背景
横纹肌肉瘤是一种严重的儿童癌症，起源于原始肌肉细胞“横纹肌母细胞”，无法分化为横纹肌细胞。这些肿瘤约占所有儿童癌症的5-8%，在1-5岁年龄组发病率最高。总的来说，50%被诊断为横纹肌肉瘤的儿童存活了5年。肉瘤有两种主要形式，肺泡型和不太严重的胚胎型[1-5]但是，对于这些肉瘤的生化表型以及它与邻近组织的原代心肌细胞的区别还知之甚少。这些信息不仅对了解这些转化细胞的基本生物化学有很大价值，而且对开发新的治疗方法也有很大价值。在这里，我们报道了一项研究，利用一种新的生物化学方法，对胚胎型横纹肌肉瘤细胞Rh30与原代心肌细胞的生化表型进行了比较13基于C同位素的代谢组学方法。
在培养基中快速分裂的癌细胞与类似类型的分化原代细胞显示出许多差异[6-8]. 为了分裂，细胞必须反复穿越细胞周期，在S期和G2期大分子含量随之加倍。这需要大量的生物合成资源和远远超过基本速率的能源需求。蛋白质、核酸、脂类和复合碳水化合物的生物合成涉及到三磷酸核苷的水解（例如蛋白质生物合成中的ATP和GTP，脂类和碳水化合物生物合成的CTP和UTP），以及来自代谢前体的碳和氮的结合。对于培养中的细胞，许多前体物质在培养基中很容易获得，包括必需氨基酸、脂肪酸和葡萄糖。相反，培养基中没有核苷酸、复合碳水化合物和磷脂的前体，因此必须从头合成。
细胞功能中存在ATP消耗反应的层次[9]. 正如预期的那样，维持跨膜离子梯度以进行转运，以及与细胞存活有关的各种大分子修复过程是最优先的反应，并占静止（G0/G1）细胞消耗的ATP的很大一部分[9-11]. 为了准备细胞分裂而上调大分子生物合成需要额外的ATP当量。许多癌细胞有增加葡萄糖摄取的倾向[12]和糖酵解通量，即使在有氧条件下，也能分泌大量葡萄糖碳作为乳酸[13,14]. 这意味着绕过氧化磷酸化，因此仅糖酵解可能占ATP生成的很大一部分。这种增强的有氧糖酵解被称为Warburg效应[15-17]. 在有氧条件下，一种更有效的能量生产方法是增加乙酰辅酶A的流量，乙酰辅酶A是葡萄糖、氨基酸和脂肪酸氧化进入克雷布斯循环的产物。此外，为了维持克雷布斯循环的活性，有必要上调补体反应，以补充被转移用于生物合成的碳。
骨骼肌利用糖酵解和氧化磷酸化为收缩提供能量。在剧烈运动的条件下，糖原储存迅速耗尽，脂肪酸等燃料的氧化磷酸化无法满足需求。肌肉的糖酵解速度大大增加（>100倍[18])以及乳酸的产生。乳酸和一定程度上的丙氨酸从肌细胞输出到血液中，当它们被输送到肝脏，通过糖异生作用重新合成葡萄糖时（参见图). 这些包括Cori和丙氨酸循环[19,20]. 因此，肌细胞具有制造和分泌大量乳酸的能力。通过单羧酸转运体分泌乳酸通常伴随着质子信号转导[21,22]. 此外，大多数电池可以通过各种交换器主动输出质子，例如H+/纳+反转运蛋白[23]，许多癌细胞分泌大量的H+进入细胞外环境，这可能会提供生存优势，特别是在加速糖酵解的情况下[24,25].
代谢方案.[U的碳流量-13C] -葡萄糖通过糖酵解、克雷布斯循环、PPP、丙酮酸羧化、苹果酸/天冬氨酸穿梭以及GSH和嘧啶核苷酸的合成，如文中所述。还显示了预期13该网络中关键代谢物的C同位素。乳酸和丙氨酸排入血清是丙氨酸和Cori循环的一部分。实心椭圆形代表质膜，虚线椭圆形代表线粒体空间。双头箭头：交换或可逆过程。标签图案源自[U-13C] -葡萄糖。打开圆圈：12C类；实心圆：13C.Glc=葡萄糖，G6P=葡萄糖-6-磷酸，Rib=核苷酸核糖，DHAP，GAP=二羟丙酮磷酸和甘油醛-3-磷酸，PEP=磷酸烯醇式丙酮酸，Pyr=丙酮酸盐，Lac=乳酸，Cit=柠檬酸盐，2=OG=2-氧戊二酸盐，Mal=苹果酸盐，OAA=草酸盐，U=尿嘧啶碱。关键酶以青色显示。HK=己糖激酶（进入糖酵解），G6PDH=葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（进入戊糖磷酸途径的氧化分支），TK，TA转酮酶和转醛酶（非氧化戊糖磷酸通路），PK=丙酮酸激酶，PDH=丙酮酸脱氢酶，PC=丙酮酸酯羧化酶，AAT=天冬氨酸氨基转移酶，MDH=苹果酸脱氢酶，ME=苹果酸酶。谷氨酰胺分解是通过ME从谷氨酰胺到丙酮酸的途径，导致未标记的苹果酸、天冬氨酸、丙氨酸和乳酸。在克雷布斯循环中间产物中显示了两种模式，这是由于琥珀酸步骤的混乱（仅第一圈）。对于U和OAA，来自PC活性的标记产生了第三种标记模式，以红色显示。U的同位素模式显示来自天冬氨酸的三环碳（4,5,6）。交换[13C-1,2,3]-Asp通过苹果酸/天冬氨酸穿梭进入胞浆，导致合成[13C-1,2,3]-苹果酸。
然而，据报道，许多癌细胞上调了胚胎M2型丙酮酸激酶（PK）的表达，后者在催化丙酮酸生成方面存在缺陷[26]，因此必须氧化替代底物以生成ATP[27-29]. 一种可能是氧化谷氨酰胺/谷氨酸或丝氨酸，最终生成丙酮酸，绕过缺陷的PK步骤，并允许乳酸生成再生NAD+[26,29,30]. 这种反应的相对重要性可能取决于细胞[31,32]. 幸运的是，使用稳定同位素示踪方法结合核磁共振和质谱分析（我们一直在开发），这些替代路径很容易区分[33-37].
因此，关于转化细胞和原代（未转化）细胞之间代谢差异的问题出现了。我们在这里使用13C定量同位素分析，以跟踪葡萄糖中单个碳原子的去向，如图所示在横纹肌肉瘤细胞（Rh30）和原代心肌细胞中，在相同条件下生长以检测其生化表型。这种方法能够通过单独的途径改变周转率，这通常不可能仅通过基于浓度的代谢物分析实现。此外13C编辑1核磁共振氢谱技术可以鉴定主要的磷酸化糖，否则在拥挤的环境中很难检测到1核磁共振波谱。心肌细胞和Rh30细胞之间存在明显差异，这与Rh30的能量和合成代谢增加一致。
结果和讨论
细胞生长
在这些实验的生长条件下，在有血清存在的情况下，Rh30细胞在约24小时内加倍。在没有血清（0.5%BSA）的情况下，生长速度较慢约30%，表明对生长因子的依赖性较弱。相比之下，原代心肌细胞的生长速度慢得多，在血清生长因子存在的情况下，其生长速度约为50小时。这表明，随着细胞增殖，癌细胞对代谢能量的总体净需求更高，以驱动大分子生物合成。这是对正常基底细胞代谢需求的补充。
葡萄糖摄取和乳酸分泌
培养基中剩余的葡萄糖量以及细胞分泌的乳酸和丙氨酸的量可以通过以下方法进行测量1H NMR和/或GC-MS。此外，由于NMR可以区分13C标签和12C乳酸和葡萄糖（见下文），可以直接测定从所提供的13C-葡萄糖或其他来源，根据公式（2）。表显示了两种细胞类型的葡萄糖消耗和向培养基中分泌乳酸和丙氨酸的数据。
表1
| 单元格 | [13C乳酸]mM | %13C类拉克 | [13丙氨酸]mM | %13C类阿拉 | [Thr]毫米 | [Glc]毫米 | Δ[Glc]一百万分之一 | %葡萄糖->乳酸b条 |
| Rh30（24小时） | 4.8 ± 0.6 | 83 ± 1 | 0.35 ± .03 | 67 ± 4 | 0.15 | 6.1 ± 0.6 | 4.6 ± .6 | 52 ± 7.5 |
| 肌细胞（48小时） | 1.2 ± 0.2 | 64 ± 2 | <0.01 | <5 | 0.15 | 4.8 ± .5 | 5.9 ± .5 | 10 ± 1.4 |
[U的消耗-13C] -Rh30细胞在24小时内摄入的葡萄糖与原代心肌细胞在48小时内消耗的葡萄糖相当，反映出后者的生长速度较慢。数量和程度13Rh30细胞分泌的乳酸中C的富集度比原代心肌细胞高很多（表和图). 由于48小时时心肌细胞的干重与24小时时Rh30细胞的干重量相当，这意味着Rh30电池的乳酸产生率比心肌细胞高8倍。数量和程度13在Rh30培养基中丙氨酸的C富集度也远高于在心肌细胞培养基中测得的丙氨酸富集度，尽管丙氨酸分泌在标记的葡萄糖消耗量中所占比例较小（表和图). 因此，Rh30细胞转化了更高的分数F（参见公式2和表)的13C葡萄糖消耗为乳酸（50%），而心肌细胞（10%）。我们观察到，各种上皮衍生癌细胞系通常会将30-50%的葡萄糖消耗转化为乳酸（A.N.Lane，T.WM Fan，未发表的数据）。这与最近一份关于胶质母细胞瘤细胞的报告形成对比，在胶质母细胞癌细胞中，95%以上的葡萄糖被转化为乳酸和丙氨酸[38]. Rh30和其他癌细胞中标记乳酸盐的高生产率表明糖酵解中的丙酮酸激酶（PK）步骤（图。)必须是活性的，与一些肿瘤细胞PK缺陷的报道相反[28].
Rh30细胞和心肌细胞培养基中代谢物的浓度浓度通过GC-MS测定，如文中所述。Rh30细胞或心肌细胞分泌到培养基中的乳酸和丙氨酸的质量同位素浓度。
Rh30细胞的高乳酸标记表明，乳酸和丙氨酸中的主要碳源确实是葡萄糖。然而13心肌细胞中的C-Ala标记基本上是天然丰度，反映了其主要来源于培养基中存在的10%FCS。因此，不仅心肌细胞中的丙氨酸标记模式与Rh30细胞中的不同，而且在两种细胞系中也与乳酸标记模式不同。由于丙酮酸和乳酸的直接前体是丙酮酸，这些标记模式的差异可能表明存在不同的细胞内丙酮酸池，正如在其他细胞中观察到的那样[39,40]见下文。此外，Rh30（48%）和心肌细胞（90%）吸收的大量葡萄糖转化为乳酸以外的代谢物（参见表). 剩余的一些葡萄糖碳在细胞成分中的去向如下所述
糖依赖性细胞代谢
使用GC-MS分析细胞生物量TCA提取物中的34种代谢物（图,)，其中20个也通过1H NMR（图,). 另外八种化合物由1仅H NMR一项，共有42种已确定的代谢物。图中比较了用GC-MS测定的Rh30和心肌细胞中选定代谢物的分布和乳酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、谷胱甘肽（GSH）、精氨酸和磷酸胆碱（P-胆碱）、牛磺酸和肌醇是更丰富的代谢物（参见图,,,). GC-MS和NMR测定结果之间有很好的一致性，表明分析的可靠性很高。图,,,也说明了心肌细胞和Rh30细胞之间大量代谢物的水平存在显著差异。值得注意的是，Rh30细胞中氨基酸、谷胱甘肽、牛磺酸、P-胆碱、肌醇、腺嘌呤核苷酸（5'-AXP）和尿嘧啶核苷酸的含量要高得多。与心肌细胞相比，Rh30中P-胆碱的高丰度（图)似乎是增殖细胞的一个显著特征[35,37,41-46].
Rh30细胞和心肌细胞细胞提取物中代谢物的浓度浓度通过GC-MS测定，如文中所述。A、 B：选定代谢物的总浓度归一化为细胞干重。
Rh30细胞和心肌细胞细胞提取物中代谢物的浓度浓度通过GC-MS测定，如文中所述。A、 B：所选代谢物的质量同位素浓度显示Rh30细胞中标记掺入量增加。
1Rh30和心肌细胞提取物的核磁共振波谱在600 MHz、20°C下记录核磁共振谱，循环时间为5秒。细胞在0.2%[U的存在下生长-13C] -葡萄糖24小时（Rh30）或48小时（心肌细胞）。上部心肌细胞，下部Rh30。光谱按干重缩放，以显示代谢物绝对浓度的差异
Rh30细胞提取物中的丙氨酸和乳酸同位素模式.1图5中Rh30细胞提取物的H NMR谱扩展显示了乳酸和丙氨酸的卫星峰。
糖酵解
图图中显示了Rh30细胞乳酸区域的扩张，如图所示.丙氨酸和乳酸的3-甲基共振（分别在1.53和1.4 ppm时为双峰）显示出成对的13C卫星峰值相隔126赫兹。这些卫星峰具有复杂的结构，这可以通过考虑这些质子与13C2和13化合物的C1（即均匀标记）[35,47]. 均匀分布的存在13C-标记的乳酸和丙氨酸在高分辨率2-D中也很明显1H（H）-13C HSQC或1-D13Rh30和心肌细胞提取物的C投影光谱，如图所示.乳酸和丙氨酸的β-（C3）和α-（C2）碳的各自双链和三链模式（由于13C-13C联轴器）[36]进一步符合1这两种代谢物的H TOCSY卫星模式（参见图。). 核磁共振数据通过GC-MS分析得到证实，其中m+3（乳酸+3）质量同位素占主导地位。这些数据共同表明13乳酸和丙氨酸中的C直接来自[U-13C] -通过糖酵解的葡萄糖前体。
二维1H（H）-13Rh30细胞和肌细胞的C HSQC分析两个细胞均在[U-13C] -三氯乙酸提取前24小时的葡萄糖和14.4 T下的HSQC测量。以0.14 s的采集时间记录光谱2和34毫秒（t）1.以t为单位的数据表1线性预测到1024个复数点，零填充到2048，因此13C-13C联轴器（35–45 Hz）已解决。面板C显示Rh30细胞提取的2-D轮廓图，而面板B和A分别是1-D13Rh30和心肌细胞二维轮廓图的C投影光谱。A和B均归一化为细胞干重，但A相对于B以10倍的比例绘制。
Rh30细胞提取物的TOCSY光谱0.2%[U存在下生长24小时的Rh30细胞TCA提取物的TOCSY光谱-13C] -葡萄糖和10%FCS，混合时间为50 ms，自旋锁定强度为8 kHz。光谱中的脂肪族区域显示了某些指定代谢物的连接性和卫星峰。
详细量化13通过NMR和GC-MS测定的细胞内乳酸和丙氨酸的C同位素如表所示和图。如对培养基的观察（见上文），心肌细胞的富集程度低于Rh30细胞，尤其是Ala，这与原代细胞中的糖酵解率显著降低一致。这个13在缺乏FCS生长因子的情况下生长的Rh30细胞中C-Ala的富集甚至低于心肌细胞。该培养基中没有未标记的丙氨酸，表明生长因子缺乏条件下的细胞没有积极转氨酶标记的丙酮酸（参见图). 因此，未标记的Ala组分可能反映了其他代谢过程的贡献，如蛋白质周转或谷氨酰胺分解[30]（参见图)可能与在其他细胞中观察到的丙酮酸池不同[39,40]. 然而，由于未标记丙氨酸的浓度较低，需要的蛋白质周转量或谷氨酰胺分解量很小（参见图,).
表2
量化13细胞代谢物中的C富集1核磁共振分析：糖酵解。
| 条件 | %13CAla公司 | %13C拉克 | 13CAla/Thr公司 | 13CAla/Thr公司 |
| Rh30（FCS） | 74 ± 2 | 86 ± 2 | 2.9 ± 0.3 | 6.7 ± 0.3 |
| Rh30（英国标准协会） | <5 | 73 ± 2 | <0.1 | 3.2 ± 0.3 |
| 心肌细胞 | 44 ± 2 | 82 ± 2 | 0.7 ± 0.1 | 6.8 ± 0.3 |
克雷布斯循环活动
细胞中的其他一些关键代谢物也被标记为13C如2-D所示1图中示例Rh30细胞提取物的H TOCSY光谱交叉峰模式是特定代谢物的特征，如核苷酸、乳酸、丙氨酸和谷氨酸的核糖部分，如注释所示。许多这些交叉峰被卫星峰包围，这表明存在13C.在扩展Glu、Ala和Lac的光谱区域时，这些都变得更加清晰（图。). 很明显，Glu在C4（2.65 ppm）和C2（4.08 ppm）位置被标记，在C3（2.22 ppm）位置标记的程度较小。图还揭示了四种不同的Glu同位素的存在，即。13C-2,3-Glu，13C-2-Glu，13C-3-Glu，13C-2,4-Glu，13C-4-Glu和13C-3,4-葡萄糖。通过HSQC光谱分析获得了额外的同位素信息（图。). Glu的γ-（C-4）和α-（C-2）碳的双重模式表明存在13C-4,5-Glu和/或13C-3,4-Glu以及13C-1,2-Glu和/或13C-2,3-Glu同位素。然而13Glu的H3到H2的TOCSY交叉峰的C卫星模式（图中2.22到4.08 ppm）。)显示了大量13C-2,3-葡萄糖。同样13C-3,4-Glu从13Glu的H4至H3交叉峰的C卫星模式（图中2.65至4.08 ppm）。)但是13C-4,5-Glu或13根据目前的数据，无法排除C-1,2-Glu的可能性。
Rh30细胞提取物的TOCSY光谱图8所示的频谱扩展。A.Glu/Ala/Lac区域从A.展开。方框显示13丙氨酸、乳酸和谷氨酸的C卫星峰值以及脯氨酸和苏氨酸中没有标记。丙氨酸和乳酸仅显示完全未标记和完全标记的交叉峰模式，而谷氨酸交叉峰模式显示单标记和双标记同位素物种（参见[35]. B.部分TOCSY光谱区域显示了5'UXP的5环和6环质子的单标记和双标记物种的交叉峰模式。
上述结果明确证明，尽管培养基中存在未标记的Gln（2 mM）和Glu（0.13 mM），但从标记的葡萄糖（10 mM）从头合成Glu。对标记模式的进一步检查揭示了不同Glu同位素合成路线的证据。谷氨酸是通过哺乳动物细胞中的转氨作用或还原胺化作用（Glu脱氢酶）从2-酮戊二酸盐中获得的。标签合并有两种途径[13C-U]-葡萄糖通过丙酮酸转化为2-酮戊二酸（图,). 如图10所示，一条路线（图。)涉及丙酮酸盐→乙酰辅酶A→柠檬酸盐→2-氧戊二酸的途径，这导致13C-4,5-葡萄糖。另一条路线（图。)利用丙酮酸羧化酶的回复反应，直接从丙酮酸中生成OAA，随后的反应序列为柠檬酸→2-酮戊二酸，生成13C-2,3-葡萄糖。以下人员的在场13C-2,3-Glu如图所示和与丙酮酸羧化酶的活性一致。标签重新分布到Glu的不同碳中，可能是由于琥珀酸脱氢酶（SDH）步骤中的碳因琥珀酸分子的对称性而发生混乱的结果。此外，多重13上述C-Glu同位素支持循环的多次循环13C标签输入（参见图).
13糖酵解产物、PPP和线粒体Krebs循环中[U-13C] -Glc作为示踪剂Krebs的循环反应被描述为无（图A）或有（图B）补体丙酮酸羧化（PC），所示的标记模式代表循环活动的一个转折。两个不同的13Glu中的C标记模式是由有PC（图B）或没有PC（图A）的循环反应产生的，即。13分别在C2,3或C4,5处贴上C标签。对称琥珀酸盐发生同位素扰动，导致13C标签分为C1和C2或C3和C4（面板A）。面板B中还描绘了穿过线粒体膜的苹果酸/天冬氨酸穿梭，其中[13C-1，2，3]-天冬氨酸进入胞浆导致合成[13C-1,2,3]-苹果酸。红色C和绿色C代表13C标记碳；实心箭头和虚线箭头分别表示单步反应和多步反应；面板A中的开放箭头描绘了草酰乙酸（OAA）的未标记起始点13一圈后标记为C的OAA；面板B中的开放箭头表示第二个循环的开始；双头箭头表示可逆反应或交换反应；SCS表示琥珀酰辅酶A合成酶。
从图中可以清楚地看到Rh30细胞的不同13Glu的C同位素（比心肌细胞）。这意味着Krebs循环的更替更高，特别是丙酮酸羧基化的恢复能力更高，这一点可以通过增加13C-4,5-Glu和13分别为C-2,3-Glu。
苹果酸和天冬氨酸也表现出大量13C富集（图)基于GC-MS分析的双标记和三标记质量同位素。从2-D HSQC分析中推导出三重标记苹果酸的位置同位素，如图所示C3或β-苹果酸双链和C2或α-苹果酸三链表明[13C-1,2,3]-苹果酸。双标苹果酸同位素可以是[13C-2,3]-苹果酸[13C-1,2]-苹果酸和/或[13C-3,4]-苹果酸，其丰度无法根据现有数据确定。通过比较Rh30细胞和心肌细胞在13图中的C-苹果酸等位异构体模式。和很明显，Rh30细胞合成了大量双倍和三倍标记的苹果酸，后者被鉴定为[13C-1,2,3]-苹果酸。类似的考虑也适用于Asp，即双重和三重标记([13C-1,2,3]-Asp）等位异构体在Rh30细胞中比在肌细胞中更丰富（图).
根据图中的方案和, [13C-1,2,3]-苹果酸和[13C-1,2,3]-天冬氨酸只能由[U合成-13C] -丙酮酸通过补体丙酮酸羧化（PC）。PC还可以导致合成双标记[13克雷布斯循环一圈后的C-2,3]-苹果酸或天冬氨酸，如图所示。相反，苹果酸双标记物种（如[13C-1,2]和[13C-3,4]-苹果酸）或天冬氨酸应来自正常克雷布斯循环序列，输入为[U-13C] -丙酮酸，如图所示。，或双重标记[13丙酮酸羧化生成的C-2,3]-苹果酸，如图所示。因此，苹果酸和天冬氨酸同位素的GC-MS和NMR联合测定不仅揭示了Krebs循环的活性增强，而且还揭示了Rh30细胞中丙酮酸羧基化在原代心肌细胞上的激活。这种回补反应对于细胞的积极分裂至关重要，因为重要代谢物如嘧啶碱基和还原型谷胱甘肽的产生消耗了克雷布斯循环的中间产物（图。（见下文），必须补充。
克雷布斯循环中间产物也可以通过谷氨酰胺水解补充[30,38,48]已证明在胶质母细胞瘤细胞中激活，其基础是从标记的Gln中产生标记的乳酸[38]. 由于缺乏标记的Gln的碳示踪，因此无法确定谷氨酰胺水解在Rh30细胞内回补中的作用。然而，Rh30细胞和心肌细胞未标记乳酸的可比生成量（图,（见上文）表明谷氨酰胺水解在激活Rh30细胞的补体中起着次要作用。
Rh30细胞中Krebs循环的持续活性需要一个功能性呼吸链来再生NAD+同一条链还将糖酵解产生的细胞溶质NADH再次氧化，并通过苹果酸-天冬氨酸穿梭物转运到线粒体中（参见图。)，这与将丙酮酸还原为乳酸无关（见上文）。
此外，转化的Rh30细胞在从头合成谷胱甘肽方面比原代心肌细胞更为活跃。谷胱甘肽标记在Rh30细胞的谷氨酸残基中，并且这种标记在Rh 30细胞中的程度比在心肌细胞中强得多（参见图。和)，就像其前体Glu的情况一样（表). 虽然半胱氨酸的供应在谷胱甘肽合成中可能会限制速率，但在这种情况下，培养基中含有充足的胱氨酸供应（0.2 mM）。标记的谷氨酸的掺入表明Rh30细胞中GSH的从头合成率很高。
表4
| | | %12C或 | 13C类 | | | | |
| 条件 | 12α12γ | 12α13γ | 13α12γ | 13α13γ | 12α12β | 12α13β | 13α12β | 13α13β |
|
| Rh30（FCS） | 46 ± 3 | 11 ± 2 | 14 ± 2 | 29 ± 3 | 63 ± 3 | 2.5 ± .5 | 6.7 ± 1 | 28 ± 2 |
| Rh30（英国标准协会） | 54 ± 3 | 16 ± 2 | <2 | 30 ± 3 | 78 ± 4 | <2 | 9 ± 1 | 13 ± 1 |
| 心肌细胞 | 71 ± 3 | 9 ± 1 | 12 ± 2 | 7 ± 1 | >90 | <10 | <2 | <2 |
核苷酸生物合成
天冬氨酸是嘧啶生物合成的直接关键前体（图。). 我们之前已经证明核苷酸的嘧啶环13Rh30细胞中标记的C[35]. 如TOCSY光谱所示，观察到5'-UXP C5C6的所有可能同位素（图). 这个13C卫星模式与Asp卫星模式相似（图)，这与天冬氨酸是5'UXP环从头合成的直接前体一致（图、和). 这个135'-UXP尿嘧啶环标记的C丰度和范围（表)及其前体Asp（图和). Rh30细胞中的含量远高于心肌细胞。因此，很明显，Rh30细胞对从头开始比心肌细胞合成嘧啶核苷酸。
表3
量化13细胞代谢物中的C富集1核磁共振氢谱分析：戊糖磷酸和嘧啶生物合成
| 核糖环 | | 底座环 |
| 条件 | %13C采购 | %13C梨 | [%13C尿 |
|
| Rh30（FCS） | 95 ± 2 | 80 ± 2 | 50 ± 3(26 ± 2)一 |
| Rh30（英国标准协会） | 82 ± 2 | 88 ± 2 | 45 ± 2(21 ± 2)一 |
| 心肌细胞 | >90 | <5 | <5 |
由于天冬氨酸是由克雷布斯循环中间产物OAA的转氨作用产生的，天冬氨酰转移到嘧啶环生物合成的增加最终会消耗OAA，而OAA必须得到补充才能维持克雷布斯的循环活性。如上所述，这可以通过Rh30细胞中丙酮酸羧基化增强回补来实现。此外，线粒体中合成的标记的天冬氨酸可能通过天冬氨酰/苹果酸穿梭物运输到细胞质进行嘧啶生物合成（图。). Rh30细胞嘧啶合成速率的增加可能很好地反映了天冬氨酸/苹果酸穿梭活性的增加。这种穿梭也有助于通过氧化磷酸化将细胞质中产生的NADH转移到线粒体以生成ATP。虽然嘧啶的生物合成主要是细胞质的，但有一步发生在线粒体内，涉及到与电子传递链的偶联。总的来说，这些都指向癌细胞中具有代谢功能的线粒体。
Rh30细胞中嘧啶合成的更高能力由135'-UXP核糖部分的C标记数据，其中核糖残基的所有五个碳在13C.从TOCSY中可以明显看出这一点135'-UXP交叉峰的C卫星模式（例如图。对于5'-UXP的H1'→H2'）和135'-UXP中核糖C1'到C4'的C自旋偶联模式（图。). [U的丰度-13C-核糖]-UXP（图。)和%13C富集（表)Rh30细胞中的含量远高于心肌细胞，这与5'-UXP合成速率的提高一致。在图中也很明显。是嘌呤核苷酸（即5'-AXP和5'-GXP）的较高合成速率，如[U丰度较高所示-13C-核糖]-5'-AXP和5'-GXP。这种差异13与缓慢分裂的原代细胞相比，核苷酸的C标记符合转化细胞对大分子（如RNA）生物合成的更高代谢需求（另见下文）。
还应注意1图中5'-AXP和5'-UXP的H NMR共振。实际上是3种共振的混合物，对应于三磷酸盐、二磷酸盐和单磷酸盐物种，其强度顺序为5'-ATP>5'-ADP>5'AMP，类似于5'-UTP、5'-UDP和5'-UMP（数据未显示）。
细胞内葡萄糖-6-磷酸和糖原合成
附加2-D1核磁共振实验有助于识别13Rh30和心肌细胞提取物中的C-标记葡萄糖-6-磷酸（G6P）和/或糖原。这些包括1H HCCH-TOCSY和1H（H）-13C HSQC-接触网。肌细胞提取物的HCCH-TOCSY光谱（图)显示连续连接质子的共价连接性13各种代谢物的C标记碳，如乳酸、丙氨酸、谷氨酸、β-葡萄糖-6-磷酸（βG6P）、糖原和AXP。Rh30光谱（未显示）也显示出类似的共价网络，除了糖原的连通性缺失，βG6P的丰度连通性较低，5'-UXP和5'-GXP的连通性更显著。这些代谢物的连接性模式与[13C-1-5]-βG6P和[U-13除[U外，C-葡萄糖]-糖原-13C] -乳酸，[U-13C] -阿拉，和[13C-2,3,4]-谷氨酸。
心肌细胞提取物的HCCH TOCSY谱.48 h心肌细胞和24 h Rh30细胞在[U-13C] -按照上述方法提取葡萄糖。如方法和其他地方所述，在18.8 T下记录了1D核磁共振谱[35]. 在12毫秒的混合时间下记录肌细胞提取物的HCCH-TOCSY光谱，其显示糖原共振的连续标记的碳、G6P和核苷酸的完全标记的核糖部分（例如，5'AXP）、乳酸、Ala和Glu的交叉峰模式。
进一步确认G6P（与葡萄糖相反）的分配，2-D高分辨率1H（H）-13对C HSQC-TOSCY光谱进行了分析，心肌细胞的光谱如图所示在这个光谱中，共价连接性来自13C1到H1然后中继到H2和H3以及13可以清楚地观察到βG6P的C3到H3，然后到H4。同样明显的是13βG6P的C6至H6连通性，从而明确鉴定心肌细胞粗提物中的βG6P。此外，高分辨率光谱显示13βG6P碳的C偶联模式，即C1的双链、C3-5的三链以及C6的双链，表明存在均匀标记的βG6P，因此其起源于[U-13C] -葡萄糖。
心肌细胞提取物的HSQC TOCSY谱.以50 ms的混合时间记录的心肌细胞高分辨率HSQC-TOSCY光谱的糖区域。F1中的分辨率足以显示13C-13C分裂，例如G6P的beta形式。上部：1D投影，下部：2D光谱
己糖激酶活性超过葡萄糖转运活性的细胞中不存在游离葡萄糖[49]. 一维质子谱（图。)结果表明，Rh30细胞中葡萄糖和G6P的浓度可以忽略不计，这表明G6P在糖酵解过程中的下游步骤不限制流量。低浓度的游离葡萄糖是癌细胞的一个特征，加上低水平的G6P反映了高糖酵解通量，使得葡萄糖转运速度受到限制[50]尽管突变的p53抑制了GLUT4的表达[12]. 相反，肌细胞中G6P的浓度是显著的（图)这表明，对于这些细胞来说，葡萄糖或己糖激酶的摄取并没有限制这些细胞的糖酵解。相反，G6P下游的一个台阶，如PFK1，限制了导致G6P积累的通量。这与骨骼肌细胞内G6P的典型估计一致（约200-400μM）[51]. 与心肌细胞相比，Rh30细胞中糖酵解和PPP（见上文）的需求更高，很可能限制了糖原合成，糖原合成与相同的葡萄糖前体竞争。这可能是Rh30细胞中缺乏新合成的糖原，而心肌细胞中存在糖原的重要原因（参见图。).
最后13胎牛血清（FCS）中生长的Rh30细胞的乳酸、丙氨酸和嘧啶核苷酸中的C标记高于BSA中生长的细胞（表). 细胞内丙氨酸的低富集可能与FCS刺激的和未刺激的Rh30（BSA）细胞（见上文）之间来自葡萄糖以外来源的丙酮酸生成的差异有关。对于Glu，这两种生长条件提供了可比较的程度13C标记显著高于心肌细胞。因此，即使不受FCS中生长因子的影响，BSA中生长的Rh30细胞仍表现出更大的[U-13C] -葡萄糖通过糖酵解、克雷布斯循环和嘧啶核苷酸生物合成而非原代心肌细胞。
方法
材料
细胞
人RMS细胞系Rh30（在圣犹德医院建立）和人原代心肌细胞在丙酮酸和无葡萄糖RPMI 1640（Invitrogen，11879-020）中培养，补充100 IU/ml青霉素、10μg/ml链霉素和50μg/ml新霉素（纽约州格兰德岛生命科技公司）在10%热灭活FCS（生命技术）和0.2%葡萄糖的存在下。因此，介质含有0.17 mM12来自FCS的丙氨酸、0.5 mM未标记乳酸和0.56 mM未标签葡萄糖。细胞在5%CO的湿润环境中培养2，37°C，初始电池密度为2.5×104每48小时更换一次细胞/烧瓶（康宁）和培养基13C标记细胞在0.5%牛血清白蛋白（BSA）中生长，无FCS部分同步培养。控制实验也在其他相同的条件下进行，在标记阶段使用0.5%BSA代替FCS。测量细胞干重以使代谢物浓度正常化。
同位素
[美]-13C] -葡萄糖（99%13C） 从马萨诸塞州剑桥同位素实验室购买，使用时无需进一步净化。在磷酸盐缓冲盐水中制备储备溶液（20%），并通过0.2μm过滤器进行无菌过滤。将适量储备溶液添加到无葡萄糖RPMI培养基中，最终浓度为10.7 mM（不包括FCS中的0.54 mM未标记葡萄糖）。
方法
使用未标记的葡萄糖进行初始实验，然后使用[U-13C] -葡萄糖。在一个实验中，Rh30和心肌细胞在标记的葡萄糖中培养24小时。在第二个实验中，为了解释细胞倍增率的差异，Rh30细胞培养24小时，心肌细胞在标记的葡萄糖中培养48小时。在这项工作中，13各种代谢物中的C原子只来源于[U-13C] -通过核磁共振或质谱法监测葡萄糖，这代表了源于葡萄糖的从头代谢转化。用0.4%台盼蓝在血细胞仪上通过直接细胞计数测量生长率和存活率。
代谢物提取
生长24或48小时后，通过胰蛋白酶消化、刮除、然后在4°C下低转速离心来收获细胞。用冰镇PBS清洗颗粒两次，以去除污染介质，再次造粒，在1N中快速冷冻2并冷冻干燥。在用冰镇10%三氯乙酸（TCA）萃取两次之前，记录干细胞质量以使代谢物浓度正常化，然后按照之前的描述进行冻干[37,53]. 记录细胞的干质量，以使代谢物浓度正常化。以同样的方式用TCA处理培养基，以测量分泌的代谢物（主要是乳酸和丙氨酸），并在实验期间测定葡萄糖利用率。13在t=0和收获（t）时，通过1使用高分辨率核磁共振13α-葡萄糖的C1卫星信号集中在5.22 ppm。这占总葡萄糖的36%。这个13C和12通过整合甲基峰及其卫星测定C乳酸和丙氨酸浓度，并根据GC-MS独立测定的乳酸浓度进行校准。由此，可根据方程式（1）和方程式（2）估算消耗的葡萄糖量ΔGlc以及转化为乳酸的部分加上丙氨酸，F[35]:
n是括号中化合物的摩尔数。
因子2解释了一个葡萄糖分子产生两个乳酸或丙氨酸分子的事实。
然后，1-F代表葡萄糖碳，它进入细胞团中的其他代谢物和大分子或以其他方式未被考虑。未对培养基中未标记葡萄糖的微小贡献（5%）进行校正。
核磁共振
使用90°激励脉冲，在20°C的瓦里安·伊诺瓦核磁共振光谱仪上记录14.1 T或18.8 T的核磁共振谱。记录了一维核磁共振谱，采集时间为2秒，弛豫延迟为3秒。在这些条件下，质子基本上是完全弛豫的，这是通过独立测量自旋-晶格弛豫时间T来确定的1.用于鉴定提取物中的代谢物，并用13我们使用了一套2D实验，包括TOCSY（或DQ COSY）、HSQC、HCCH-TOCSY和HSQC-TOSCY，如前所述[35-37,53]. 后两个实验利用了同位素编辑功能。HCCH-TOCSY专门选择其中至少有两个相邻碳原子的分子13而HSQC或HSQC-TOCSY检测直接附着在13C.TOCSY实验在F2中以6000 Hz的谱宽记录，在t中以0.341 s的采集时间记录2和0.05秒（单位：t）1、1.9 s脉冲间延迟、50 ms混合时间和8 kHz B1场强。HSQC-TOCSY实验的采集时间为0.12 s（t）2和12ms（t）1使用强度为8 kHz的50 ms质子自旋锁。对于HCCH-TOCSY实验，采集时间为0.12 s in t2，0.05秒（t）1使用8kHz13以光谱的脂肪族区域为中心的C自旋锁场持续12ms。
代谢物根据其1H化学位移、TOCSY连接性模式及其与13C、 如前所述使用我们的内部数据库[36,54]. 除胆碱、糖和核苷酸外，所有代谢物均通过GC-MS数据进行量化[55]而胆碱是从1-D NMR光谱中3.22ppm的峰定量的，如前所述[56].
核磁共振分析13C富集
13从1D测定乳酸和丙氨酸中的C富集1核磁共振实验，因为这些代谢物的甲基共振得到了很好的解决。峰被整合，质子的面积附着在12C（中心峰）和至13记录了C（卫星峰值）。这个13C含量计算如下[35]:
对于1D NMR实验中未解决的其他代谢物，我们在校正碱方案后，对TOCSY光谱中的交叉峰进行了体积积分。计算了一维光谱的各种同位素丰度，即特定元素的峰值体积13C同位素除以包括卫星在内的交叉峰的总体积。在TOCSY实验中，由于这些实验的循环时间较短（2 s），质子部分饱和。因此，根据差值T校正了实际峰值体积1附加到的质子值13C或13C类；作为：
其中M（true）是校正面积，M（obs）是观察面积，t是循环时间。由于自旋锁定期间的弛豫对峰值强度有相反的影响，因此这种校正很小[35]. 有效T1根据在相同溶剂条件下记录的标准测定值。
气相色谱-质谱联用
在核磁共振分析之后，用H重新平衡小份（50–100μl）核磁共振样品2O并冷冻干燥以去除任何氘化，然后用25–50μl 1:1（v/v）乙腈：MTBSTFA（N-甲基-N-[叔丁基二甲基硅基]三氟乙酰胺，（里吉斯化学公司，莫顿格罗夫，伊利诺伊州）进行硅烷化，然后静置过夜[57,58]. 溶液在PolarisQ GC-ion捕集器MSn（德克萨斯州奥斯汀市ThermoFinnigan）上使用0.5μl注入体积直接分析。色谱柱为0.15 mm i.d.×50 m熔融石英开放管，涂有0.2μm BPX-5（5%苯基甲基硅氧烷）。GC-MS采用以下条件。注射器在280°C下，柱在60°C下放置2分钟，然后20°C/min升温至150°C，然后6°C/min升至300°C，无分叉排气口保持1.5分钟，He载气速度30 cm/s在60°C下，传输线=280°C，电子能=70 eV，源加热至190°C，自动增益控制目标值=50，最大注入时间=25 ms，He阻尼气体=0.3 ml/min，以五个光谱/s的速率从140到650 m/z进行全扫描采集，平均为一个，并用全氟三丁胺进行质量校准。
使用Xcalibur软件（ThermoFinnigan），根据GC保留时间和与内部数据库和外部标准匹配的质量碎片模式，自动识别和量化代谢物。身份也通过人工检查进行了验证。通过比较样品中每种代谢物的m/z 147离子响应与相应已知浓度标准的响应，实现了代谢物总丰度的GC-MS定量。选择m/z 147离子定量标记氨基酸，因为该离子片段不包含13因为它完全来源于硅烷基部分。相反，对于13如前所述，使用C同位素、真实标准的假分子离子簇来获得经验离子比，作为计算标记丰度的基础[37].
