分子生物学杂志。作者手稿；PMC 2009年6月13日提供。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院54379
钼蛋白组与钼利用的进展
内布拉斯加州大学林肯分校生物化学系，邮编68588-0664
- 补充资料
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摘要
微量元素钼（Mo）在许多生命形式中被利用，是参与氮、硫和碳代谢的几种酶的关键成分。除固氮酶外，钼在蛋白质中与翼蛋白结合，从而在钼酶的催化位点形成钼辅因子（Moco）。虽然许多钼酶在结构和功能上都有很好的特征，但对钼利用的进化分析有限。在这里，我们进行了比较基因组和系统发育分析，以从（i）钼运输和钼利用特性，以及（ii）钼依赖酶的水平，检查细菌、古生菌和真核生物中钼利用的发生和进化。我们的研究结果表明，大多数原核生物和所有高等真核生物都使用Mo，而许多单细胞真核生物，包括寄生虫和大多数酵母，都失去了使用这种金属的能力。此外，真核生物的钼酶家族少于原核生物。二甲基亚砜还原酶（DMSOR）和亚硫酸盐氧化酶（SO）家族分别是原核生物和真核生物中分布最广的钼酶。在高温古细菌中预测到了ModABC运输系统的遥远群火棒菌属.钼吸收的ModE型调节发生在不到30%的钼共同利用生物中。原核生物中钼和硒代半胱氨酸利用之间的联系也得到了确认，其中硒代半月氨酸性状主要是钼性状的一个子集，可能是由于甲酸脱氢酶，一种含钼和硒的蛋白质。最后，对环境条件和依赖或不依赖钼的生物体的分析表明，宿主相关生物体和低G+C含量的生物体倾向于减少其钼的利用。总的来说，我们的数据为钼的利用提供了新的见解，并表明钼在所有三个生命领域的个体生物体中广泛存在，但使用量有限。
关键词：钼，钼蝶呤，钼酶，比较基因组学，进化
介绍
微量元素钼（Mo）存在于原核生物和真核生物中的各种金属酶中，构成这些酶活性位点的一部分。1–三除固氮酶中的铁-钼辅因子（FeMoco）外，钼与蝶呤分子络合，从而在钼依赖酶（钼酶）中生成钼辅因子。5–7一些微生物能够利用钨（W），钨也由钼蝶呤配位。8因此，术语Moco指的是这两种金属的利用。
含钼酶在全球碳、氮和硫循环中催化重要的氧化还原反应。2此前已鉴定出50多种钼酶，其中大多数为细菌来源。2,三,9根据序列比较和光谱性质，这些含钼酶可分为四个家族：亚硫酸盐氧化酶（SO）、黄嘌呤氧化酶（XO）、二甲基亚砜还原酶（DMSOR）和醛：铁氧还蛋白氧化还原酶。10,11每个家族根据其特定底物的使用情况进一步划分为不同的亚家族。例如，DMSOR家族还包括三甲胺-N-氧化物还原酶、生物素亚砜还原酶，硝酸还原酶（异化）、甲酸脱氢酶和亚砷酸氧化酶。这四个家族都可以在原核生物中检测到；然而，真核生物中只有两个家族（SO和XO）包含四个亚科。SO家族包括硝酸还原酶（NR）和SO，而XO家族则以黄嘌呤脱氢酶（XDH）和醛氧化酶（AO）为代表。这些酶是迄今为止分析的所有Mo-utilizing真核生物的典型酶。最近，报道了另外两种Moco结合酶：吡哆醛氧化酶和烟酸羟化酶，它们只存在于黑腹果蝇和巢状曲霉分别是。7
钼酶的功能依赖于额外的基因产物，这些基因产物将钼酸盐阴离子运输到细胞中，并合成和组装Moco。在细菌中，高亲和力钼酸盐ABC转运蛋白（ModABCmodABC公司基因）被描述为包括ModA（钼酸盐结合蛋白）、ModB（膜整合通道蛋白）和ModC（细胞质ATP酶）。7,12,13此外，还报道了一类新的钼/钨转运系统（WtpABC）和一种高度特异的钨酸盐ABC转运体（TupABC）。14,15虽然这两个转运蛋白系统与ModABC转运蛋白的序列相似性都很低，但它们的阴离子亲和力与ModA不同。TupA特异性结合钨酸盐，而WtpA对钨酸盐的亲和力高于ModA，并且其对钼酸盐的亲和力与ModA相似。14,15与细菌相比，真核生物钼酸盐的转运尚不清楚，但最近在拟南芥表明存在高亲和力钼酸盐转运系统MOT1。16
在大肠杆菌，的modABC公司操纵子由一种阻遏蛋白ModE调节，它也控制编码钼蝶呤合成的基因的转录(moaABCDE（莫阿基德）)和钼酶。17–20 大肠杆菌ModE由N端DNA结合域（ModE_N，COG2005）和C端钼酸盐结合域组成。17,18,21C末端结构域包含钼蛋白结合蛋白的串联重复序列（Mop，COG3585；也称为Di-Mop结构域）。18ModABC-ModE系统在原核生物中广泛存在，但并不普遍。22–25在其他Moco利用生物中也观察到ModE样蛋白的变化。25,26另一方面，对WtpABC和TupABC运输公司的监管尚不明确。
在迄今为止研究的有关Moco利用的生物体（例如，细菌、植物、真菌和哺乳动物）中，该辅因子是通过保守的多步骤生物合成途径合成的。7Moco生物合成的第一个模型来源于大肠杆菌.6在这种生物体中，翼蛋白辅因子的生物合成和调节所需的蛋白质由moa-mog公司操纵子。27,28这个金属氧化物避雷器和移动电话操纵子负责翼蛋白辅因子单核苷酸形式的生物合成暴徒操纵子编码翼蛋白鸟嘌呤二核苷酸合成酶，将GMP添加到Mo-complexed翼蛋白辅因子。与钼利用相关的其他操作子的功能尚不清楚。在真核生物中，已经在植物中研究了六种催化Moco生物合成的基因产物（Cnx1-3，Cnx5-7），28真菌29和人类。30–32尽管这些蛋白与细菌中的对应蛋白同源，但并非所有真核生物Moco生物合成机制都能在功能上补充相应的细菌突变菌株。人类和植物使用了不同的命名法，30这里我们用植物命名法来指真核生物Moco合成基因。
近年来，来自生命三个领域的许多生物体的完整基因组已经可用。现在可以检查生物体利用的许多生化途径的发生和进化，包括金属利用。对不同的微量元素进行了一些比较和功能基因组分析。33–38然而，尚未对钼生物合成系统或含钼酶进行全面调查。
在本研究中，我们使用比较基因组分析来更好地了解钼在各种生命形式中的利用。我们的数据表明，钼在生命的所有三个领域都得到了广泛的利用，并揭示了钼利用的进化变化可能受到各种因素的影响。我们的研究结果也突出了钼/钨吸收系统调节的复杂性。此外，原核生物中钼和硒（Se）利用之间的关系表明，硒的利用可能依赖于钼。这些研究揭示了钼在各种生命形式中的广泛利用及其在个体生物中的有限使用，对理解钼利用性状和钼酶的进化具有重要意义。
结果
钼在原核生物和真核生物中的利用
原核基因组分析显示，编码Moco生物合成途径和含Mo蛋白的基因分布广泛（完整列表见表S1). 几乎所有的生物体要么同时拥有Moco生物合成蛋白和已知的钼酶，要么缺乏它们，这表明Moco生物生成特性的发生与Moco依赖酶之间有很好的对应关系。总共发现325种（约72.1%）细菌生物利用Moco。根据高度分辨的系统发育39生命树，显示了不同细菌门中Moco生物合成特性和含Moco蛋白家族的分布。39
细菌中Moco生物合成途径和钼酶的发生这棵树是基于高度分辨的生命系统发育树中的细菌部分（39）。27钼蝶呤辅因子生物合成途径；SO、亚硫酸盐氧化酶；XO，黄嘌呤氧化酶；二甲基亚砜还原酶；AOR，醛：铁氧还蛋白氧化还原酶。没有任何生物具有Moco生物合成途径的门以蓝色显示（如果包含至少三种生物，则以粗体和蓝色显示）。所有生物都具有Moco生物合成途径的门以红色显示（如果包含至少三种生物，则以粗体和红色显示）。
除了包含少量测序基因组的门（例如，<3，浮游菌，水生和酸性细菌)发现几乎所有细菌门都利用钼。所有测序生物绿菌门,异常球菌-栖热菌门,高山杆菌/根瘤菌科,β杆菌/博德特菌,β杆菌/伯克霍尔德菌科,γ蛋白杆菌/巴氏杆菌科,γ蛋白杆菌/弧菌科和γ蛋白杆菌/假单胞菌科以及大多数蓝藻(92.3%),变形菌纲(91.7%),变形菌纲(90.5%),γ-变形杆菌/肠杆菌类（86.4%）和许多其他细菌分支使用Moco。相比之下，在厚壁纲/软体动物和衣原体值得注意的是，我们在五种完全测序的生物体中发现了孤儿XO同源物，它们属于变形菌纲,厚壁菌/梭状芽孢杆菌,螺旋体和热袍菌门缺乏Mo/W转运体或已知Moco生物合成特征成分的基因（参见表S1). 这一观察结果表明，这些生物体中存在未知的钼利用途径（不太可能的情况），或者它们使用了功能上替代XO和其他钼蛋白的其他蛋白质。钼蛋白发挥的功能可能在这些生物体中是不必要的。然而，本研究中观察到的Moco利用率的广泛分布表明，除了所有或大多数生物体利用的几种金属离子外，如铁、锌和镁，Mo也在细菌中广泛存在。
在古生菌中观察到了更广泛的钼利用(). 约95%的测序古生物被发现利用了Moco。因此，钼的利用似乎是一种古老而基本的特征，在这个生命领域的所有物种以及细菌中都是常见的。
古生菌中钼利用和含钼蛋白的存在钼蝶呤辅因子生物合成途径；SO，亚硫酸盐氧化酶；XO，黄嘌呤氧化酶；二甲基亚砜还原酶；AOR，醛：铁氧还蛋白氧化还原酶。没有任何生物具有Moco生物合成途径的门以蓝色显示（如果包含至少3种生物，则以粗体和蓝色显示）。所有生物都具有Moco生物合成途径的门以红色显示（如果包含至少3个生物，则以粗体和红色显示）。
在真核生物中，Mo的唯一已知用途是Moco。我们的分析确定了89种（62.7%）钼依赖生物(，详细信息如所示表S1). 所有动物、陆地植物、藻类、变形菌（包括硅藻和卵菌）和某些真菌（全部Pezizomycotina类还有一些擔子菌門)拥有Moco生物合成基因和已知的钼酶。然而，MOT1钼酸盐转运体仅在三分之一的钼利用真核生物中被发现，这些真核生物是陆地植物、绿藻、条殖菌和变形杆菌。相比之下，所有寄生虫（14.8%，包括肺泡菌/Apicomplexa,内阿米巴科,动成体动物，帕拉巴萨利德和双孢菌门)、酵母菌（21.1%，包括酵母亚门和裂殖酵母菌)和自由生活纤毛虫（1.4%，肺泡菌/Ciliophora)缺乏Mo生物合成蛋白、钼矿酶和MOT1转运蛋白。由于钼的利用在生命的所有三个领域都很普遍，许多原生动物，尤其是寄生虫，似乎失去了利用钼的能力。一个独特的例外是在寄生鞭毛原生动物中检测到孤儿XO，阴道毛滴虫(帕拉巴萨利德菌属门）。考虑到其基因组序列尚未完全完成，钼生物合成蛋白可能对应于未完成的序列。或者，该生物体可能依赖于从宿主摄取Moco。
真核生物中钼利用和含钼蛋白的发生钼蝶呤辅因子生物合成途径；SO，亚硫酸盐氧化酶；XO，黄嘌呤氧化酶。没有任何生物具有Moco生物合成途径的门以蓝色显示（如果包含至少3种生物，则以粗体和蓝色显示）。所有生物都具有Moco生物合成途径的门以红色显示（如果包含至少3种生物，则以粗体和红色显示）。
钼或钨转运蛋白的分布和系统发育
我们分析了原核生物中特征良好的Mo-ABC转运系统（ModABC）和两个二级系统：WtpABC和TupABC（W特异）。这些Mo/W转运蛋白家族的分布摘要见在细菌中，294种生物（占Mo-utilizing细菌的90.5%）具有ModABC转运体。其他两种系统的出现更为有限，尤其是WtpABC，它只在10种生物体中鉴定出。在85个（26.2%）Moco利用生物中发现了W特异性转运蛋白TupABC。相反，这些转运蛋白在古生菌中的分布是不同的。WtpABC是23种（63.9%）钼利用生物中最常见的转运蛋白，而ModABC和TupABC系统的发生率较低（分别为38.9%和33.3%）。这些数据与WtpABC是一种古老的Mo/W转运蛋白的假设一致，而ModABC和TupABC主要在细菌中起作用。14
表1
| 王国 | Moco利用生物 | ModABC运输车（Mo/W） | WtpABC运输车（Mo/W） | TupABC运输车（W） | 无已知Mo/W运输工具 |
|---|
| 古生菌（总数） | 36 | 14 | 23 | 12 | 2 |
| Crenarchaeota/脱硫球菌 | 2 | 2 | - | 1 | - |
| Crenarchaeota/磺酰草 | 4 | - | 4 | - | - |
| Crenarchaeota/Thermoproteales公司 | 三 | - | - | 三 | - |
| 古菌亚纲/古菌亚目 | 1 | - | 1 | - | - |
| 古细菌门/盐杆菌门 | 4 | - | 4 | 2 | - |
| 真古菌门/甲烷杆菌门 | 1 | 1 | - | 1 | - |
| 真古菌亚纲/甲烷球菌亚纲 | 4 | 三 | 4 | - | - |
| Euryrchaeota/甲烷微生物类 | 三 | 2 | 三 | 三 | - |
| 真古宙/甲藻目 | 1 | 1 | - | - | - |
| 真古宙/甲藻 | 5 | 4 | 1 | 2 | - |
| 真古菌门/热球菌门 | 4 | 1 | 4 | - | - |
| 真古宙/热质类 | 4 | - | 2 | - | 2 |
| 纳米古菌群 | - | - | - | - | - |
| 细菌（总数） | 325 | 294 | 10- | 85 | 24 |
| 放线菌属 | 31 | 31 | - | - | - |
| 拟杆菌纲 | 10 | 2 | - | - | 8 |
| 氯苯 | 9 | 9 | - | - | - |
| 衣原体 | - | - | | - | - |
| 蓝藻 | 12 | 11 | - | 1 | 1 |
| 厚壁菌/杆菌 | 18 | 18 | - | - | - |
| 厚壁菌/梭状芽孢杆菌 | 16 | 10 | 1 | 9 | 1 |
| 厚壁菌/乳杆菌 | 4 | 2 | - | 1 | 2 |
| 厚壁纲/软体动物 | - | - | - | - | - |
| 酸性细菌 | 2 | 2 | - | - | - |
| 阿基菲亚科 | 1 | 1 | - | - | - |
| 浮游菌纲 | 2 | 1 | - | - | 1 |
| 氯弗莱克斯 | 5 | 6* | - | - | - |
| 热球菌 | 三 | 三 | - | 1 | - |
| 梭杆菌属 | - | - | - | - | - |
| 热菌科 | - | - | - | - | - |
| 变形杆菌/其他 | 1 | 1 | - | - | - |
| α蛋白杆菌/其他 | 49 | 41 | 1 | 16 | 6 |
| 高山杆菌/根瘤菌科 | 5 | 5 | - | 1 | - |
| α蛋白杆菌/立克次体 | 1 | - | - | - | 1 |
| β杆菌/博德特菌 | 三 | 三 | - | 三 | - |
| β杆菌/伯克霍尔德菌科 | 18 | 18 | 2 | 5 | - |
| β杆菌/奈瑟菌科 | 1 | 1 | - | - | - |
| β杆菌/其他 | 15 | 14 | 1 | 7 | 1 |
| 德尔塔蛋白杆菌 | 19 | 18 | 4 | 13 | 1 |
| 耐热爱泼斯坦杆菌 | 11 | 11 | - | 5 | - |
| γ蛋白杆菌/肠杆菌 | 19 | 18 | 1 | - | - |
| γ蛋白杆菌/其他 | 40 | 38 | - | 12 | 2 |
| γ蛋白杆菌/巴氏杆菌科 | 8 | 8 | - | - | - |
| γ蛋白杆菌/假单胞菌科 | 7 | 7 | - | - | - |
| γ蛋白杆菌/弧菌科 | 11 | 11 | - | 11 | - |
| γ-变形杆菌/黄单藻科 | 4 | 4 | - | - | - |
| 螺旋体动物 | - | - | - | - | - |
系统发育分析用于进一步研究不同生物体中钼/钨运输系统的进化关系。我们使用ModA（ModABC运输系统的周质成分）、WtpA（WtpABC运输系统周质成分(). 首先，使用三个不同家族的所有直系图生成一棵初步树（参见材料和方法). 然后手动选择具有代表性的序列来压缩原始树，而不更改其拓扑。此外，硫酸盐和铁的周质成分3+与ModA相似性低的转运蛋白被用作参考。通过其他程序评估了系统发育树的稳健性，这些程序显示了类似的拓扑结构（参见材料和方法和图S1). 值得注意的是，虽然WtpA和ModA序列属于相同的COG（COG0725），但根据先前的实验分析，它们显示出不同的阴离子亲和力。14在系统发育树中，它们聚集在不同的分支中，这表明它们可能来源于一个共同的祖先基因，并通过突变、选择或漂移而与亲本分离。
原核生物Mo/W转运蛋白周质成分的系统发生树类ModA蛋白显示为红色和粗体，TupA显示为紫色，WtpA显示为绿色，ModA显示为蓝色。根据序列相似性从大量同源蛋白质中选择具有代表性的序列。硫酸盐和铁3+ABC转运子分支被压缩并用姓氏表示。显示支管长度的距离测量值（以条表示）。
在多个火棒菌属高温古生菌。基于Blast的成对比对显示，这些ModA-like蛋白和大肠杆菌ModA或火球菌属水处理厂。系统发育分析也表明它们是所有已知ModA蛋白的外群(). 然而，它们与ModA属于相同的COG（e值2e-17）。我们进一步研究了类似modA基因与钼酸盐结合残基的保存大肠杆菌模式A（1AMF）40和钨酸盐结合富氏古球虫WtpA（2ONS）。41这些类似modA这些基因总是位于包含完整ABC运输系统的操纵子中，包括ABC型通透酶和ATP酶成分。两种成分分别与ModB和ModC具有远缘同源性（基于BLAST成对比对，相似性<25%，e值>0.1）。此外，在一个有机体中，岛热杆菌，的类似modA基因位于模块D基因，存在于一些模式ABC原核生物中的操纵子，参与钼酸盐运输（其确切功能尚不清楚）。12,13对ModA、WtpA和ModA-like序列的多重比对表明，五个残基中有两个或三个参与了Mo结合大肠杆菌ModA（Ser36、Ser63和Tyr194）40在这些ModA-like序列中是保守的(图S2和S3). 其他两个残基（Ala149和Val176）仅提供主链氢，与钼酸盐形成氢键，40虽然没有严格保守，但其他氨基酸也可能为金属离子提供类似的配体。这些数据表明火棒菌属类ModA蛋白应被视为ModA家族中的一个遥远的家族。其他测序生物体中缺少ModA-like蛋白表明该亚家族的分布有限。
我们发现，几个完全测序的生物体，包括两个古生菌和24个细菌，其中包含Moco生物合成途径和含Moco的酶，不具有任何已知的转运体。这些生物大多是远亲、自由生活的生物。这一观察结果表明，可能存在额外的钼/钨吸收系统。我们检测了这些生物体中Moco生物合成操纵子的基因；然而，找不到新的钼/钨特定运输系统的合适人选。在这些生物体中，钼酸盐可能通过硫酸盐转运系统或非特异性阴离子转运蛋白转运。
MOT1是真核生物中唯一已知的钼转运蛋白，最近在拟南芥.16在这项研究中，我们分析了这种转运体在已测序的真核生物基因组中的出现情况。在89种Mo-utilizing生物体中，只有31种具有MOT1同源基因，包括真菌/子囊菌门/培菌门，陆地植物(维氏植物门/链霉菌门)、绿藻(绿藻科/绿藻门)和扭桩。所有动物中都没有MOT1，这意味着这些生物体中存在未知的钼转运系统。
Mo/W运输车的监管
在大肠杆菌，ModABC阻遏物，ModE，直接位于上游并从modABC公司操纵子(). 然而，许多其他生物体，如革兰氏阳性细菌和蓝藻.25此外，观察到ModE_N或Mop的不同结构域融合，表明ModE调控的复杂性。25尽管这些变体的作用尚不清楚，但有人建议它们在ModABC法规中不起作用。25在本研究中，我们分析了全长ModE及其变体（包括单独的ModE_N、Mop/Di-Mop蛋白及其额外的融合形式）在已测序原核生物中的出现情况。在这里，只有全长ModE正交曲线被认为是ModABC转运体的真正调节器。结果如所示（完整分布如所示表S1). 只有一小部分Moco利用生物（细菌和古生菌分别为28.9%和16.7%）具有全长ModE，这表明大多数原核生物可能使用额外或非特定的阻遏物来调节ModABC。
Moco利用生物体中ModABC、ModE和不同ModE变体的基因组组织代表性基因组中的不同基因通过所示的颜色方案显示。（A） ●●●●。全长模式E(大肠杆菌-类型）；（B） ●●●●。模式E_N+拖把/拖把；（C） ●●●●。孤儿模式E_N；（D） ●●●●。MerR-Mop融合；（E） ●●●●。未知1-Mop融合；（F） ●●●●。蓝藻-特定未知2-Mop融合；（G） ●●●●。变形菌纲-特定未知3-ModE_N融合；（H） ●●●●。ModE_N-COG1910融合。
表2
ModE、ModE相关和其他融合蛋白在原核生物中的分布
| | | | 模式（−） |
|---|
| 门 | Moco利用oganism | 不列颠哥伦比亚省ModA | 模式（+） | ModE_N+Mop/Di-Mop（不包括融合） | 孤儿ModE_N（不包括融合） | ModE_N/Mop与其他域融合 |
|---|
| 太古宙（总计） | 36 | 14 | 6 | - | 10 | 3（2还包含ModE_N） |
| Crenarchaeota/脱硫球菌 | 2 | 2 | - | - | - | 模式E_N-COG1910:1 |
| Crenarchaeota/Sulfolobales公司 | 4 | - | - | - | 4 | - |
| Crenarchaeota/Thermoproteales公司 | 三 | - | - | - | 三 | ModE_N-COG1910:2（均包含ModE_N） |
| Euryarchaeota/古生球菌门 | 1 | - | - | - | 1 | - |
| 古细菌门/盐杆菌门 | 4 | - | 2 | - | - | - |
| 真古菌门/甲烷杆菌门 | 1 | 1 | - | - | 1 | - |
| 真古菌亚纲/甲烷球菌亚纲 | 4 | 三 | - | - | - | - |
| 真古菌亚纲/甲烷小球菌亚纲 | 三 | 2 | - | - | - | - |
| 真古宙/甲藻目 | 1 | 1 | - | - | 1 | - |
| 真古宙/甲藻 | 5 | 4 | 4 | - | - | - |
| 真古菌门/热球菌门 | 4 | 1 | - | - | - | - |
| 真古宙/热质类 | 4 | - | - | - | - | - |
| 细菌（总数） | 325 | 294 | 94 | 9 | 36 | 64（33还包含ModE或ModE_N） |
| 放线菌属 | 31 | 31 | - | - | 1 | MerR-拖把：17 |
| 拟杆菌纲 | 10 | 2 | - | - | 1 | 未知1-拖把：2 |
| 氯苯 | 9 | 9 | 9 | - | - | 未知1-Mop:5（均包含ModE） |
| 衣原体 | - | - | - | - | - | - |
| 蓝藻 | 12 | 11 | - | - | - | 未知2-Mop:4 |
| 厚壁菌/杆菌 | 18 | 18 | - | - | - | - |
| 厚壁菌/梭状芽孢杆菌 | 16 | 10 | - | 1 | 三 | - |
| 厚壁菌/乳杆菌 | 4 | 2 | - | - | 2 | - |
| 厚壁纲/软体动物 | - | - | - | - | - | - |
| 酸性细菌 | 2 | 2 | - | - | - | MerR备忘录：1 |
| 阿基菲亚科 | 1 | 1 | - | - | - | - |
| 浮游菌纲 | 2 | 1 | - | - | - | - |
| 氯弗莱克斯 | 5 | 6** | - | - | - | - |
| 热球菌 | 三 | 三 | - | - | - | - |
| 梭杆菌属 | - | - | - | - | - | - |
| 热菌科 | - | - | - | - | - | - |
| 变形杆菌/其他 | 1 | 1 | 1 | - | - | - |
| α蛋白杆菌/其他 | 49 | 41 | 7 | 三 | 14 | ModE_N-COG1910:2（1包含ModE_N+Mop）MerR-Mop:1（1包含ModE） |
| 高山杆菌/根瘤菌科 | 5 | 5 | - | - | 5 | - |
| α蛋白杆菌/立克次体 | 1 | - | - | - | - | - |
| β-变形杆菌/博德特氏菌 | 三 | 三 | 三 | - | - | ModE_N-COG1910:3（均包含ModE） |
| β杆菌/伯克霍尔德菌科 | 18 | 18 | 17 | - | - | ModE_N-COG1910:18（17包含ModE） |
| β杆菌/奈瑟菌科 | 1 | 1 | - | - | - | - |
| β杆菌/其他 | 15 | 14 | 8 | 1 | 4 | ModE_N-COG1910:7（4包含ModE，2包含ModE_N） |
| 德尔塔蛋白杆菌 | 19 | 18 | 5 | 三 | 三 | - |
| ε蛋白杆菌 | 11 | 11 | 5 | - | 1 | 未知1-Mop和未知3-ModE_N:4 |
| γ蛋白杆菌/肠杆菌 | 19 | 18 | 18 | - | 1 | - |
| γ蛋白杆菌/其他 | 40 | 38 | 7 | 1 | 1 | - |
| γ蛋白杆菌/巴氏杆菌科 | 8 | 8 | 4 | - | - | - |
| γ蛋白杆菌/假单胞菌科 | 7 | 7 | 7 | - | - | ModE_N-COG1910:1（1包含ModE） |
| γ蛋白杆菌/弧菌科 | 11 | 11 | 三 | 三 | - | - |
| γ蛋白杆菌/黄单胞菌科 | 4 | 4 | - | - | - | - |
| 螺旋体动物 | - | - | - | - | - | - |
在细菌中，一些缺少ModE的含有ModABC的生物体具有单独的ModE_N和Mop/Di-Mop蛋白质或孤立的ModE_M蛋白质(,). 此外，为Mop鉴定了五种不同类型的结构域融合（3种类型，)和ModE_N（2种类型，)主要在细菌中。对分离结构域和融合蛋白的基因组位置的分析表明，除了两种ModE_N融合蛋白（包括一种ModE_N-COG1910融合蛋白，该蛋白被认为可以调节甲酸脱氢酶的转录，以及一种ε-耐热杆菌特异性未知的3-ModE_N融合蛋白，该蛋白可能是转录激活剂而不是阻遏物25)，编码这些蛋白质的基因接近或甚至位于modABC公司操纵子，提示与ModABC转运体的功能关系(). 在几个含有ModE的生物体中可以检测到这些ModE-like变体的同源序列（参见表S1). 目前，还不能就这些ModE变体的功能得出结论。一种假设是，单独的ModE_N和Mop/Di-Mop蛋白在调节ModABC转运体方面的功能可能与全长ModE相似(). 孤儿ModE_N的功能尚不清楚。有人认为，ModE_N可能足以介导DNA结合以进行ModABC调节，尽管较弱。21此外，MerR-Mop融合蛋白在放线菌门可能是ModABC或其他Mo相关基因的候选调节器，因为该蛋白包含MerR-like转录因子域和Mop域。然而，几乎一半含有ModABC的生物体同时缺乏ModE及其变体，这一事实表明，这些生物体中存在新的调节因子来调节ModABC。
在几种缺乏ModABC转运蛋白的原核生物中也发现了同源ModE或ModE_N序列，尤其是在古菌中，十分之七的含ModE_N的生物体缺乏ModABC转运蛋白。我们注意到，在一些基因组中，ModE或ModE_N基因位于TupABC或WtpABC转运体编码基因附近，这表明在一些生物体中，这两个二级Mo/W转运体系统也可能通过ModE样机制进行调节(). 需要进一步的实验验证来测试这种可能性。
一些钼共利用生物中ModE、ModE_N和二级Mo/W转运蛋白的基因组组织代表性基因组中的不同基因通过指示的颜色方案显示。
钼酶在原核生物和真核生物中的存在
–还显示了不同的钼蛋白家族在生命的三个领域中的出现，包括含钼酶和固氮酶。如上所述，钼生物合成/钼转运组分的出现与钼酶之间有很好的对应关系。在细菌中，除AOR家族（发现于50种生物体中）外，其他含Moco的酶分布广泛（DMSOR、SO和XO分别为95.1%、68.9%和66.8%）。大多数生物体使用的家族DMSOR主要由硝酸还原酶（异化）和甲酸脱氢酶代表。许多生物体具有两个或三个含Moco的蛋白质家族以及这些家族中的几个亚家族。然而，在一些门中SO和XO家族的出现率很低或缺失（例如，SO在厚壁菌/梭状芽孢杆菌,拟杆菌纲,绿菌门，XO输入绿菌门,蓝藻,变形菌纲和几个γ蛋白杆菌分支），其中大多数具有DMSOR家族，表明了钼酶之间的独立关系。仅发现67种生物具有固氮酶，其中大多数（约97%）利用了Moco。
在古生菌中，在所有Mo-utilizing生物体中都发现了DMSOR家族的成员。与细菌相比，在69.4%的Moco利用生物中发现了AOR家族，其发生率远高于SO和XO家族（分别为47.2%和30.6%）。固氮酶只存在于产甲烷古菌中，并且在所有古菌中都存在。
与原核生物相比，真核生物只有两个钼酶家族，即SO和XO。所有具有钼利用特性的生物都有SO家族，95.5%的生物有XO家族。所有动物(后生动物)陆地植物、扁枝菌属和扁枝菌属都具有钼矿酶。有趣的是，在酵母中没有检测到Moco利用特性和钼酶酵母亚门据报道酿酒酵母不含钼酶。7然而，有人提出其他一些酵母，例如嗜氮念珠菌,异头毕赤酵母和安格斯毕赤酵母，利用含钼同化NR。42–44在本研究中，我们无法在测序酵母基因组中检测NR的同源物，包括白色念珠菌,光滑念珠菌,热带念珠菌和吉列蒙迪毕赤酵母Moco生物合成途径和同化NR的缺失强烈表明酵母对Mo的利用丧失。
生命三个领域钼利用的一般进化模型
根据上述研究结果，有可能推断出钼在生命三个领域的利用的一般模型。考虑到各种Moco结合蛋白的共同作用是催化全球碳、氮和硫循环中的重要氧化还原反应，因此Moco对大多数生物体来说都是必不可少的，这一点也就不足为奇了。然而，由于失去了Moco生物合成途径和含Moco的酶，一些生物体甚至完整的分支可能已经进化出了此类反应的替代机制。
在原核生物中包含50多个亚科的四大钼酶家族中，只有SO和XO（包括NR、SO、XDH和AO亚科）跨越所有三个生命域。如果一个蛋白质家族在生命的所有领域都有代表性，那么它被认为存在于最后一个普遍的共同祖先中。45因此，我们推测SO和XO家族是在共同祖先中进化而来的。另外两个钼酶家族DMSOR和AOR的出现率较低，仅在原核生物中检测到。
在大多数原核生物门中，大多数生物保留了钼的利用特性，但也有一些生物失去了它。为了研究水平基因转移（HGT）对这些生物中钼利用的贡献，我们分析了钼生物合成酶和钼结合蛋白的系统发育，但无法确定远缘生物中完整钼利用特征的单一HGT事件（包括Moco生物合成途径和相应的钼酶）（数据未显示）。这一观察结果与HGT不太可能在获得Moco利用方面发挥重要作用的观点一致，因为参与Moco生物合成的基因位于几个操纵子中，其中一些操纵子通常分散在基因组中。另一方面，在两个远亲门中观察到Moco利用特性完全丧失：厚壁纲/软体动物和衣原体事实上，他们的姐妹门（例如芽孢杆菌目和梭菌属对于软体动物)Moco的普遍利用表明，Moco利用特性的丧失在这两个分支的早期祖先中独立发生。这两个门中的所有测序生物都是与宿主相关的生物，它们可能利用宿主的Moco结合蛋白。在其他几个进化上遥远的血统中，例如厚壁菌/乳杆菌和α蛋白杆菌/立克次体，很少有生物能够使用Moco。对这些少数生物中Mo利用特性的系统发育分析（如上所述）不支持其他物种的HGT事件。因此，我们推断Moco用于厚壁菌/乳杆菌和α蛋白杆菌/立克次体后来独立失踪。此外，钼酶的损失应伴随着Moco生物合成途径的损失。然而，在螺旋体和热袍菌门，完全失去了Moco生物合成途径，检测到XO同源物。目前尚不清楚这些孤儿XO同源物是否可以使用钼作为辅因子。
在真核生物中也观察到类似的趋势。大多数门（包括所有动物）从所有真核生物的普遍祖先那里继承了Moco利用特性，而包括所有寄生虫在内的某些谱系似乎已经失去了它。在真菌中观察到一个有趣的例子。所有已测序的支原体都包含Moco生物合成特性和四个真核钼蛋白亚家族。相比之下，只有少数酵母具有钼依赖NR，这是这些生物体中唯一报道的钼酶。酿酒酵母,葡萄裂殖酵母所有其他测序酵母都失去了使用这种微量元素的能力。考虑到在真核生物中从远缘物种获得整个钼利用特性的困难，我们建议酵母的共同祖先（包括酵母亚门和裂殖酵母菌)利用钼作为辅因子，至少对NR是如此。然而，这一特性后来被丢失了。事实上，Mo-utilizing酵母的姊妹种中不存在含钼NR（例如，它存在于嗜氮念珠菌但不在白色念珠菌和光滑念珠菌)表示最近的损失事件。NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐仅存在于植物、藻类和真菌等自养生物中。2,三大多数酵母物种中都没有Mo依赖性NR，这表明这些生物体不需要Mo依赖的硝酸盐还原为亚硝酸盐，或者已经进化出了其他Mo依赖机制。
讨论
钼和钨以单核形式存在于生命所有三个领域的各种酶的活性位点中。46–48这些酶的活性位点包括与吡喃蝶呤分子和其他多种配体（如氧、硫和硒）配位的金属离子。49,50此外，这些蛋白质可能具有其他氧化还原辅因子，如铁-硫中心、黄素和血红素，它们参与分子内和分子间的电子转移过程。49人们在鉴定和表征各种生物体中的钼生物合成成分和钼依赖酶方面做了大量工作。相反，钼利用总体性状的发生和演变尚不清楚。在本研究中，我们分析了钼吸收系统、Moco生物合成基因和含钼蛋白的系统发育谱和调控，以更好地了解自然界中钼的进化和当前用途。我们的数据揭示了具有测序基因组的生物体中钼利用的模式和特性，并为理解原核生物和真核生物中钼利用特性的动态演变提供了新的见解。
钼利用特性在原核生物中的广泛分布表明，这种微量元素基本上可用于所有原核生物门。相反，几个进化上较远的门（例如。，厚壁纲/软体动物和衣原体)暗示着这些分支失去了这种特性。Mo生物合成途径的出现与已知的含Moco的蛋白质家族的存在之间有很好的对应关系。然而，一些生物体缺乏含Moco的蛋白质或Moco生物合成成分的少数例外情况表明，这些生物体中存在额外的Moco依赖蛋白家族或替代的Mo利用途径。
除了经典的ModABC运输系统外，还预测了一个遥远的类似ModABC的群体火棒菌属虽然ModA-like蛋白似乎是所有三种已知Mo/W转运蛋白的外群，但它们与大肠杆菌模式A。以下人员的在场类modB和类似modC基因（以及模块D同一操纵子中的基因）暗示它们形成了一组遥远的ModABC转运蛋白，并参与钼/钨的摄取。该组的正射影像只能在火棒菌属种，但不在同一古生物门的其他姊妹种中。这些ModABC-like转运体可能是从祖先的ModABC系统进化而来，并在火棒菌属另一方面，MOT1是真核生物中唯一已知的钼转运蛋白，仅在三分之一的钼利用生物中检测到，这表明大多数真核生物（包括所有动物）使用额外的未知转运系统吸收钼。
我们研究了原核生物中ModE相关的ModABC调控。令人惊讶的是，只有不到30%的Mo-utilizing生物体拥有全长ModE调节器。超过70%的细菌和80%的古菌似乎没有使用大肠杆菌-ModABC法规的ModE类型。孤儿Mop或Di-Mop蛋白对ModE相关调节没有特异性，因为它们也存在于具有不同功能的其他蛋白质中（例如，Mop结构域存在于ModC的C末端，而Di-Mop结构域则存在于与细胞内Mo稳态有关的ModG中）。尽管一些物种既含有ModE_N蛋白又含有Mop/Di-Mop蛋白（这表明其功能与ModE相似），也含有孤立的ModE_N（可能介导较弱的ModABC调节），但几乎一半的含有ModABC的生物体缺乏ModE型ModABC调节。这一发现表明，在这些生物体中存在着新的或非特定的钼酸盐吸收途径。此外，由ModE_N和Mop结构域组成的不同融合蛋白的出现表明存在更复杂的钼吸收、Moco生物合成和利用调控网络。对ModE_N/ModE和TupABC/WtpABC转运体的基因邻域分析表明，这两种二级Mo/W转运体在某些生物体中也可能受到ModE型系统的调控。
含钼蛋白的分析为分析钼蛋白在各种生物体中的分布和进化提供了一种直接的方法。AOR是第一种在结构上表征为含有Moco型辅因子的蛋白质的酶，它被认为是古生菌中负责醛和羧酸相互转化的主要酶。51然而，它是已知的最罕见的含有Moco的细菌蛋白质，这表明大多数细菌不需要依赖AOR的醛类氧化。其他三个钼酶家族分布更为广泛，尤其是DMSOR家族，几乎在所有钼利用细菌和所有钼利用古菌中都存在。二甲基亚砜（DMSOR）家族的酶催化各种反应，包括氧原子转移到或从底物的可用电子对转移或C-H键断裂。2,10,52–55NR（异化）和甲酸脱氢酶是DMSOR家族的两个主要成员。甲酸脱氢酶α亚基（FdhA）也是一种含硒半胱氨酸（Sec）的蛋白质，可能负责维持原核生物中的Sec解码特性。56我们比较了钼和Sec-utilizing生物在原核生物和真核生物中的分布，发现Sec-utillizing生物本质上是原核生物中钼依赖生物的一个子集(,表S1). 这些数据表明，Sec性状依赖于原核生物中的钼利用性状，因为甲酸脱氢酶是一种广泛存在的钼酶，是原核生物硒的主要使用者。此外，只有不含钼的蛋白质固氮酶在细菌和古菌中的出现有限。这种酶被几种生物用来固定大气中的氮气（N2). 事实上，在所有产甲烷古菌中都发现了这种蛋白，这意味着这种蛋白的功能对这些生物来说是必不可少的。
生活三个领域中Moco利用率和Sec利用率的分布文恩图显示了古生菌、细菌和真核生物中Moco利用率和Sec利用率之间的关系。
我们试图建立钼在生命三个领域利用的一般进化模型。Moco生物合成途径和至少两个钼酶家族（SO和XO）可能存在于最后一个普遍的共同祖先中。由于钼酶在碳、氮和硫代谢中催化的重要氧化还原反应，大多数原核和真核物种的钼利用特征在进化上是保守的。此外，Moco利用特性的独立丧失（而不是来自其他物种的HGT），以及可能出现的替代Mo非依赖途径，在Mo利用的进化中也起到了一定作用。
我们假设，由于生物体中同时存在（或两者都不存在）Moco生物合成特性和钼酶，并且在各种细菌门中观察到这些模式，某些常见因素（例如栖息地）可能影响了钼利用的获得/损失。为了检验这种可能性，我们分析了环境条件（例如栖息地、氧气需求、最佳温度和最佳pH值）和其他因素（例如基因组大小、g+C含量）在已测序原核生物中钼利用中的作用。此前，类似的策略被用于分析细菌中硒的进化。56 显示了具有或缺乏Moco利用率的生物体在多个此类因素方面的分布。
环境因素、生物特性与钼利用性状的关系将所有生物分为两类：Moco（+），即含有Moco利用特性；Moco（−），即缺乏Moco利用率。（A） 栖息地。（B） G+C含量。（C） GC含量影响的不同表示。
我们发现，大多数不利用Moco的细菌是与宿主相关的（即寄生虫或共生体，)这意味着宿主相关的生活方式通常会导致钼利用率的损失，可能是由于宿主的空间和资源有限或钼途径可用。这与厚壁纲/软体动物和衣原体，所有这些都是主机关联的，无法使用Moco。这一观点也得到了Mo在α蛋白杆菌/立克次体在这个门中，19种生物中只有一种利用了钼(泛白念珠菌，一种生活在海洋表层水中的海洋细菌）。然而，它也是该分支中唯一的非宿主相关生物。
我们的数据表明，该门中所有与寄主相关的生物体都完全丧失了钼利用特性，而不是HGT泛白念珠菌此外，在许多门中，钼共同利用生物的基因组具有显著较高的G+C含量，这表明G+C的含量增加与钼利用的增加相关(). 在许多门中发现了缺乏Moco利用特性的低G+C含量（即GC<40%）的生物体，表明这种相关性是显著的。不同分支中G+C含量低的生物失去Moco利用特性的原因尚不清楚。其他因素，如需氧量、革兰氏菌株、最佳温度和pH值，似乎对钼的利用没有影响。在古生菌中，只有两种生物，施塔特马纳甲烷球（古细菌中唯一的已测序寄生虫）和骑行纳古菌（一种古老的高温厌氧专性共生体，其基因组较小，已失去使用镍、钴、铜和硒等大多数微量元素的能力），缺乏钼的利用，两个基因组的G+C含量都很低（27.6%和31.6%）。这些数据为我们在细菌中的观察提供了额外的支持。因此，宿主相关的生活方式以及G+C含量的减少似乎与Mo利用的损失有关。
基于上述因素，我们还检查了不同钼酶家族的分布情况，发现了类似的趋势。此外，还观察到不同钼酶的其他特征(). 例如，拥有AOR蛋白的生物体喜欢厌氧环境，而含有SO、XO或DMSOR蛋白的有机体喜欢有氧环境。含有固氮酶的生物体既有利于厌氧条件，也有利于相对温暖的条件（没有嗜冷生物体具有固氮酶）。这些数据表明，尽管不同的钼酶依赖于相同的过程，例如钼的利用率和钼钴的合成，但它们都受到独立的动态进化过程的影响。
环境因素、生物体特性与不同钼酶的关系（A） AOR和SO的氧气需求。（B）固氮酶的氧气需求和最佳温度。
真核生物中钼酶的类似研究提供了有关钼在这一生命领域中利用的信息。与原核生物一样，真核含钼蛋白的分布基本上与钼利用特性相匹配。然而，只能检测到SO（包括NR和SO）和XO（包括XDH和AO）家族，这表明真核生物中的钼蛋白组要比原核生物小得多。这四个亚科在不同生物体中的功能作用已被研究。2,三,7NR是硝酸盐同化的关键酶，不存在于动物体内，除此之外，其他三种酶也存在于各种分支中，包括单细胞生物和动物。SO催化亚硫酸盐氧化为硫酸盐（含硫氨基酸降解的最后一步）。7XDH是嘌呤降解的关键酶，可将次黄嘌呤氧化为黄嘌呤s，黄嘌呤斯氧化为尿酸，而AO可催化各种芳香和非芳香杂环和醛类的氧化，并将其转化为相应的羧酸。7所有寄生虫都失去了合成Moco的能力，这与我们在原核生物中发现的情况一致，表明真核祖细胞中可能存在钼的利用，并且由于钼的可利用性降低或对宿主相应代谢途径的依赖性，对寄生虫来说不再需要钼。真菌中同时存在钼依赖性和钼依赖性微生物。大多数酵母中Mo生物合成途径和Mo依赖NR的最近丢失，包括酿酒酵母，表明在这些生物体中，依赖于钼的硝酸盐同化可能是不必要的，或者已经被其他途径所取代。众所周知，硝酸盐同化是无机氮转化为氨进而转化为有机氮的两个主要生物过程之一。58尽管酿酒酵母缺乏Moco生物合成特性和NR，它含有许多将谷氨酰胺转化为谷氨酸的基因，是有机氮的主要来源。59此外，储存在酵母液泡中的谷胱甘肽（GSH）可以作为氮饥饿期间的替代氮源。60目前尚不清楚酵母的祖先是否拥有其他钼结合酶。然而，酵母中可能已经进化出了硫和碳代谢的替代Mo非依赖途径。钼依赖型和钼依赖型真菌都是自由生活的生物体，在这种情况下，我们无法确定与钼利用相关的共同环境因素。因此，其他未知因素可能影响了真菌对钼的利用。未来的挑战是发现这些因素以及影响钼在三个生活领域中利用的其他特征。
总之，我们通过检测参与Moco生物合成、Mo运输和Mo利用的蛋白质（钼酶）的出现情况，报告了原核生物和真核生物中钼利用的综合比较基因组学分析。我们的数据揭示了钼利用的一个复杂而动态的演化过程。除了寄生虫和基因组G+C含量低的生物体外，大多数细菌和古菌都利用Mo。一组遥远的ModABC运输系统于火棒菌属物种。由于ModE型ModABC调节系统仅在有限数量的钼共同利用生物中出现，因此对钼吸收的调节必须比以前想象的更加复杂。与在原核生物中广泛使用钼相比，在真核生物中使用钼元素受到了更多限制，无论是在依赖钼的生物体数量上还是在其中出现的钼蛋白家族数量上。此外，宿主相关条件似乎会导致钼利用率的损失。
材料和方法
钼转运体、转运体阻遏物、Moco生物合成基因和含钼酶的鉴定
我们使用了一些特征良好的Mo/W转运蛋白或已知参与Moco生物合成途径的蛋白质作为种子序列，在序列数据库中搜索同源物。在原核生物中金属氧化物避雷器(moaA-moaE型),国防部(modABC公司和模式E)以及移动电话(moeA公司和移动基站)操作数来自大肠杆菌，WtpABC来自暴躁P.furiosus和TupABC来自嗜酸氨基杆菌使用e值<1的TBLASTN鉴定一组初级同源序列。然后在每个门内进行迭代TBLASTN搜索，使用原始集合中的不同同源序列作为查询，以识别更遥远的同源序列。同时，使用默认参数的三个PSI-BLAST循环来鉴定远缘同源物。同源蛋白被定义为双向最佳点击。61必要时，还通过基因组位置分析或构建相应蛋白家族的系统发育树来确认同源序列。Moco性状的发生是通过这些基因中大多数存在的要求来验证的。使用类似的方法鉴定了已知Moco蛋白家族的成员以及固氮酶。
在真核生物中，我们使用了MOT1（一种最近在植物中发现的Mo特异性转运体），以及来自拟南芥作为种子序列检测钼酸盐转运体和测序基因组中Moco的利用。考虑到单细胞真核生物中Moco生物合成途径的不确定性和一些基因组序列的不完整性，Moco利用特性在这些生物体中的存在通过以下标准得到了验证：至少有两个参与Moco生物合成的蛋白质的同源序列，并且在同一生物体中检测到至少一个已知的含Mo蛋白质。
多序列比对和系统发育分析
为了研究利用Mo的生物在不同门中的分布，我们采用了Ciccarelli等人开发的系统发育树。，39这是基于191个物种中31个同源基因与已测序基因组的串联。用标准方法重建了每个Mo/W转运蛋白系统的系统进化树。序列与CLUSTALW对齐62使用默认参数。排除了高度可变（间隙丰富）区域中的模糊排列。然后检查产生的多重比对是否保留功能残留物，并手动编辑。此外，肌肉63使用校准工具评估CLUSTALW结果。使用PHYLIP程序进行系统发育分析。64PROTDIST计算成对距离矩阵，以估计每个位置的预期氨基酸替换。使用Neighbor获得邻接（NJ）树，并使用PROTPARS确定最简约的树。然后使用PHYML通过最大似然（ML）分析评估这些树的鲁棒性65以及使用MrBayes进行系统发育的Bayes估计。66
脚注
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