培养的神经嵴（NC）细胞在体外远离对方，迅速分散10.爪蟾神经嵴外植体显示，只有前缘细胞是极化的，如扫描电子显微镜（SEM）所示，前部有大的片状足细胞；图中的箭头)或在表达膜定位GFP的活NC外植体中(). 时间推移分析表明，边缘细胞在迁移方向上的持久性高于外植体内部的细胞(). 为了区分这些极性和迁移的差异是否对应于两个不同的细胞群体，或是由于细胞间的接触，我们将NC外植体分离成单个细胞，然后将其重新聚集成小或大的簇。大小集群中的外周细胞迅速极化并相互迁移()内部细胞随机移动(补充图2和电影1)类似于非游离外植体。此外，这些外植体的随机迁移的内部细胞在损伤或移除相邻细胞而形成自由边缘时会发生极化(补充图3). 这些结果表明，领导的差异行为与外植体中的内部细胞不是由于固有的细胞差异，而是由于相邻细胞之间的相互作用。此外，前导细胞（由其在外植体边缘的位置决定）在非游离簇中的平均持久性远高于单个细胞；后者通常进展甚微，并循环往复，尽管其整体迁移速度更快(,补充电影2). 据报道，对于表现出运动接触抑制的细胞类型，也存在类似的现象1总之，这些结果表明培养的NC细胞的定向迁移依赖于细胞间的接触，这可能会抑制导致细胞极化的细胞突起的形成。
细胞-细胞接触极化迁移NC细胞在体外培养NC在体外并通过SEM（a-c）或延时显微镜对表达膜GFP和核RFP（d-g）的细胞进行分析。a中的红色方块表示前导单元格（由其在迁移边缘的位置定义，其他前导单元格的放大倍数较高显示在b和c中）。箭头：跛足纲（通过扫描电镜（SEM），c或荧光（d），注意它们仅存在于前导细胞中）。箭头：迁移方向。b、c中的棒材：50μm。（d’）d中显示的前导（蓝色）和尾随（红色）单元格轨迹。（e）分离和重新聚集NC单元格的三帧延时。（f，g）比较一组NC细胞迁移的时间投影与单个细胞。数字表示同一单元格在相隔10分钟的不同时间段的位置。沿蓝线追踪。群体迁移（白色条）或单个细胞迁移（灰色条）的迁移持续时间（h）和迁移速度（i）（p<0.005，n=60）。
为了研究NC细胞面对其他细胞时的行为，我们开发了一种外植体对抗试验1，11.两个NC外植体在很近的地方培养，这样它们的主导细胞就会遇到另一个外植体向相反方向迁移的细胞(). 我们发现NC外植体的细胞侵袭中胚层()和外胚层（未显示）外植体，但不得侵入其他NC外植体(；补充图4a-c和电影3). 共聚焦显微镜分析表明，当NC细胞与其他NC细胞接触时，它们停止迁移，但一些细胞穿透了中胚层外植体的深层组织(；补充图4d-i). 这些观察结果表明，接触抑制运动发生在NC细胞（同型）之间，而非NC细胞和其他细胞类型（异型）之间4，5，9很容易推测，这种运动的同型接触抑制可能在指导NC细胞在正常发育中的迁移中发挥作用。为了确定这种情况是否属实，我们开发了对抗分析体内表明NC细胞可以侵入邻近组织爪蟾缺乏NC的胚胎()，但当主机NC存在时，此入侵被阻止(). 此结果与具有此作用的运动接触抑制相一致，但不能直接证明NC细胞表现出运动接触抑制。为此，我们在外植体对抗实验中对单个细胞进行了延时分析。当一个NC细胞与另一组细胞接触时，它的椭圆台会塌陷，迁移方向也会改变(,补充电影4). Abercrombie对运动接触抑制的最初定义精确地描述了这一点，即“一个细胞在与另一个细胞接触后停止向同一方向运动的现象”5迄今为止，仅描述了运动接触抑制在体外。解决是否也会发生这种情况体内，我们使用了两个Sox10-GFP转基因斑马鱼品系，其中一个在细胞质中表达GFP12另一个在NC细胞膜中，并使用活体成像技术分析其迁移。与观察结果类似在体外当两个NC细胞接触时，它们改变迁移方向，突起塌陷(;补充图5和补充电影5-7). 运动的接触抑制可以通过细胞间接触后速度的变化来测量4，11。每次细胞碰撞后，细胞迁移方向都会发生很大变化(,补充方法)两者都有在体外和体内（速度：; 加速度：). 正如Abercrombie所预测的那样，这些变化不是随机的，而是强烈偏向于与碰撞相反的方向（p<0.005）5，11同样，在爪蟾，移植的NC细胞融入内源性迁移途径并定向迁移(). 然而，当宿主NC被移除时，嫁接的NC失去其定向迁移行为()，表明NC迁移的方向性取决于与其他NC细胞的相互作用，支持我们的结论，即正常NC迁移需要接触抑制运动体内.
NC细胞运动的接触抑制在体外和体内（a） 实验设计。（b） 运动接触抑制分析。碰撞前后测量平均速度Δt min。计算每个细胞的加速度（红色）。初始轨迹对齐后计算的碰撞角度（θ）。（c-f）对峙外植体的侵入。（c） 北卡罗来纳州/北卡罗来那州对峙中没有入侵（i），（ii）中的轮廓，重叠区域为黄色；如（d）所示。（e） NC外植体完全侵入并覆盖中胚层外植体（i），轮廓如（ii）所示，重叠区域为黄色；如（f）所示。f:NC入侵路径中的绿色箭头（请参阅补充图3用于支持共焦图像）。（g-l）接触抑制运动。（g） 两个假彩色NC细胞之间的碰撞在体外。时间单位为分钟。白色箭头：迁移方向；红色箭头：碰撞。（h） NC的速度矢量在体外，初始速度矢量（红色箭头）。（i） NC碰撞的加速度向量在体外碰撞后，它们聚集在一起（p<0.005，n=10）。（j） 两个NC单元碰撞（C1、C2）体内显示为两个连续两分钟帧之间的差异。绿色：新区；红色：塌陷区；黑色箭头：迁移方向；红色箭头：单元接触；白色箭头：塌陷突起。（k）体内速度矢量。（l）体内加速度。碰撞后它们聚集在一起（p<0.01，n=10）。（m-o）NC入侵体内.i，ii：侧视图；iii：沿ii所示虚线的横截面。NC细胞不能入侵具有NC的相邻胚胎（n；入侵的0%，n=15），但可以入侵没有NC的胚胎（o；箭头，入侵的80%，n=10）。（p，q）单元方向性体内将一小群核RFP标记的NC细胞移植到正常胚胎中（p）或移植到其中NC先前被去除的胚胎中（q）。请注意，移植细胞在完整胚胎中定向迁移（持续时间：0.6±0.04，n=30），但在去除宿主NC时不迁移（持续性：0.2±0.02，n=20）。
接下来，我们探讨了NC细胞接触抑制运动的分子机制。先前的研究表明，Wnt平面细胞极性（PCP，或非规范）通路是NC迁移所必需的爪蟾和斑马鱼胚胎，而标准Wnt信号则不是13，14为了确定PCP信号是否参与接触性运动抑制，我们分析了表达显性负型Dishevelled（DshDep+）的细胞，该负型Disshevelled专门抑制PCP途径15在对照外植体中，只有前导细胞高度极化，延伸了前面的细胞突起，而尾细胞则没有(). 相反，DshDep+细胞没有极化，而是向各个方向延伸出大的突起(). 实时成像显示，表达DshDep+的细胞相互攀爬，在相邻细胞之间延伸突起，这是一些转移癌细胞的特征三，5，9(;补充电影8). 所有DshDep+（前导和尾随）单元的行为与尾随控制单元相似，这是因为它们的迁移持久性低，并且它们改变方向的角度也不同(). 分离的对照细胞和DshDep+细胞在持续性和迁移速度上没有观察到差异，两者的行为都像拖尾细胞(，补充电影9). 这表明PCP信号对NC迁移的影响需要细胞间的接触。
PCP信号对细胞接触的影响（a-c）。的SEM爪蟾培养NC表达DshDep+。红色方框表示前导单元格。其他领先细胞的高倍视图如b和c所示。箭头：细胞突起；箭头：迁移方向。条形图：25μm in b，50μm in c.（d，e）双平面共焦图像，显示细胞突起（红色）和细胞形状（绿色）。细胞突起仅在对照外植体（d）的边缘产生，而在DshDep+细胞之间观察到细胞突起（e中的箭头）。（d’，e’）d和e的示意图。（f-i）迁移NC细胞的轨迹分析。蓝色：先导细胞；红色：拖尾单元格。控制（f）或DshDep+（g）单元的轨迹。前导（蓝色）和尾随（红色）对照（h）或DshDep+（i）细胞的迁移角分布与距原点的距离。（j-m）游离NC细胞迁移分析。（j，k）对照细胞（j）和DshDep+细胞（k）每10分钟拍摄五帧重叠。数字：单元格的连续位置。蓝线：轨道。计算对照组（白色条）和DshDep+（灰色条）细胞的持续时间（l）和速度（m）。（p<0.05；n=62）。
测试运动接触抑制是否依赖于PCP信号体内，我们测量了对照胚胎和PCP信号被破坏的胚胎在细胞碰撞前后的细胞迁移速度（通过表达DshDep+，PCP配体Wnt11的显性阴性或PCP通路成员的反义吗啉）斜视，Stb16或皮刺1，Pk117). PCP抑制细胞的跛足在相互碰撞时无法崩溃体内即使在接触1小时后(补充图6a：控制，b-c PCP中断，补充电影10). 与对照细胞相反()，这些细胞不会显著改变迁移方向()如小加速度矢量所示，细胞速度几乎不受细胞间接触的影响（p>>0.05，). 相反，PCP抑制的细胞会相互迁移，保持紧密接触(补充电影10). 进行了类似的观察在体外通过表达Wnt11（dnWnt11）的显性阴性基因DshDep+抑制PCP信号后15一种吗啉酸，对抗与哺乳动物Wnt11（Wnt11R）密切相关的蛋白质18，19或dnWnt11/Wnt11R MO混合物(;补充图7e，f)PCP抑制的细胞在碰撞后没有塌陷其突起(补充图7a-c). 此外，当控制细胞和表达DshDep+的细胞相遇时，只有控制细胞折叠其跛足并远离DshDep+细胞(补充图7d和电影11)，表示PCP/Dsh信号仅在响应小区中需要。
接触抑制运动：PCP和RhoA活性的要求分析了细胞碰撞体内（a-d，g-j）和在体外（e、f、k、l）。在指定的处理后测量速度（a-f）和加速度（g-l）。所有面板的比例相同。速度的变化在对照组中显著且聚集（p＜0.005，n＝10）。在任何PCP治疗中均未观察到显著变化（p>>0.05，所有病例n=10）（m-p）。不同的PCP部件位于细胞-细胞接触处（箭头）。mRFP：膜-RFP；（m） Wnt11-YFP。（n） Fz7-YFP公司。（o） 图纸-GFP。（p） 在细胞碰撞过程中分析表达Dsh-GFP的细胞。细胞轮廓取自DIC图像，时间单位为分钟；箭头：迁移方向；箭头：显示Dsh本地化的单元格触点。（q-u）RhoA的作用。（q-s）RhoA活性的FRET分析。（q） 两个接触的NC细胞显示位于细胞接触处的RhoA活性（箭头）。（r） 单个NC单元。（s） RhoA FRET效率。黑色条：接触的电池；灰色条：单个单元格；白色条：PCP通过表达DshΔN.***而被激活的单个细胞：p<0.005；n=12每种情况。（t，u）在岩石抑制剂Y27632存在的情况下分析了细胞碰撞。（t） 速度矢量；（u） 加速度矢量。速度无显著变化（p>>0.05，n=10）（v）运动接触抑制由PCP元件（红色）和细胞接触处RhoA活性（绿色）的定位控制，导致定向迁移（箭头）。
PCP途径的激活通常伴随着Dishevelled（Dsh）的膜定位20因此，我们分析了NC迁移期间Dsh的亚细胞定位在体外和体内在这两种情况下，前消化NC细胞和培养在多-L-赖氨酸（NC迁移的非允许底物）上的NC细胞21)，Dsh见于细胞质点(补充图8a、b). 相反，在允许的纤维连接蛋白底物上生长的NC细胞的细胞间接触处观察到Dsh的透明膜定位(). 对于前导细胞，细胞间接触的区域，因此Dsh积累的区域，位于细胞的尾端在体外(补充图8c). 当两个领先的细胞发生碰撞时，Dsh在细胞间接触点重新变大，随后迁移方向发生改变(,补充电影12). 在NC细胞之间的细胞间接触和领先细胞的尾端对Dsh定位进行了类似的观察体内(补充图8e，f). PCP信号的缺乏导致细胞接触中Dsh积累的损失(补充图9). 这种膜定位的Dsh使人想起中胚层细胞中Dsh激活后所描述的病灶22我们还观察到Wnt11和受体Fz7在细胞-细胞接触处的重新分布在体外()和体内(补充图8g; 未显示）；两者在前电池尾端共同定位(补充图8d). 总之，我们的结果表明，细胞间接触通过调节配体、受体和PCP信号通路的细胞内元件的积累使细胞极化。
众所周知，小GTPase在细胞极性和细胞迁移中起着重要作用。其中之一，RhoA是NC迁移过程中PCP/Dsh的已知下游效应物14为了研究RhoA在接触抑制运动中的可能作用，我们用FRET分析了分离和碰撞细胞中RhoA活性的水平。细胞碰撞期间检测到RhoA活性显著增加，细胞间接触区域的活性最高(). 当通过表达DshΔN在单个细胞中激活PCP信号时13，15观察到RhoA活性也有类似的增加(，补充图10a-c). 最后，RhoA下游靶点Rock的抑制导致运动接触抑制的完全丧失(;补充图10d和电影13). 这些结果表明RhoA是PCP在接触性运动抑制中的下游效应器。
尽管50多年前就有人描述过培养细胞接触抑制运动1，2，我们提供了它发生的第一个证据体内，在NC细胞的定向迁移中起着关键作用。我们发现PCP（非规范）Wnt通路参与了这一过程。数据与模型一致()其中细胞间接触导致细胞接触区域PCP信号的局部激活，这是RhoA激活所必需的。RhoA在细胞接触处的定位指示细胞突起的塌陷和细胞极性的改变。通常认为，胚胎发生期间的定向细胞迁移涉及到吸引迁移细胞的分子的局部产生（趋化性）23-25虽然不排除化学吸引，但我们认为运动的接触抑制足以实现NC定向迁移。这种机制也可以指导细胞群的相干迁移（例如中胚层26，侧线原基27)以及在转移或发育过程中一个细胞群体对另一个细胞（包括NC、成血管细胞和神经元）的有效占领28，29). 大多数细胞迁移体内保持近距离并成群结队移动。因此，对这些聚集细胞之间的细胞突起的抑制相当于对运动的接触抑制过程。它们典型的相干定向迁移是通过“tip-toe”运动完成的，其中前单元只能向无NC-free区移动，即向前移动。这将为拖尾单元格的移动等打开一个小空间补充图1).
NC细胞的行为与某些癌细胞相似，因为它们表现出向相似但不不同的细胞类型运动的接触抑制三，5-9我们认为，运动的同型接触抑制使细胞在迁移过程中具有方向性，而异型接触抑制的缺乏使细胞能够侵入其他组织。
