收食物成分的再加工者。进入肝脏的营养素转化为分泌蛋白（外周血中的白蛋白、大多数凝血因子、几种血浆载体蛋白等），脂类以脂蛋白的形式进入其他组织，碳水化合物储存在肝脏中作为糖原（用于稳定血液中葡萄糖水平的主要葡萄糖储备）。合成胆汁对脂肪和亲脂营养素的吸收至关重要。肝脏是血糖和氨水平的主要调节器，对大脑的最佳功能至关重要。肝功能的丧失会导致慢性“肝性脑病”，最终导致昏迷。进化事件赋予了肝脏惊人的再生能力，从而保护了肝脏对身体其他部分的广泛功能。这一过程使肝脏能够在不损害整个机体生存能力的情况下恢复失去的重量。从人类到鱼类，所有脊椎动物有机体都存在肝脏质量损失后的肝脏再生现象。当小动物（如狗）的肝脏移植到同一物种的大受体时，也会引发该病。在古代，普罗米修斯的神话和描绘祭祀动物伤痕累累的肝脏的泥桌图书馆都记录了这一点，并将其神话化，用于预测古代巴比伦和罗马的未来(Michalopoulos和DeFrances，1997年).

服用肝毒性化学物质（如四氯化碳）可导致肝质量下降。随后是清除组织碎片的炎症反应，然后是再生反应。然而，最常见的是通过外科手术来研究肝脏再生，该手术切除啮齿类动物（大鼠和小鼠）2/3的肝脏肿块，这种技术称为2/3部分肝切除术（PHx）(希金斯，1931年). 由于啮齿类动物肝脏的多叶结构，五个肝叶中的三个（占肝块的2/3）可以通过简单的手术切除，而不会对残留的两个肝叶造成任何组织损伤。后者的大小增加，以恢复与最初五个叶的质量相等的聚集。在大鼠和小鼠中，该过程在手术后5-7天内完成。PHx在质量去除方面的再现性以及随后事件顺序的计时精度使得PHx成为肝再生实验研究的首选方法。在临床上，为了切除孤立性肝转移瘤或修复创伤等，也可以在人类身上进行该手术。

PHx触发了一系列事件，这些事件以有序的方式进行，可以从最初的5分钟到5-7天进行观察。肝细胞是第一批进入DNA合成的细胞。2/3的PHx会留下剩余的1/3的肝细胞。它们经历了一轮DNA合成（导致60%的肝细胞），大鼠在24小时达到峰值，小鼠在36小时左右达到峰值（除非另有规定，本综述中提到的PHx后的时间将遵循老鼠，这是更具再现性的）。第二小部分细胞进入第二轮DNA合成，并建立起最初的肝细胞数量。DNA合成结束时出现的肝细胞小波凋亡表明，这是一种纠正再生反应过度激发的机制(Sakamoto等人，1999年). 肝细胞的增殖以有丝分裂波的形式从门脉周围向小叶中央周围推进(Rabes，1977年). 中央静脉周围的肝细胞（谷氨酰胺合成酶阳性(Gebhardt等人，2007年)是最后进行细胞复制的。胆道上皮细胞的增殖比肝细胞稍晚。内皮细胞在PHx后2-3天开始增殖，4-5天左右结束。星状细胞增殖的动力学尚未完全探索。星形细胞是起源于肌纤维母细胞的细胞，位于肝细胞周围，位于正弦细胞下方，产生细胞外基质和包括HGF在内的多种细胞因子，其基因表达模式与大脑星形细胞基本相似(Neubauer等人，1996年;Cassiman等人，2001年). 应该强调的是，丢失肝块的替换是通过成熟成人肝细胞和其他类型肝细胞的增殖介导的。它不是由选择性干细胞亚群（如皮肤和小肠）的增殖介导的。正常肝脏重量在5-7天（人类为8-15天）内恢复。再生结束时，肝小叶的大小明显增大，肝细胞板的厚度几乎是正常单细胞厚度的两倍(Michalopoulos和DeFrances，1997年). 以前的研究表明，在数周内，小叶发生缓慢的重组，最终肝脏组织学与原始组织学无法区分(Wagenaar等人，1993年).

广义的部分肝切除术是一种肝损伤，尽管它不会导致立即的组织学损伤。因此，毫不奇怪，肝再生过程中触发的信号通路与伤口愈合在其他组织中可见。与经典伤口愈合过程的不同之处在于，在肝脏中观察到的变化发生在整个器官（体内最大的单个器官！）上，并且一些信号可能部分来自外周循环。

2/3部分肝切除术后的血流动力学变化

在典型的伤口愈合场景中，组织损伤导致毛细血管网络破裂和血液外渗，并伴有凝血因子、血小板、生长因子等的局部释放(Schafer和Werner，2007年). 这显然不是2/3 PHx之后的情况。手术切除了三个肝叶，未损伤剩余的两个肝叶。尽管残余组织没有受损，但肝脏血流模式有很大变化。大量文献表明，PHx后的早期血流动力学变化很重要，即使没有全血外渗，PHx之后的血流动力学变化也会在整个肝脏引发一系列类似伤口愈合反应的事件。2/3 PHx后，单位肝组织血液供应的动脉成分没有变化；然而，每单位组织的门脉贡献是原来的三倍。门静脉继续输送肠、脾和胰腺的全部流出液。现在，整个流动需要穿过毛细管床，毛细管床的横截面在数学上降到原来的1/3。肝毛细血管具有开窗内皮细胞，其使血浆通过内皮细胞直接进入肝细胞。最近的一项研究表明，如果通过保持门静脉压力恒定来阻止这些变化，则HGF激活不足，肝细胞凋亡增加，即使PCNA核标记动力学似乎不受影响(Marubashi等人，2004年). 另一个需要更好理解的问题是PHx后肝血氧分压变化的潜在影响。门静脉血的氧浓度比动脉血低得多。PHx后单位肝组织门静脉血的相对增加应导致循环血中的氧压降低，可能触发缺氧反应。然而，最近的研究表明，肝脏中的缺氧可能通过与经典途径不同的途径进行调节，因为HIF1α在肝细胞核中未被识别，而是在过氧化物酶体和线粒体中被发现(Khan等人，2006年). 门静脉贡献量的三倍也应导致每个肝细胞中来源于肠和胰腺的生长因子和细胞因子的可用性在数学上增加三倍。这些因素包括胰岛素和表皮生长因子（EGF）、内毒素以及食物来源的营养素（氨基酸、脂质和碳水化合物）。总的来说，在肝再生的各个方面中，对血流动力学事件的重要性以及门静脉血与动脉血相对比例的变化的研究最少，也了解最少。然而，几乎有一个普遍的共识，即上述总体变化触发了对肝脏组织中信号通路的更好理解和更好研究的变化，如下所述。

PHx后肝脏发生的早期事件

PHx诱导100多个正常肝脏中未表达基因的快速诱导(Taub，1996年,2004). 这些基因与肝细胞进入细胞周期的准备性事件直接或间接相关。服务的功能有几个，其中许多基因（如IGFBP1）似乎发挥着重要作用。例如，IGFBP1缺陷小鼠的再生反应不足(Leu等人，2003年). 许多早期表达的基因在肝再生中的确切作用并不总是明确的，基因表达的早期变化应被视为既有助于肝细胞进入细胞周期，也有助于协调肝细胞必须进行的特定调整，以便它们能够在经历细胞增殖的同时提供所有必需的肝功能。鉴于95%以上的肝细胞在48小时内经历细胞增殖，令人惊讶的是，在再生过程中肝脏对全身的支持并没有明显减弱。最早观察到的生化变化之一是尿激酶纤溶酶原激活物（uPA）(图1). 这发生在残余叶的整个组织上。如伤口愈合的早期阶段所示(Kortlever和Bernards，2006年)早在PHx后5分钟，整个肝脏的uPA活性就开始增加(Mars等人，1995年). uPA的增加与上述血流动力学变化之间的关系尚不清楚，但有文献证明，在与湍流增加相关的机械应力作用下，包括内皮细胞在内的几种细胞类型中uPA增加(Sokabe等人，2004年). 因此，仅血管流动模式的改变就可能引发一些早期事件。uPA活性增加伴随着纤溶酶原纤溶酶（10分钟内）与纤维蛋白原降解产物的出现(Kim等人，1997年). 已知尿激酶可激活基质重塑在伤口愈合和肝脏再生过程中的大多数组织中都可见。细胞外基质的许多蛋白质都会发生转换(Kim等人，1997年). 金属蛋白酶9活化的第一证据(基质金属蛋白酶9)在PHx后30分钟和前24–48小时观察到(Kim等人，2000年). 来自伤口愈合和肿瘤生物学的研究表明，基质重塑通过整合素引起信号传递，并与具有信号传递能力的局部结合生长因子和肽的释放有关(Swindle等人，2001年). 虽然显微镜下可见肝脏中没有太多蛋白质基质，但肝细胞周围的细胞间隙中有大量的重糖基化蛋白质。肝中富含糖胺聚糖，肝素是一种较短的衍生物，因肝而得名（“肝素”）。肝再生过程中细胞外基质的整体调节是一个非常复杂的过程，涉及金属蛋白酶和金属蛋白酶组织抑制剂(穆罕默德和科哈，2005a). 肝细胞外基质结合许多生长因子。肝脏中基质结合生长因子中最突出的是肝细胞生长因子(HGF公司)(Masumoto和Yamamoto，1991年,1993). 与肝生物基质结合的非活性单链HGF在基质重塑过程中局部释放，并通过uPA激活为活性异二聚体形式(Mars等人，1993年,1995)（HGF与公认的uPA经典靶点纤溶酶原高度同源；HGF和纤溶酶元在其激活位点具有相同的一致序列（RVV））。激活的HGF在本地可用，但在循环中也会溢出(Lindroos等人，1991年). PHX后的前3小时内，由于血浆中的HGF增加了10到20倍，原有的非活性和活性HGF储存量迅速减少(Pediaditakis等人，2001年). 金属蛋白酶和TIMP水平在调节HGF的释放及其在再生过程中激活的有效性方面很重要(Mohammed等人，2005年b). 对培养肝细胞的研究表明，TNF可能通过诱导肝细胞表达MMP9而在这一过程中发挥作用(Haruyama等人，2000年). 总的来说，基质重塑是肝再生的一个非常重要的组成部分，MMP9基因消除的小鼠再生缺陷(Olle等人，2006年). 这些事件释放和激活HGF导致cMet在PHx后30–60分钟内激活(Stolz等人，1999年). PHx后不久（1小时内）局部和外周循环中释放的其他物质包括透明质酸（肝脏生物基质的主要成分）和转化生长因子β1(Michalopoulos和DeFrances，1997年). TGFβ1是已知的肝细胞有丝分裂抑制剂(Houck等人，1988年). 当受体TGFβR1在正常、非再生的肝脏中通过注射显性阴性DNA构建体而变得不活跃时，肝细胞的DNA合成显著增加(一川等人，2001年). 这表明TGFβ1（结合到核心蛋白）对基质结合生长因子的相反作用具有竞争性补益作用，使正常肝脏的肝细胞保持静止状态。PHx后的基质重塑显著改变了有丝分裂原和有丝分裂抑制剂之间的平衡，通过释放（局部和循环中）和激活HGF，同时在循环中大量释放TGF-β1，TGF-α-2-巨球蛋白(LaMarre等人，1991年). EGFR也以与cMet相同的动力学激活(Stolz等人，1999年). EGF通过十二指肠外分泌腺（布伦纳腺）产生的门脉循环不断地进入肝脏(Olsen等人，1985年). HGF和EGF受体激活的类似时间动力学表明，EGF现在针对较少的肝细胞，具有增强作用；或者EGFR对EGF更加敏感。独立研究表明，后者可能是正确的。去甲肾上腺素也增加外周循环，已知通过α-1肾上腺素能受体增强肝细胞培养中HGF和EGF受体的作用(克鲁斯等人，1985年). 阻断α-1受体抑制肝再生(克鲁斯等人，1987年). 其他研究也表明，Met和EGFR之间存在串扰，Met的激活可能会增强EGFR的激活(Jo等人，2000年). 循环中的浓度也在增加TNF公司(Yamada等人，1998年),胆汁酸(Huang等人，2006年),IL6（IL6）(Cressman等人，1996年)、和血清素(Lesurtel等人，2006年). 血浆中所有这些信号分子浓度的变化可能解释了以前的观察结果，即肝脏再生信号是由成对的抛物线大鼠的血液传递的(Moolten and Bucher，1967年)和移植肝组织碎片(Leong等人，1964年)或脂肪组织中分离的肝细胞(Jirtle和Michalopoulos，1982年)当原位肝脏进行部分肝切除时。

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图1

肝部分切除术后肝再生早期关键事件的年表。类似颜色方框内的事件属于同一类别（例如，绿色：生长因子相关事件；蓝色：血浆相关变化等）。每个方框的相关水平线描述了每个信号的开始和持续时间。

随着这些事件的展开外部对于肝细胞，许多事件正在发生里面细胞。β连环蛋白(Monga等人，2001年)和槽口-1细胞内结构域(Kohler等人，2004年)PHx后15-30分钟内出现在肝细胞核中。通过RNA干扰消除这些蛋白质的表达(Kohler等人，2004年)降低再生响应。PHx后1小时内，有证据表明状态3(克雷斯曼等人，1995年)和NFkB公司(FitzGerald等人，1995年;Yamada等人，1998年). 消除这两个信号分子中的任何一个都不会消除再生反应，可能是因为存在冗余的通路来补充蛋白质的损失（例如，Stat1承担Stat3的作用）(DeAngelis等人，2001年;Li等人，2002年). 然而，尽管有这些发现，Stat3和NFkB是许多细胞类型中与细胞周期事件相关的重要信号分子，它们在肝细胞中的早期激活无疑是导致增殖的信号通路的重要贡献。PHx后6小时，有明显证据表明细胞周期蛋白D1激活。氨基酸和TOR在这一过程中起调节作用(Nelsen等人，2003年). 在大鼠中，肝细胞中的第一轮DNA合成在PHx后12小时开始，在24小时出现DNA合成峰值。在小鼠中，这些事件在6–12小时后发生帧移(Michalopoulos和DeFrances，1997年). 在再生的前2至3天内，C/EBPα与C/EBPβ的比值降低，这一过程被认为是肝脏在此期间发生代谢变化的基础，例如脂质合成增强(Friedman等人，2004年). 对肝再生过程中运行的基因表达网络的分析揭示了依赖于生长因子和细胞因子的变化(Taub等人，1999年;怀特等人，2005年).

发生在PHx后0-5小时早期的事件通常被称为“启动注水” (福斯托，2000). 该术语很有用，因为它不仅表示与进入细胞周期的准备相关的事件，而且还表示肝细胞旨在修改基因表达模式以继续发挥其体内平衡功能的事件和策略。然而，“启动”也被用来表示事件发生仅由细胞因子诱导的时间，而生长因子诱导的事件发生在细胞因子介导的事件之后。然而，上述结果清楚地表明，没有分界点可以归因于仅由细胞因子或仅由生长因子诱导的单独事件。细胞因子和生长因子（见下文）的变化和作用的时间动力学是相互交织和同步的，例如，生长因子受体（Met和EGFR）的激活完全发生在PHx后30分钟内，类似于Stat3和NFkB的激活。PHx后前60分钟内发生的并发事件的部分列表如所示表1.

肝再生启动相关的有丝分裂信号

肝再生的一个关键终点是肝细胞总数和质量的恢复，肝细胞是肝脏的主要功能细胞，负责提供对身体内环境稳定至关重要的大部分肝功能。肝细胞是肝脏中第一个进入细胞周期并进行增殖的细胞，它们为其他类型的肝细胞产生有丝分裂信号(图2). 正常肝脏中静止的肝细胞表达多种生长因子受体。这些受体包括PDGF受体、VEGF、成纤维细胞生长因子受体、c-Kit，然而，对原代培养肝细胞的研究表明，尽管有许多促有丝分裂受体表达，但在化学定义的无血清培养基中，肝细胞仅有的促有丝素是HGF公司和EGFR配体(表皮生长因子、转化生长因子α,水飞蓟素，HB-EGF等）。这些配体是直接有丝分裂原在原代培养和克隆扩增中，它们在肝细胞中诱导强烈的有丝分裂反应(Block等人，1996年). FGF1和FGF2也是弱有丝分裂原(Houck等人，1990年). 当将HGF、EGF和TGFα单独注射到正常小鼠和大鼠体内时，也会诱导肝细胞增殖和肝脏增大(Bucher等人，1977年;Patijn等人，1998年). 然而，除了这些蛋白质外，还有其他物质虽然不能直接促肝细胞有丝分裂，但可以增强直接促有丝分裂原的作用。这些包括TNF公司(Webber等人，1998年),去甲肾上腺素(克鲁斯等人，1985年)和雌激素(Ni和Yager，1994年). 一些研究强调了这些物质的作用及其在肝脏再生过程中的表达动力学。最近的研究也集中在促再生效应补体成分、胆汁酸、和血清素，未知或未经测试具有直接或间接促有丝分裂作用的物质。当信号被消除时，上述一些信号分子的再生能力下降（例如HGF、TNF、IL6、胆汁酸、去甲肾上腺素、5-羟色胺）。其他人也受到牵连，因为它们在细胞培养或体内对肝细胞有丝分裂，并且在肝再生过程中其信号受体被激活（例如HGF和EGF）。我们将在下面简要描述与上述每个信号分子在肝脏再生中相关的主要证据。然而，总的来说，有两个重要的考虑因素：

1. 除了HGF/Met信号通路（见下文）之外，所有其他信号通路可能暂时抑制但不会阻止肝脏再生。除AAF等外源物质外，没有已知信号的缺失或存在会永久阻止肝脏再生。即使对肝脏进行高剂量辐射，也会发生再生（主要是通过增加肝细胞的大小(Michalopoulos和DeFrances，1997年).
2. 完全消除信号通路并不能完全消除肝再生，这并不意味着特定的信号通路并不重要肝部分切除术后早期发生的事件可能需要同时出现全部的迄今为止发现的细胞外信号。（准确的事件发生时间不仅在实验条件下很重要，在临床环境中也很重要，因为肝脏的快速再生会对机体产生“生死攸关”的影响）。

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图2

肝再生过程中不同肝细胞类型之间的信号相互作用。

考虑到这两个原则，目前已知的、与启动和维持肝再生有关的主要信号通路如下：

不同肝细胞类型在肝再生过程中的信号相互作用

在正常静止的肝脏中，不同类型的细胞之间有无数复杂的相互作用。一种全新的相互作用模式在肝脏再生的不同阶段被激活，其基础是产生具有旁分泌作用的生长因子和细胞因子。这些交互作用的摘要如所示图2观察到的总体变化与伤口愈合和肿瘤生物学中的主题相似。在这些条件下，组织（或肿瘤）的主要上皮细胞产生旁分泌信号，诱导基质细胞增殖，为肿瘤生长和伤口愈合提供结缔组织和血管。如前所述，肝细胞是第一个在多种来源的外部刺激下进行增殖的细胞。通过uPA诱导的基质重塑、局部释放和活化，HGF很快可用于肝细胞（见上文）。星形细胞和内皮细胞是新HGF的来源，在PHx后3小时合成。旨在恢复真正肝组织的信号传递的一个非常重要的方面是由再生过程中肝细胞产生的生长因子宿主介导的。肝细胞为星状细胞产生促有丝分裂生长因子（PDGF）(Pinzani，2002年)内皮细胞也是如此。后者包括VEGF、FGF1、FGF2、SCF、血管生成素1和2以及TGFα(Ross等人，2001年;Sato等人，2001年;Yu等人，2003年;清水等，2005年;Papstefanou等人，2007年). 旨在恢复窦网的内皮细胞增殖发生在PHx后的3-6天内。普遍观点认为，血管内皮生长因子（VEGF）吸引的内皮细胞穿透新增殖但未完全血管化的肝细胞簇，重建正弦网络。血管内皮生长激素受体1和2、血管生成素受体Tie-1、Tie-2和血小板衍生生长因子受体β（PDGF-Rβ）增加已在增殖的内皮细胞中观察到。Tie-1的增加在新增殖肝细胞簇周围的内皮细胞中特别可见(Ross等人，2001年). 它可能介导对肝细胞产生的血管生成素1的旁分泌反应，以促进新生血管形成。令人感兴趣的是，在整个动物体内施用VEGF可诱导内皮细胞和肝细胞的增殖，而在纯肝细胞培养物中VEGF不具有有丝分裂性。这是因为内皮细胞本身产生HGF，受VEGFR1作用的VEGF（由肝细胞产生）刺激(LeCouter等人，2003年). 因此，肝细胞和内皮细胞建立了相互辅助的增殖网络。Kupffer细胞在再生过程中没有明显的增殖，其数量可能会受到骨髓中前体细胞迁移的影响。然而，Kupffer细胞确实会产生TNF和IL6，这两种细胞似乎在肝再生的早期阶段对Stat3和NFkB的激活起着促进作用。氯化钆耗尽枯否细胞会导致再生延迟和衰减(Webber等人，1998年).

尽管已经发现了大量的信号网络，但参与这一过程的细胞因子数量可能会继续增长。在肝星状细胞中发现了神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养因子3（NT-3）、神经生长因子4/5（NT-4/5）、低亲和力NGF受体p75和高亲和力酪氨酸激酶受体（Trk）B和C，因其基因表达模式与脑星形细胞相似而广为人知(Cassiman等人，2001年). 星状细胞的再生依赖于神经营养素受体的表达，在神经营养因子受体p75基因缺陷的小鼠中，肝再生不能正常进行^NTR公司(Passno等人，2007年). 这些星状细胞也缺乏HGF的生成，这可能与在某些条件下（不包括PHx）这些小鼠肝细胞增殖减少有关。星形细胞也能产生去甲肾上腺素(Oben等人，2003年). NGF调节星状细胞凋亡(Asai等人，2006年). 总的来说，肝再生期间控制星状细胞增殖的途径和细胞动力学尚未得到充分研究，需要更好地理解。

转化生长因子β1：一种重要的再生细胞因子还是一种再生终止因子？

很少有细胞因子像TGFβ1一样在肝脏生长生物学中引起如此多的兴趣和矛盾。它主要由星状细胞产生(池田等人，1998年)但所有组织中的大多数细胞在其生命周期的某个阶段都会产生TGFβ1。目前尚不清楚肝细胞是否真的产生TGFβ1，尽管它是由大多数来源于肝细胞或成肝细胞的癌产生的(Luo等人，2006年). TGFβ1对大多数上皮细胞具有有丝分裂抑制作用，由大多数组织中的间充质细胞产生。它刺激间充质细胞合成多种细胞外基质蛋白(Roberts等人，1992年). 抑制培养肝细胞的增殖(霍克和米哈洛普洛斯，1989年)，抑制HGF的生成(Gohda等人，1992年)并抑制尿激酶的表达和HGF的激活(Mars等人，1996年). 当大剂量给药时，TGFβ1延迟或部分抑制PHx后24小时的DNA合成峰值(Russell等人，1988年). 众所周知，HGF和EGF的受体在TGFβ1上调之前被完全激活，可以在肝脏器官培养物中诱导TGFβl的合成，可能是TGFβ_1在再生过程中升高的信号(Michalopoulos等人，2001年). 鉴于其对肝细胞的有丝分裂抑制特性，TGFβ1在肝再生过程中高水平产生是一个谜。新的TGFβ1合成在PHx后2–3小时开始，并在72小时前保持升高(Jakowlew等人，1991年). 与参与这一过程的其他细胞因子类似，在PHx后不久，血浆中TGFβ1水平也会升高，并持续升高数小时(Michalopoulos和DeFrances，2005年b). 再生肝的肝细胞对TGFβ1的有丝分裂抑制作用具有抵抗力，并且在PHx后的前48 h内，TGFβl受体I、II的表达降低(Houck和Michalopoulos，1989年;Chari等人，1995年). 对TGFβ1的抵抗可能是由于其受体表达减少，或高水平的去甲肾上腺素（见上文），或再生肝细胞产生TGFα。无论其机制如何，再生肝细胞都设法逃避了有丝分裂抑制效应，留下了TGFβ1的功能问题。为了更好地理解（或更有效地推测）TGFβ1的作用，我们需要在再生过程的开始和结束时检查与之相关的变化。TGFβ1的免疫组织化学显示，该蛋白从门脉周围到中央周围逐渐以波的形式被清除(Jirtle等人，1991年). 这还没有与TGFβ1结合蛋白（如核心蛋白）的类似变化相关。有趣的是，在去除TGFβl的边缘后，有丝分裂中有一波肝细胞增殖。这表明，从肝实质中去除TGFβ1蛋白（对应于其在血浆中的升高）是使肝细胞增殖的必要步骤。针对TGFβ1或激活素受体的显性阴性结构的实验（见上文III）也表明，TGFβl在正常静止的肝脏中发挥积极作用，通过行使“补益”作用，使肝细胞能够执行其分化功能，从而使肝细胞保持在G0期(Kogure等人，2000年;一川等人，2001年). TGFβ1的去除和灭活（通过与血浆中的α-2-巨球蛋白结合(LaMarre等人，1991年)以及HGF的动员和激活(Pediaditakis等人，2001年)造成激动剂和拮抗剂的失衡，这无疑有助于肝细胞的有丝分裂信号级联。

鉴于TGFβ1的有丝分裂抑制特性及其随着再生进展而上调的表达，TGFβ2被认为是终止肝脏再生的天然刺激物。虽然这一假设很有吸引力，但没有太多的实验支持。尽管肝脏和血浆中存在非常高的TGFβ1水平，但肝细胞中TGFβ_1转基因过表达的小鼠几乎可以正常再生(Sanderson等人，1995年). 消除TGFβ1受体的敲除小鼠株有正常的肝再生结束，除非通过给予卵泡抑素同时消除激活素(Oe等人，2004年). 激活素也是肝细胞有丝分裂抑制剂(Ho等人，2004年). 再生的终止可能需要激活素和转化生长因子β1的联合作用。

尽管TGFβ1可能是一种再生终止剂，但人们认为它在肝组织再生结束时的组装中起着重要作用。TGFβ1刺激包括肝脏在内的许多组织中许多细胞外基质蛋白的产生。TGFβ1还刺激胶原凝胶中内皮细胞的小管生成和新生血管结构的形成(Pepper等人，1993年;Holifield等人，2004年). 新的细胞外基质在再生结束时合成，新的正弦毛细血管网络的形成过程也发生在PHx后3天，此时TGFβ1表达处于最高水平。TGFβ1在伤口愈合结束时也升高，与类似事件相关(Murphy等人，2006年). 它也由高水平的肿瘤产生，并且被认为与基质细胞产生肿瘤基质有关。

肝再生终止

尽管研究更少，甚至了解更少，但导致肝再生终止的途径应该与启动该过程的途径同等重要。有证据表明再生过程中产生的肝细胞数量可能会超过原来的数量。再生结束时肝细胞出现小波凋亡(Sakamoto等人，1999年). 扩大的肝叶的肝脏重量与原来的五个肝叶的重量几乎相同（在大鼠和小鼠中）。大型动物（狗）移植到小型动物身上的肝脏体积缩小，而情况正好相反（如从小型到大型狗以及从狒狒到人类的肝脏所示(Starzl等人，1993年). 这些发现提出了一个问题，即存在一个“肝脏调节器”控制系统，该系统确保肝脏重量符合（而不是超过）其稳态功能的表现。有大量证据表明，任何单一细胞因子（例如TGFβ1）都是再生的终止因子，因此，其他肝细胞有丝分裂抑制剂受到了关注。细胞外基质的复合制剂可抑制细胞增殖并增强培养肝细胞的分化。小鼠EHS肉瘤基质提取物（“Matrigel”）和水合I型胶原蛋白凝胶证明了这一点(Rana等人，1994年;Michalopoulos等人，1999年). 细胞外基质信号转导涉及整合素连接激酶(Gkretsi等人，2007年a). 很容易推测细胞外基质和正弦毛细血管网络的重组提供了基质驱动的信号，终止了再生过程(图3). 这可能是通过整合素或TGFβ1诱导的直接信号传导（结合到新合成的去核蛋白并再次发挥“强直”的有丝分裂抑制作用）。在再生过程中，新的聚糖、珍珠糖、syndecan以及I型和III型胶原蛋白的合成显著增加(Gallai等人，1996年;鲁道夫等人，1999年). 新合成的基质还能够结合HGF（一种对糖胺聚糖和肝素具有高亲和力的蛋白质），并防止其被尿激酶激活，尿激酶在再生结束时消失，其表达被TGFβ1抑制(Mars等人，1996年). 这一系列事件将使肝细胞恢复到静止状态，周围环绕着HGF（与糖胺聚糖结合）和TGFβ1（与聚糖结合）。在这种情况下，早期有丝分裂刺激（如HGF和EGF）可促进肝细胞增殖，并增强TGFβ1的表达。增殖肝细胞对TGFβ1产生耐药性；然而后者刺激细胞外基质的产生和肝窦的形成。它还抑制尿激酶和HGF的表达（见上文）。TGFβ1刺激星状细胞合成新的细胞外基质，恢复HGF和TGFβ2的结合，并重建G0肝细胞的静止状态。从这个角度来看，TGFβ1不是再生的直接终止者，但它作为一个大反馈回路该循环始于PHx后早期有丝分裂信号，涉及有丝分裂原（HGF，EGF）触发TGFβ1合成，最终通过合成新的细胞外基质终止再生过程。至于“肝抑素”的成分通过门静脉的血流量增加（在小肝到大动物中）或反之亦然，也可能会启动（或消除）再生过程的一些刺激，尽管规模较小。例如，受体大小的小移植物与人类HGF和TGFβ1的血浆水平增加有关，与大鼠对PHx的反应有关(Ninomiya等人，2003年).

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图3

生长因子、TGFβ1和细胞外基质之间的反馈回路示意图，控制再生的早期和晚期。有丝分裂原（HGF和EGF）上调星状细胞TGFβ1的表达。后者刺激新细胞外基质的合成，同时最终阻止新HGF的合成和尿激酶的表达。新合成的细胞外基质支持肝细胞周围单链HGF和TGFβ1的结合和静止期（G0期）的恢复。相同颜色的箭头表示相同信号处理的输入和输出的类似来源。

这个与生理事件相关的肝脏重量变化（例如，妊娠期肝增大）可能不是通过与再生相关的经典途径介导的，而是通过核激素受体介导的肝增大。雌激素（通过雌激素受体发挥作用）具有这样的作用。令人感兴趣的是，雌二醇也增强了有丝分裂原的作用，并抑制了肝细胞培养中TGFβ1的作用，类似于去甲肾上腺素（见上文）。许多外源性物质会导致肝脏增大。导致这一现象的途径尚不完全清楚，似乎PPAR（过氧化物酶体增殖物）和CAR等转录因子可能发挥作用(Ueda等人，2002年). 一些肝脏增大是由肝细胞大小的直接影响引起的。苯巴比妥与人类和啮齿动物肝脏的急剧增大有关，主要导致肝细胞肥大。这可能是由于苯巴比妥诱导和增强HNF4的核移位(Bell和Michalopoulos，2006年). 这种影响与CAR或PXR无关。去除引起肝脏增大的外源性物质总是与恢复到原来的肝脏大小有关，由肝细胞凋亡波介导，直到肝脏重量恢复正常(Reddy等人，1978年). 可能涉及细胞外基质信号传导。肝细胞ILK和基质信号的急性清除导致大量肝细胞凋亡(Gkretsi等人，2007年b). 通过细胞凋亡调节肝脏重量的这一过程几乎无人知晓。

如果肝细胞不能增殖，再生的替代品是什么？

如果组织损伤过于严重，肝细胞增殖可能会受到阻碍，如患有重型肝炎的人。在实验上，使用化学物质AAF（N-乙酰氨基芴）可以阻止肝细胞增殖。长期服用时，AAF是一种致癌物质。给予短时间，它可能通过形成AAF-DNA加合物来阻断肝细胞增殖，AAF-DNA加合物通过p53和p21触发增殖停滞(Ohlson等人，1998年). 在给予AAF的动物中进行PHx时，肝细胞不能增殖。从PHx后第2天至第3天开始，Herring的门静脉小管和胆管的胆道上皮细胞（由具有胆道形态的上皮细胞排列的小管，连接肝细胞胆汁小管网络和门静脉胆道小管）开始表达肝细胞相关转录因子(Nagy等人，1994年). 此后不久，有越来越多的细胞具有胆汁和肝细胞混合的基因表达模式，以及它们自己的一些标记(1994年出售). 从细胞核的形状来看，这些细胞被称为“椭圆形”细胞。卵圆细胞在肝小叶门脉周围区域强烈增殖，并被星状细胞严重浸润；后者与卵圆形细胞交织并产生HGF、FGF1、FGF2和VEGF(Evarts等人，1993年;Fujio等人，1994年). 其他因素，如生长抑素、基质细胞衍生因子1（SDF1）和结缔组织生长因子也起作用(Pi等人，2005年;Jung等人，2006年;Zheng等人，2006年). 卵巢细胞同时表达白蛋白和甲胎蛋白。在扩大为一个群体后的4到5天，它们变成嗜碱性肝细胞，最终成熟肝细胞，并恢复肝脏大小和组织学(Evarts等人，1989年,1996). 椭圆形细胞的起源一直备受争议。胆道细胞起源于胆道细胞的一个有力论据是，它们的早期基因表达模式与胆道细胞极为相似，而且胆道细胞在卵圆细胞出现之前就开始表达肝细胞相关转录因子。此外，当在AAF/PHx方案启动前给予DAPM（一种选择性破坏胆道细胞的毒素）时，它会破坏胆道上皮并阻止卵圆细胞的出现(Petersen等人，1997年). 没有组织学观察显示正常肝脏中任何非胆道隔室中都有卵圆形细胞群。在大范围肝损伤（由化学物质、病毒等引起）后的暴发性肝炎期间，也可在人体内看到相当于卵圆细胞的细胞，称为“导管肝细胞”，并且假设它们在恢复肝细胞数量方面发挥类似卵圆细胞一样的作用。值得注意的是，胰腺导管也被视为胰腺腺泡细胞和胰岛细胞的祖细胞来源(Rao和Reddy，1995年).

肝细胞和胆道上皮细胞互为兼性干细胞

如上所述，胆道上皮细胞可以变成卵圆形细胞，然后又变成肝细胞，在肝细胞无法增殖时恢复肝再生。这赋予了兼性干细胞(Alison等人，2001年)为肝细胞注入胆汁细胞。术语“兼性”意味着胆汁细胞在正常情况下执行其正常功能（胆汁运输）。然而，在选择性的情况下，它们可以成为肝细胞的干细胞。临床组织学观察表明，门脉周围肝细胞也可能是胆道细胞的兼性干细胞，当胆道细胞在慢性损伤（如原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎）期间不能增殖以修复胆道上皮时，会转化为胆道细胞(Crosby等人，1998年). 这一现象现已在嵌合体肝脏大鼠中得到实验证明(Laconi等人，1998年). 当胆管上皮细胞被DAPM破坏，同时胆管阻塞时，门周肝细胞可以转化为胆管上皮细胞。众所周知，胆道梗阻会导致胆管增生，在上述条件下，50%以上的新生小管携带嵌合体肝两种肝细胞中一种所特有的标记物(Michalopoulos等人，2005a). 这些发现清楚地表明，肝细胞也是胆道上皮的兼性干细胞。如所示图4肝脏的两种上皮细胞（肝细胞和胆道细胞）相互构成兼性干细胞的双极系统，即使经典再生失败，也完全能够修复肝脏组织学。

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图4

当肝细胞增殖在再生过程中受到抑制时，来自胆道室（Herring的门脉小管和胆管）的细胞转变为卵圆细胞，这些细胞成为肝细胞。当胆汁细胞受到损伤时，门脉周围肝细胞也可以转化为胆汁细胞，但其自我修复能力受到抑制。肝细胞和胆道细胞互为兼性干细胞。

肝脏中的干细胞：它们存在吗？他们需要吗？他们从哪里来？

上述肝细胞和胆汁细胞的发现提出了关于肝脏中是否存在全日制、定向干细胞的问题。这些细胞存在于表皮（基底层）、肠（隐窝细胞）和骨髓（造血干细胞，通过细胞分选分离和证实）。在这些其他组织中，组织的干细胞是全天候存在的，通过组织学的随意检查可以看到它们，它们致力于将“干细胞”作为其单一功能。肝脏组织学中不包含任何看起来是全职、承诺性干细胞的细胞。“祖细胞”一词经常用于卵圆细胞，只要记住这些细胞通常不存在，它就是一个有用的术语。很有可能存在肝细胞亚群（门周细胞？）和胆道细胞亚群（鲱鱼管？），与其他同类细胞相比，它们可能更倾向于发挥兼性干细胞的作用。然而，所有这些细胞在正常情况下都具有肝细胞和胆道上皮细胞的功能。

也有相当多的讨论骨 骨髓衍生的造血干细胞可以转分化为肝细胞或卵圆细胞，并在所有其他再生手段失效时拯救肝脏(Petersen等人，1999年). 这一现象的一个引人注目的证明是对酪氨酸血症小鼠的抢救（由于先天性缺乏参与酪氨酸降解的FAH酶，见下文）。注射正常小鼠的骨髓可产生大量正常的肝细胞并挽救肝脏(Lagasse等人，2000年). 然而，随后的研究表明，造血干细胞具有与其他细胞靶点融合的能力(Terada等人，2002年). FAH模型中骨髓来源肝细胞的核型分析表明，明显正常的肝细胞是骨髓（FAH）融合的结果^+/+)细胞和FAH^−/−宿主小鼠的肝细胞(Wang等人，2003年). 在造血干细胞明显产生其他非血液细胞类型的其他组织（心脏、肌肉）中也发现了这种情况。现在人们普遍认为，如果存在造血干细胞通过转分化在肝脏中产生肝细胞的情况，这种现象一定非常罕见(福斯托，2004). 另一方面，有几个骨髓细胞培养的例子，在HGF的影响下，造血细胞明显转化为与肝细胞非常相似的细胞，产生白蛋白(宫崎骏等人，2004年). 这意味着，在迄今为止未知和不可用的条件下，造血细胞向肝细胞的这种转分化在某种程度上可能成为一个可控且有用的过程。羊膜细胞在培养中也表现出类似的向肝细胞样细胞的反式分化(Miki和Strom，2006年). 尽管骨髓细胞在体内转分化为肝细胞的故事跌宕起伏，但这一现象仍在积极研究中(Oh等人，2007年)其全部潜力仍有待进一步研究。

肝细胞在体内具有异常和独特的生长特性吗？

人类和啮齿动物的肝细胞是具有高度复杂基因表达模式的多倍体细胞。它们在肝脏再生过程中的行为表明，它们可以经历一到两轮细胞增殖。文献报道了12例连续性肝切除术中肝脏再生潜能未出现故障的记录(Stocker等人，1973年). 然而，在小鼠酪氨酸血症模型（FAH^−/−老鼠）。由于缺乏FAH酶，会产生有毒代谢物，导致肝细胞死亡和肝衰竭。如果给予药物NTBC，这些小鼠可以存活，NTBC可以阻断FAH上游酪氨酸分解代谢的另一种酶，并阻止有毒代谢物的形成。当NTBC退出时，小鼠迅速进入肝衰竭。此时，注射正常小鼠的肝细胞可以挽救肝脏（和动物），因为注射的正常肝细胞会迅速增殖，重新形成肝块，并恢复正常的肝脏组织学。从第一代获救小鼠中分离出的正常肝细胞可以以同样的方式用于拯救第二代小鼠。这是一个重复的序列，从一只原始小鼠分离的肝细胞中拯救了多达10个连续世代的小鼠。根据该系统的数学计算，一只正常小鼠的一个肝细胞可以产生50个小鼠肝脏！(Overturf等人，1997年). 除了肿瘤细胞，或许还有造血干细胞外，没有其他细胞能够在体内或细胞培养中如此膨胀。FAH之间的细胞融合^+/+和FAH^−/−肝细胞可能是唯一的另一种解释，但显然已被排除。这一现象需要更好地理解，但与体内其他细胞相比，肝细胞确实具有独特的增殖能力。培养中的肝细胞能够重新激活端粒酶功能，这可能是其独特（几乎无止境）体内增殖能力的基础，尽管其表型非常复杂(Nozawa等人，1999年).

胚胎中的肝脏再生？

涉及心脏间充质和腹侧内胚层的信号模式非常复杂，它们导致肝原基的形成。在这一课题中有几项优秀的研究，它们涉及到FGF生长因子家族成员和BMP家族成员，作为诱导肝anlagen的承诺、规范和分化(Lee等人，2005年;Battle等人，2006年;扎雷特，2006年). 几个转录因子以顺序方式被诱导，以控制协调这一过程的现象。这些研究不属于本综述的一部分。然而，最近的一项研究表明，在肝前体细胞出现后，立即对其进行部分破坏，会导致胚胎肝脏的体积比最初小得多。然而，它确实迅速扩张，并且在出生时，接受治疗的小鼠的肝脏大小与对照组的肝脏大小无法区分(Stanger等人，2007年). 这表明，尽管控制肝胚胎发生的信号通路似乎与再生的信号通路不同，但胚胎肝脏即使在胚胎发育期间也有能力进行再生扩张。在同一项研究中，发现胰腺的情况并非如此。

结论

尽管对肝脏再生进行了多项研究，但这一现象的许多方面仍有待进一步了解。与PHx相关的变更构成“第一触发器“（尿激酶升高前，Notch和β-catenin核迁移等）尚不清楚，但PHx后残余肝脏的大的血流动力学改变必然会起作用。同样不清楚但稍好理解的是导致在正确时间结束再生的信号通路。在皮肤、肠道和血液中，组织修复是通过干细胞的增殖实现的，这是一个“局部”问题。伤口愈合和相关现象与肝脏再生有许多相似之处，也是“局部”事件。对于肝脏，情况并非如此。肝功能影响全身，肝衰竭的后果绝不是局部的。完全分化的肝细胞继续承担着维持整个身体内环境稳定的重任，同时也恢复了肝脏质量。许多最近的研究都集中于使肝细胞维持大部分内环境稳定功能并同时增殖的信号通路。既然生长因子、细胞因子和调节再生的细胞事件已经形成了一个坚实的框架，就可以更好地研究肝脏再生的这一方面，以及再生开始和（调节良好的）结束的事件。

致谢

引用的文献