N个-β1整合素Ⅰ型结构域的糖基化β1整合素表达和生物学必需功能

摘要

整合素是一种异二聚体糖蛋白，由α和aβ亚单位(1). 这个整合素和细胞外基质之间的相互作用对两者都至关重要生理和病理事件，如细胞迁移、发育、细胞生存能力、免疫稳态和肿瘤发生(2,三). 整合素中超家族，β1整合素可以与12个不同的α亚基结合（α1–11，αv）形成异二聚体，从而获得广泛的配体特异性的多样性(1,4). 整合素被认为是由激发构象的内-外信号机制调节调节整合素对配体亲和力的变化(5). 然而大量证据表明，细胞表面碳水化合物介导多种整合素与其细胞外环境之间的相互作用，从而影响整合素活性和可能的肿瘤转移(6–8).

郭等。(9)据报道整合素β1亚基刺激细胞迁移。此外，升高了Ras诱导的STGal-I转移酶导致β1亚单位唾液酸化活性，也诱导细胞迁移(10,11). 相反，细胞通过添加二分的GlcNAc，减少了迁移和扩散，它是N个-乙酰氨基葡萄糖转移酶III（GnT-III），²到α5β1和α3β1整合素(12,13). 变更N个-整合素上的聚糖也可能调节其顺式相互作用含有膜相关蛋白，包括表皮生长因子受体、galectin家族和tetraspanin家族蛋白质(14–19).

除了N个-多个研究小组报告称N个-整合素α5β1上必须存在聚糖αβ异二聚体的形成和适当的整合素-基质相互作用。与此假设一致，在存在糖基化的情况下抑制剂，衣霉素，正常整合素底物结合和转运到细胞表面被抑制(20). 此外纯化整合素N个-糖苷酶F阻断了亚基的结合及整合素与纤连蛋白(21). 这些结果表明N个-糖基化对功能性α5β1的表达。然而，因为整合素α5β1包含26个电位N个-连接的糖基化位点，α中的14个β亚基中的亚基和12，识别对其生物功能至关重要是理解分子的关键机制，通过它N个-聚糖改变整合素功能。最近，我们的小组确定N个-β-螺旋桨结构域的糖基化α5亚基对异二聚体和生物都至关重要亚单位的功能。此外，我们确定站点3-5α5亚单位介导的细胞扩散和FN上的迁移(22). 这个本研究的目的是阐明N个-糖基化β1亚单位。因此，我们在假定的N个-天冬酰胺残基置换的糖基化位点含有谷氨酰胺残留物。我们随后将这些突变基因导入β1缺乏上皮细胞（GE11）。这些突变的结果实验表明N个-类I上的糖基化位点β1亚基的结构域，位点4-6（S4-6），对于异二聚体的形成和生物功能，如细胞传播。

实验程序

试剂-Phoenix细胞系购自ATCC（弗吉尼亚州马纳萨斯）。抗人整合素β1单克隆抗体亚单位（P5D2），来自发育研究杂交瘤库，使用蛋白质A-Sepharose™4快速流动柱（GE Healthcare）。对于西方人整合素82–87氨基酸单克隆抗体的印迹分析β1亚基（MAB1965，JB1A）和α-微管蛋白（DM1A）从Chemicon（加利福尼亚州Temecula）和Sigma。多克隆兔抗体针对人β1整合素（AB1952P），α5的羧基末端整合蛋白（H-104）、α5整合蛋白（4705S）和钙连蛋白（SPA-860）分别为购自Chemicon，Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯），CellSignaling Technology，Inc.（马萨诸塞州丹弗斯）和StressGen（密歇根州安阿伯），分别是。抗绿色荧光蛋白（GFP）的山羊抗体是来自Rockland Immunochemicals，Inc.（宾夕法尼亚州吉尔伯茨维尔）。过氧化物酶结合的抗兔和抗羊抗体来自Cell Signaling Technology，Inc.一种过氧化物酶偶联的山羊抗鼠IgG抗体来自Chemicon（加州特梅库拉）。一种针对小鼠α5整合素亚基（Sc-23941）购自圣克鲁斯生物技术（加州圣克鲁斯）。

细胞培养-上皮GE11细胞，来源于β1整合素敲除胚胎干细胞(23)，保持在37°C，添加Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM；Invitrogen）含10%胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素和20n个米曲古抑菌素A.凤凰细胞和整合素α5缺乏细胞（CHO-B2）(22)都长大了DMEM中添加10%FBS、青霉素/链霉素。CHO Lec 3.2.8.1号文件这些细胞是GnT-I缺陷细胞系，是帕梅拉·斯坦利博士（阿尔伯特纽约爱因斯坦医学院）(24).

cDNA构建-整合素β1亚基的cDNA为人胎盘总蛋白反转录产物的PCR扩增RNA（OriGene Technologies，Inc.，Rockville，MD），然后插入克隆载体（pENTR-D-Topo，Invitrogen），根据制造商的协议。使用快速改变将突变引入β1 cDNA根据制造商说明。逆转录病毒载体pBabe-Puro质粒(25)，是为了网关兼容，使用网关转换系统套件（Invitrogen），产生pBabe puro-Rfa。LR克隆酶（Invitrogen）用于从克隆载体中转移β1整合素或GFP的cDNA。使用ABI PRISM对所有cDNA结构的编码区进行测序3130测序器（日本东京应用生物系统株式会社），并与人类基因ITGB1标准（GenBank™{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“BC020057.1”，“term_id”：“18042959”}}BC020057.1号)以确认所需突变的存在(图。1)并且没有任何额外的突变。cDNA可溶性α5和β1亚单位的结构根据以前的研究(26–29).α5β1整合素的可溶性表达系统由Takagi描述等。(27,28). 简单地说，这个表达式α5（pEF1-α5-Δ664-tev-AHCys）和β1的载体（pEF1-puro-β1-Δ501-tev-BHCys-6XHis）亚基是善良的礼物由Junichi Takagi博士（大阪蛋白质研究所）提供日本大学）。我们进一步将α5的胞外结构域缩短为残留天冬氨酸⁶⁴⁴根据Coe进行的广泛研究et（等）阿尔。(26). 这些cDNA然后克隆到pENTR-D-topo克隆载体中α5-Δ644-tev-AHCys（Met残留¹到天冬氨酸⁶⁴⁴)和β1-Δ501-tev-BHCys-6XHis（来自遇见¹到Glu⁵⁰¹)在pENTR中，如所示图7A类.这些可溶性整合素α5β1的九个假定结构N个-每个亚基上的糖基化位点。克隆N个-可溶性α5和β1亚基的糖基化突变体使用重叠延伸PCR制备。野生型（WT）和突变体构建物与慢病毒载体质粒CSII-EF-Rfa重组，使用LR克隆酶(30).

在单独的窗口中打开

图1。

电位示意图N个-糖基化位点整合素β1亚基。与假设相对应的站点N个-β1亚基（Asn）上的糖基化位点⁵⁰,Asn公司⁹⁴、Asn⁹⁷、Asn²¹²、Asn²⁶⁹,Asn公司³⁶³、Asn⁴⁰⁶、Asn⁴¹⁷、Asn⁴⁸¹,Asn公司⁵²⁰、Asn⁵⁸⁴、和Asn⁶⁶⁹)显示为灰色箭头. The十字架代表移除各糖基化N个-聚糖定点突变，即Asn至Gln。表皮生长因子表皮生长因子。

在单独的窗口中打开

图7。

WT和糖基化突变体的特性可溶性α5β1整合素。 A类，细胞外部分α5（1-644）和β1（1-501）亚单位(黑体)分别与酸肽和碱肽融合装箱的7种氨基酸指示烟草蚀纹病毒的识别序列(TEV公司)所述蛋白酶(27). SDS-PAGE和免疫印迹显示了纯化的重组整合素的分析。纯化的WT和整合素α5β1的糖基化突变体，制备为在“实验程序”中描述，受到6%使用考马斯亮蓝R-250进行SDS-PAGE可视化(哥伦比亚广播公司)(B类)，抗α5免疫印迹（4705S）(C类)，或β1单克隆抗体（JB1A）(D类)减少不足(左侧)和非还原性(右侧)条件。工作分解结构，Western blot。这个括号指示WT和重组整合素的α5S3-5/β1S4-6糖基化突变体。E类，WT和整合素等效物的α5S3-5/β1S4-6下糖基化突变体将一定量的重组整合素添加到含有涂上FN（5μg/ml）。然后在37℃孵育平板3小时°C，存在1m米氯化锰₂(灰色条)或10米米乙二胺四乙酸(露天酒吧). 结合的整合素是用抗α5抗体（HA5）和碱性试剂定量如“实验程序。”

逆转录病毒的产生和转导-基于pBabe-Puro的将上述载体转染到Phoenix ecotropic中使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）的逆转录病毒生成细胞产生病毒上清液。CHO-B2细胞的逆转录病毒为由pBabe-puro-based载体和pLP/VSVG共同转染产生（Invitrogen）进入Phoenix细胞。慢病毒载体被联合转染将pCAG-HIVgp和pCMV-VSV-G-RSV-Rev导入293T细胞。48小时转染后，过滤逆转录病毒和慢病毒上清液然后在10μg/ml Polybrene的存在下与靶细胞孵育（Sigma）分别在32°C下过夜。感染后两天，GE11用嘌呤霉素筛选细胞和CHO-B2细胞。集合稳定细胞系本研究中使用了。

免疫沉淀和Western Blot-细胞用冰镇磷酸盐缓冲液（PBS），并在含有20米米三氯化氢（pH 7.4），150 m米氯化钠，1%（w/v）Triton®声波风廓线仪X-100和蛋白酶抑制剂混合物（Nacalai Tesque，Kyoto，Japan）。这个收集上清液，并使用BCA蛋白检测试剂盒（Pierce）。含有等量蛋白质与2μg抗体和15μl蛋白质孵育G-Sepharose™4 Fast Flow（GE Healthcare）在4°C下保持2小时。这个免疫沉淀物用裂解缓冲液洗涤三次，然后6%SDS-PAGE。电泳后，蛋白质转移到硝化纤维素膜（沃特曼）。将膜与初级和二次抗体，每次1h；使用ECL试剂盒进行检测（GE Healthcare），根据制造商的说明。

流式细胞术分析-流式细胞术分析如前所述执行(12,22)稍作修改。简单地说，使用含1米胰蛋白酶米EDTA，随后用或染色在没有原代小鼠抗β1或大鼠抗α5抗体的情况下通过与Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG和Alexa Fluor 633孵育山羊抗鼠IgG（Invitrogen）。用使用FACSCalibur流进行PBS流式细胞术分析细胞仪和Cell Quest Pro软件（BD Biosciences）。

代谢标记-脉冲相位实验是如前所述，稍作修改(22). 5 × 10⁵6孔培养皿上的细胞用PBS清洗三次，然后饥饿DMEM中30分钟，排除蛋氨酸和半胱氨酸（Sigma）。饥饿之后，在含有200μCi的500μl DMEM中对细胞进行脉冲标记[³⁵S] 蛋氨酸和半胱氨酸（表达蛋白标记混合物，PerkinElmer Life Sciences）30分钟，然后用完整的DMEM追赶在规定时间内含有10%FBS。细胞被裂解，细胞用β1亚单位抗体（JB1A）免疫沉淀裂解产物。这个免疫沉淀物在6%SDS-PAGE上分离。凝胶干燥后，用富士BAS 5000生物图像分析仪观察放射性条带。

免疫荧光显微镜-玻璃盖玻片上的细胞（日本东京磐城）用冰镇甲醇固定。固定细胞是通过在PBS中0.05%Triton X-100中培养渗透。用3%BSA，细胞与初级抗体孵育。细胞已可视化与Alexa 488或Alexa 546结合的二级抗体。荧光使用FluoView FV1000（奥林巴斯，日本东京）。

细胞粘附和扩散-细胞扩散分析如前所述执行，并进行了细微修改(12,22). 简单地说，96度平面底部微量滴定板（纽约州康宁市康宁玻璃）涂有5μg/ml纯化人FN（Sigma）在50μl PBS中的溶液过夜然后用1%牛血清白蛋白（BSA）封闭。用含有1 m的胰蛋白酶分离细胞米EDTA，清洗加入含有FBS的DMEM，然后悬浮在含有0.1%BSA的无血清DMEM中1×10⁴细胞/ml。培养20分钟后，用相控显微镜观察了具有代表性的场。单元格使用实时细胞电子传感动态监测粘附（RT-CES）仪器（ACEA，圣地亚哥）(31,32). 这些细胞是在含有0.1%BSA的无血清DMEM中重新悬浮，然后在5×10⁴电极传感器（16X E板，ACEA）中的细胞/ml用10μg/ml纯化人FN包被，用1%牛血清白蛋白封闭。随后3小时内发生的细胞粘附持续通过使用RT-CES设备进行测量进行监控RT-CES SP软件每5分钟。

WT及其亚糖基化突变体的表达和纯化重组整合素-重组整合素是使用CHO LEC 3.2.8.1细胞，并从细胞培养上清液中纯化为前面描述过，只是做了一些小修改(27,28). 简言之，CHO LEC 3.2.8.1细胞与慢病毒共同感染，以表达可溶性α5和β1亚单位，随后在无血清ASF 104培养基（味之素株式会社，日本东京）。有条件的收集培养基并通过离心澄清，然后沉淀硫酸铵饱和溶液（80%）。集中培养用Tris缓冲盐水（TBS）透析培养基，然后通过通过明胶-葡聚糖柱（GE Healthcare）。洗脱组分为使用镍-硝基三乙酸进行亲和层析酸-甘露糖（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen Inc.）。柱子用含1 m的Tris缓冲盐水米氯化钙₂和1米米氯化镁₂（TBS（+）），洗脱结合蛋白TBS（+）含250 m米咪唑。

整合素结合分析-整合素结合试验为如前所述执行(12)，带未成年人修改。简单地说，96英尺平底微量滴定板上涂有5μg/ml纯化人FN（Sigma）在50 ml PBS中的溶液过夜温度为4°C。然后在室内用1%BSA阻止非特异性结合1小时温度。将整合素添加到平板中，并允许结合3小时存在1m米氯化锰₂或10米米37°C下的EDTA。接下来，用含有1的TBS清洗盘子米米氯化锰₂含0.1%BSA和0.02%吐温20或TBS0.1%BSA、0.02%吐温20和10 m米EDTA和结合整合素用酶联免疫吸附试验定量。盘子是与小鼠抗α5抗体（HA；1:1000稀释）孵育30含1m的TBS在室温下的最小值米氯化锰₂,然后清洗三次，然后用生物素化物培养抗鼠抗体（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories，Inc.）。三点之后洗涤，将孔与抗生物素D-缀合的碱性磷酸酶一起孵育（Vector Laboratories，Inc.）。结合抗体通过在402nm处用第页-硝基苯磷酸盐（钙生物化学）。

结果

各种整合素的构建β1个突变体潜在N-糖基化位点的突变-人类整合素β1亚基含有12个电位N个-糖基化位点，如图所示在里面图1。据报道，第10页，共10页这些站点通常是N个-糖基化，而位点2和11通常不携带N个-连接聚糖(33). 然而，12个人中的哪一个N个-糖基化位点对亚基仍然未知。最近，我们使用定点突变来确定N个-β-螺旋桨结构域上的聚糖α5亚单位对α5β1异二聚体细胞至关重要表面表达与生物功能(22). 在本研究中，我们突变N内的天冬酰胺残基X（X）（S/T）糖基化β1亚基不同结构域中谷氨酰胺的一致序列(图1)谷氨酰胺残留。然后将这些突变的cDNA导入整合素β1亚单位缺失的GE11细胞。检测到构建体的表达使用Western印迹法。我们假设N个-糖基化β1亚基上的位点也可以分为不可或缺的和如之前观察到的α5亚单位的可有可无的位点。这个本研究中使用的β1整合素的糖基化不足突变体构建体是在中列出图1如下：Δ1-3、Δ4-6、Δ7,8和Δ9-12。这些构造对应于PSI和混合域的上游区域：类I域，下游杂交结构域、表皮生长因子重复序列和β-尾的区域β1亚基的结构域。

去除N-糖基化位点对β1细胞表达、异二聚体形成和细胞表达的亚单位表面-如上所述，尽管N个-糖基化整合素α5β1对其功能至关重要(20,21,34)，不同的角色N个-β1亚基每个结构域的糖基化程度很大未知。为了检验以下所示的糖基化突变的影响图1细胞表达，异二聚体的形成和在细胞表面的表达，我们介绍了这些将cDNA突变为GE11细胞。首先，我们比较了突变体中的总细胞裂解。如所示图2A类，的Δ4-6突变体的表达低于其他突变体使用抗β1抗体（JB1A）进行评估。类似结果如下使用另一种抗β1抗体观察到，该抗体识别β1亚单位的羧基末端表位（数据未显示）。这些结果表明N个-β1Ⅰ型结构域上的聚糖β1亚单位的高效表达需要整合素。我们经验证的等量蛋白质通过印迹法装载α-微管蛋白抗体(图。2A类，下部面板). 应该注意的是Δ1-3和Δ7,8突变体在SDS-PAGE上的迁移率相似，或在Δ4-6和Δ9-12突变体之间，进一步支持了站点2和站点11不携带N个-交联聚糖的报告密封件等。(33).整合素β1亚基与多个α亚基结合形成各种异二聚体，可以稳定其表达。确定是否β1亚基特定结构域的糖基化突变影响整合素αβ异二聚体，我们对从表达WT或糖基化β1亚基。据报道，α5亚单位是β1整合素的主要成分亚单位再损伤GE11细胞(35). 因此，我们评估α5β1异二聚体。在表达WTβ1的细胞中整合素，α5亚基在β1中被清楚地检测到与抗β1抗体免疫沉淀的免疫复合物(图2B类). 然而，α5亚基在β1免疫复合物中的表达Δ4-6的表达量明显低于表达WT的细胞，Δ1-3、Δ7,8或Δ9-12突变(图2，B类和C类). 这些结果表明N个-糖基化β1整合素的类I结构域对于有效α/β异二聚体形成。

在单独的窗口中打开

图2。

糖基化对β1亚基表达和β1亚基与α亚基的结合。 A类,GFP表达细胞（对照）、WT和一些如图所示（Δ1-3、Δ4-6和Δ9-12）用抗整合素β1抗体（JB1A）和抗α-微管蛋白抗体（DM1A）作为负荷控制。B类,免疫沉淀等量的细胞裂解物(知识产权)带有抗β1整合素（P5D2）。然后对免疫沉淀物进行处理至6%SDS-PAGE并进行印迹(IB公司)与抗α5（H-104）和抗β1整合素（JB1A）抗体。装载同等数量的使用抗α-微管蛋白验证总细胞裂解物中的蛋白质抗体。C、，定量数据表示为相对比率抗β1免疫沉淀中α5/β1亚基的表达。光学使用ImageJ测量α5和β1亚基带的密度软件。α5的比率与设置野生型β1100。数据来自三个独立实验（平均值±S.D.）。^**,第页<0.01根据学生的双尾t吨测试。

特别有趣的是，α5亚单位仅在表达S4-6突变的细胞的β1免疫复合物没有所有糖基化位点，除了I型结构域中的那些(图3A类). 尽管S1-3的表达水平与S4-6突变体相似(图3A类，中间面板)α5/β1杂合物在S1-3表达细胞(图。三A类，上部面板). 此外利用流式细胞仪研究这些突变体的细胞表面表达细胞分析。FACS分析显示细胞表面的水平在去除突变体中，S4-6突变体的表达最高(图3B类). 同样，Δ4-6突变体的细胞表面表达水平相当高小于WT（WT的43%），而Δ1-3表示，Δ7、8和Δ9-12突变体分别占WT的91、104和79%。另一方面，FACS分析显示α5的表达为仅在S4-6中观察到，但在S1-3、S7、8或S9-12中未观察到，如图所示在里面图3C类.拍摄总之，这些结果进一步支持了我们的假设N个-类I结构域上的糖基化对两者都是不可或缺的α/β二聚体及在细胞表面的高效表达。

在单独的窗口中打开

图3。

细胞表面表达的比较及其与α亚单位。 A类，等效大量细胞裂解物被免疫沉淀(知识产权)使用抗β1整合素（P5D2），然后免疫沉淀至6%SDS-PAGE并进行印迹(IB公司)抗α5（H-104）或抗β1（JB1A）抗体。在用抗α-微管蛋白抗体验证总细胞裂解物。B类，检测细胞表面β1整合素的表达使用FACS分析。在分析之前，将细胞与抗β1抗体（P5D2），然后与Alexa Fluor 488山羊孵育“实验程序”中所述的抗鼠IgG阴性对照染色(阴影直方图)在没有第一抗体。C、，α亚基的相对表达水平细胞表面。细胞用大鼠抗α5抗体染色然后用Alexa Fluor 633山羊抗鼠IgG孵育。表达式α5亚基水平表示为相对荧光强度使用FACS分析进行检查。野生型的荧光强度α5亚基设为100。

N-糖基化对Ⅰ型结构域的影响β1开翻译后处理、稳定性和细胞本地化-阐明受损的潜在机制αβ异二聚体的形成和表达水平的降低糖基化下突变体的β1亚基，如Δ4-6、WT和in中α5β1整合素的生物合成动力学用脉冲相检测糖基化突变体转染体方法。当0小时追捕时，β1亚单位的前体为在所有这些转染剂中观察到。然而，α5的前体仅在WT和S4-6中明确检测到(图4A类). 看起来表达水平没有显著差异这些转染体中的新生β1亚单位（0或4h追踪）。有趣的是，β1亚基成熟形式的含量为在WT和S4-6转染体中可以清楚地观察到，即使在4小时后追踪但显然在其他突变体中没有。巧合的是α5亚单位也仅在WT和S4-6中观察到转染剂。另一方面，蛋白质降解率很高与WT或S4-6，如4小时和16小时的追踪数据所示，但原因尚不清楚S1-3即使在其前体形式中也是稳定的。β1的降解如前所述，蛋白质可能部分通过蛋白酶体途径介导以前(36)，因为蛋白酶体抑制剂MG-132的治疗增加了除S1-3突变体外，所有突变体中均含有β1(图4A类).

在单独的窗口中打开

图4。

的影响N个-β1Ⅰ型结构域上的糖基化翻译后处理、稳定性和细胞定位。 A类，代谢标记后[³⁵S] 蛋氨酸和-半胱氨酸30分钟，用新鲜培养基清洗细胞，有或没有蛋白酶体抑制剂MG-132，最终浓度为8μ米，然后在指定的时间追赶。这些细胞是裂解，并免疫沉淀等量的细胞裂解物(知识产权)在指定的时间使用抗β1（JB1A）抗体。这个按照“实验程序。”M（M）和P（P）指示的迁移位置α5和β1亚基的成熟形式和前体形式。B类用抗β1亚单位的小鼠抗体对细胞进行染色（JB1A）和兔抗calnexin抗体(CNX公司)（SPA-860），随后通过可视化山羊抗小鼠IgG-结合Alexa 488抗体和兔IgG结合物Alexa 546。这个酒吧表示20微米。

接下来，我们检查了β1的WT、S4-6和Δ4-6的定位通过免疫染色。有趣的是，β1的WT和S4-6亚单位通常主要在细胞表面表达，而Δ4-6主要积聚在内质网中钙结合蛋白(图4B类).这些结果部分支持了β1可以与从头开始合成的α亚基，否则过量的非络合β1要么立即降解，要么留在内质网(36,37). 另一方面，基于结果如所示图。三C类和图。4B类，与α5无关，β1亚单位似乎在这些细胞表面边缘表达糖基化的突变体。事实上，孟等。(38)报告存在细胞表面的单体β1亚基抗β1单体抗体。因此，整合素的表达水平细胞表面可能并不总是匹配总表达水平，因为水平可能受几个因素的影响，例如α/β组装、成熟和降解，如上所述。

去除N-糖基化位点对整合素的影响β1对FN介导的细胞扩散-整合素介导生物功能，如细胞扩散和细胞迁移，可以由异常变化调节N个-整合素的糖基化。在一项研究，我们报告说N个-β-螺旋桨的糖基化，整合素α5亚基的其他结构域对整合素介导的生物功能。在这项研究中，我们比较了细胞在N个-糖基化突变体。细胞扩散是在FN涂层培养皿上重新放置细胞后20分钟内进行检测。作为预期，WTβ1亚单位基因过度表达，而非GFP控制，主要挽救FN上传播的细胞(图5，A类和B类)，提供GE11细胞是一个有用的细胞模型整合素β1功能的研究。细胞扩散被完全抑制通过抗β1功能阻断抗体（P5D2），但不是通过正常IgG。这一结果表明，FN上的初始细胞扩散主要是通过介导的通过整合素α5β1。另一方面糖基化下突变体Δ4-6没有导致细胞在同一时间点。相反，Δ1-3、Δ7,8、，和Δ9-12突变体诱导细胞在FN涂层培养皿上扩散WT基因的过度表达。有趣的是，表达S4-6的细胞，但是S1-3、S7、8或S9-12突变体没有表现出显著的细胞扩散。此外，使用RT-CES进行细胞粘附动力学分析系统(图5C类). 单元格使用RT-CES评估的粘附动力学在Δ4-6突变体与其他突变体相比，如Δ1-3和Δ7,8突变体(图。5C类，上部面板). 另一方面，S4-6突变体的过度表达显著增加了细胞粘附。单元格S1-3、S7、8或S9-12的过度表达不会增强粘附(图5C类，下部面板). 总的来说，这些结果强烈表明N个-β1亚单位I型结构域的糖基化为对亚单位的生物功能至关重要。

在单独的窗口中打开

图5。

不同糖基化物在FN上细胞铺展的比较β1亚基的突变体。 A类，细胞分离重新放置在预先涂有5μg/ml FN的培养皿上。孵育后20min，用3.7%多聚甲醛固定细胞使用200倍相位对比显微镜拍摄现场照片。这个酒吧表示200μm。B、，细胞扩散的量化FN表示为三个独立实验的平均值±S.D。C、，用RT-CES系统进行细胞粘附动力学分析在“实验程序”下。细胞指数是指细胞的范围粘附。这个酒吧显示标准偏差。

的S4-6突变β1可以用极小值形成二聚体N-糖基化突变体α5子单位—N个-糖基化对整合素至关重要α5β1异二聚体的形成，因此，它在整合素α5β1在生物学功能中的作用经GnT-III修饰后，细胞粘附和迁移减少FN公司(12). 与GnT-III、GnT-V不同特异性修饰β1亚单位，而不是α5亚单位，以及整合素α5β1上调介导的细胞迁移(9). 最近，我们发现三N个-α5亚基上的糖基化位点，即α5S3-5对其生物功能（如细胞）至关重要FN上的粘附和细胞迁移以及异二聚体。此外，我们还发现α5亚单位N个-糖基化位点，α5S5是细胞表面表达的最重要位点，尽管这个部位对生物功能没有影响(22). 要检查β1亚单位的S4-6突变可与α5形成异二聚体中显示的突变体图。6A类，我们将WT或β1突变体引入CHO-B2细胞表达N个-α5糖基化突变体亚单位。正如预期的那样，WTβ1亚单位有效地形成异二聚体如前所述，含有α5亚基的S3-5。特别是感兴趣的是S4-6，而不是Δ4-6突变，与α5亚基(图。6B类). 此外，WT和S4-6都形成了异二聚体带有S5突变体，该突变体只有一个N个-糖基化位点α5亚单位。细胞表面表达中的这些突变体通过FACS分析（数据未显示）。这些结果综合起来表明N个-α5亚基β-推进器上的糖基化β1亚单位的类I结构域是αβ二聚体的形成。

在单独的窗口中打开

图6。

最小N个-α5β1二聚体的糖基化需求形成。 A、，两次糖基化的示意图含有GFP标签的α5亚单位突变体。对应的站点假定N个-糖基化位点（Asn⁸⁴,Asn公司¹⁸²、Asn²⁹⁷、Asn³⁰⁷、Asn³¹⁶,Asn公司⁵²⁴、Asn⁵³⁰、Asn⁵⁹³、Asn⁶⁰⁹,Asn公司⁶⁷⁵、Asn⁷¹²、Asn⁷²⁴、Asn⁷⁷³,和Asn⁸⁶⁸)α5亚基上的灰色箭头. The十字架代表糖基化的去除在每个N个-聚糖定点突变。α5S3-5和α5S5表示移除除所示位置以外的所有位置地点，即Asn公司²⁹⁷/Asn公司³⁰⁷/Asn公司³¹⁶,和Asn³¹⁶分别是。知识产权免疫沉淀；工作分解结构，Western blot。B类，细胞表达N个-α5（α5S3-5和α5S5）糖基化突变体感染了含有WT或N个-糖基化β1亚单位的突变体（Δ4-6和S4-6），如下所述“实验程序”。细胞裂解物是用抗GFP抗体免疫沉淀，免疫复合物进行SDS-PAGE并用抗β1亚单位（JB1A）进行印迹(上面的面板). 使用抗β1亚单位对总细胞裂解物进行印迹抗体（JB1A）(中间面板)和抗GFP抗体(降低面板).

重组糖基化产物的纯化与表征整合素突变体-因为细胞同时缺乏α5而β1亚基目前还不可用，我们构建了秘密避免干扰内源性表达的表达载体α5或β1亚单位。此外，为了将复杂因素的影响降至最低N个-整合素函数上的聚糖结构，我们引入了表达载体进入不表达GnT-I的CHO LEC 3.2.8细胞，因为GnT-I将GlcNAc催化为末端α-1,3-键Man男人₅GlcNAc公司₂Asn启动杂交和复杂的N个-多细胞生物中的聚糖(39). WT和从条件培养基中纯化α5S3-4/β1S4-6突变整合素采用镍-硝基三乙酸亲和层析。正如预期的那样纯化的整合素在非还原条件下产生单一的均匀带条件，尽管在存在2-巯基乙醇(图。7A类). 这些结果表明α和β亚单位通过二硫键共价连接，因为α和β亚基每一个都含有一个羧基末端半胱氨酸，如前所述(27). 这些纯化的整合素也通过免疫印迹分析证实了α5 (图7B类)和β1亚单位(图。7C类)在非还原和还原条件下，分别是。此外，我们在重组整合素和FN。重组物的等量将整合素添加到FN涂层的微量滴定板中。有趣的是α5S3-4/β1S4-6糖基化突变体的结合能力为与WT相比，表明N个-两者的糖基化α5亚基的β-推进器和β1亚基对配体结合等生物功能很重要。α5β1整合素与FN的结合特异性得到证实通过10m处理米EDTA，完全阻断整合素FN互动。这些结果强烈表明N个-糖基化一个特定的结构域对二聚体的形成和功能都很重要表达式。

讨论

本研究检测了β1的糖基化作用亚单位。我们确定只有N个-类I结构域上的聚糖β1亚单位对其生物功能至关重要，例如β1整合素介导的初始细胞扩散和二聚体形成。此外，我们提出α5S3-5/β1S4-6突变体表现出最小的N个-功能性α5β1整合素的糖基化需求表达式。事实上，假设N个-类I上的糖基化位点结构域在人类、小鼠、大鼠、，爪蟾、和鸡肉。最近，刘等。(40)，使用分子动态建模方法，确定糖基化的改变β1的I样结构域可能影响低聚糖和I型结构域，反过来改变可及性特异性决定环对配体的作用。此外，我们发现N个-α5β-推进器上的糖基化位点4亚单位被GnT-III特异性修饰，从而调节α5β1介导的细胞扩散与细胞迁移。^三这些观察结果表明N个-聚糖整合素影响其生物学功能。因此，详细的诱变研究N个-整合素上的聚糖对于解释是必不可少的其功能调节所涉及的复杂机制通过糖基转移酶，如GnT-III、α2,6-唾液酸转移酶和GnT-V型(9,12,13,41).

众所周知，整合素介导的细胞粘附功能与生长因子受体协同控制细胞增殖，上皮细胞和成纤维细胞的分化、存活和迁移(42). 协会与生长因子受体结合的整合素已在共聚类中得到证实和共沉淀研究(43,44). 事实上，整合素使生长因子信号在许多情况下与正常生长因子信号一样除非细胞粘附于细胞外基质或其他细胞通过整合素。Hakomori及其同事(45)报告称整合素-四spanin复合物的形成受N个-整合素和四spanins的糖基化，以及微结构域中的神经节苷脂。例如，CD82带有完整的N个-糖基化显示其与α3或α5整合素，而CD82不完全N个-糖基化表现出增强的相关性(46). 相反CD9与α3或α5整合素亚基的关联是不受影响N个-糖化，因为CD9不含N个-糖基化位点。基于这些观察，我们假设N个-整合素的糖基化可能参与超分子复合物细胞表面的形成，控制细胞内信号转导。最近，我们利用生化可视化技术进行了演示方法和抗体阵列，许多受体酪氨酸激酶，如表皮生长因子受体与β1整合素形成簇活细胞(47). 我们相信β1和α5亚基的这些糖基化突变体将证明在阐明在细胞膜附近形成超分子复合物可能通过以下方式积极或消极地调节细胞生物学功能调制N个-聚糖。

基于之前的两项研究(21,22)以及目前的研究表明N个-糖基化对α5β1异二聚体的形成。然而，这可能并不总是案例。纯化的α5β1整合素，但不是αLβ2，用N个-糖苷酶F阻断了这两个亚基的内在联系。在此外，在β2亚基，αβ所需的一个基本保守区二聚体形成，不含电势N个-糖基化位点(48,49)，表示N个-糖基化可能不参与含β2整合素组件。相比之下，决定特定性的环路段不是需要α5β1的形成，这表明亚单位的使用整合素中的界面残基是可变的(48). 另一方面，两者都是细胞毒素如CyaA、LtxA和HlyA，取决于对N个-β2整合素上的聚糖(50).

在整合素αVβ3的晶体结构中在αV和β3亚单位之间是αV上的β螺旋桨β3的I型结构域具有疏水型、离子型和混合型相互作用(29,51). 模具等。(52)确定了结构α5β1的同源性建模。基于模型，界面α5β1二聚体被N个-聚糖。此外，基于β1的类I结构域的同源建模子单元，界面似乎受到周围环境的影响N个-聚糖（数据未显示）。事实上，人工引入N个-二聚体界面上的聚糖边缘阻止了GABA受体是一个G蛋白偶联的两个亚单位受体。这一结果表明N个-聚糖作用于二聚体接口(53). 这些研究强烈支持αβ界面可能受到N个-聚糖。目前，整合素α5β1的原子分辨结构还没有由于以下原因被确定：只有少量纯化蛋白质可用；分子的大尺寸；构象的灵活性；同时存在跨膜结构域和N个-两个亚基中的糖基化区域。因此，我们认为整合素突变体，如α5S3-5或α5S5和β1S4-6，可能极大地促进了未来晶体结构的研究。

致谢

笔记

^*这项工作得到了以下核心研究的部分支持：进化科学与技术，日本科学技术署私立大学的“前沿”项目教育、文化、体育、科学和技术部日本的核心对核心计划和对日本青年科学家协会促进科学和武田科学日本基金会。

脚注

工具书类