肌内皮投射受限空间内肌醇1,4,5-三磷酸信号的功能结构

摘要

细胞内钙（Ca）的位置和模式²⁺)信号编码调节细胞功能不同方面的信息。哺乳动物细胞肌/内质网（SR/ER）中的两个主要细胞内钙释放通道-肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP_三Rs）和ryanodine受体（RyRs）-具有产生调节和局部钙信号的潜力。被称为“钙火花”的基本释放事件对应于SR膜中RyRs空间固定簇的激活。SR元件中RyRs的组织允许与紧密并列的质膜紧密沟通。在平滑肌（SM）中，钙火花激活质膜中对钙敏感的大电导钾通道，引起短暂的超极化电流，从而减少血管收缩(1). 尚未报告IP具有类似功能意义的局部钙信号结构_三卢比。

Ca高程²⁺在血管内皮中，被认为在向动脉壁相邻SM细胞传递血管调节信号中起主要作用。钙依赖性内皮信号包括一氧化氮（NO）、前列腺素（PGs）和一种机械多样的非一氧化氮、非前列腺素功能性，称为内皮衍生超极化因子（EDHF），其可变归因于钾离子、环氧碳三烯酸和通过缝隙连接的直接电通讯(2,三). EDHF功能的参与，无论其具体身份如何，都取决于钙敏感的小电导率（K_钙2.3）和中间电导率（K_钙3.1）血管内皮中的钾通道(三).

尽管Ca²⁺天然内皮制剂中有波动和振荡的报道(4–6)，Ca的组织模式²⁺尽管血管内皮具有独特的极性，并且内皮细胞和SM细胞之间存在已知的功能联系，但信号传导尚未被确定。探索Ca²⁺通过动脉壁内皮细胞的信号传递，我们设计了一只小鼠，该小鼠只在内皮细胞表达钙生物传感器（GCaMP2）(7). 钙传感器的基因编码、组织特异性表达允许检测钙²⁺无长时间染色的多细胞制剂的动力学及多种细胞类型荧光的混杂影响(8).

结果

血管内皮通过内弹性层（IEL）与动脉壁中的SM细胞分离。IEL包含许多孔，内皮细胞膜突起穿过这些孔，允许内皮细胞和SM膜通过肌内皮细胞缝隙连接直接接触和沟通(9–13). 为了在保持内皮-IEL-SM结构组织的同时可视化钙信号，我们通过做一个纵向切口并钉住矩形制备物，将三级小鼠肠系膜动脉段的内皮表面外部化。平均可见表面积为737±35μm的单个内皮细胞²很容易辨别(图1一个). IEL自身荧光中的黑洞，代表内皮膜到SM膜的投影点和连接缝隙连接的位置(9,11–13)，也可以看到[5.6±0.4孔/1000μm²，平均表面积为4.43±0.09μm²;支持信息（SI）图S1澳大利亚] (14).

在单独的窗口中打开

图1。

钙²⁺脉冲星与IEL洞共定位。(一个) (一)IEL自荧光显示IEL中存在“孔洞”。(b条)钙的起始位置²⁺合成图像中的脉冲星对应于IEL中的空穴（红色箭头）。黄色箭头表示脉冲星位置与可探测的IEL空洞无关。（比例尺，10μm）(c（c）)说明Ca之间距离的直方图²⁺脉冲星起始点和内皮IEL孔(n个=357个脉冲星站点）。(B类)三维Ca的时间过程²⁺脉冲星起源于图中最左侧的IEL洞（白色圆圈）内。（比例尺，5μm）(C类)钙²⁺来自表达GCaMP2的加压动脉（80mmHg）的脉冲星。(钙)内皮细胞及其细胞核轮廓（虚线），具有起始点(抄送和复写的副本)用红色箭头表示。（比例尺，10μm）另见电影S1和电影S2

在GCaMP2表达小鼠的未刺激动脉中，我们检测到IEL孔附近的钙火花样事件(图1和​和22和电影S1). 大多数这些事件，我们称之为“Ca²⁺脉冲星”发生在IEL中2μm孔洞内(图1交流电).图1一个图中显示了27个脉冲星站点中有21个（78%）位于IEL中的可探测孔中。图1B类图中显示了发生在单个黑洞中的单个脉冲星。孔洞大小与相关钙的振幅和频率之间没有相关性²⁺脉冲星(图S1抗体和交流电).

在单独的窗口中打开

图2。

钙的动力学和重复出现²⁺脉冲星。(一个)表达GCaMP2的小鼠肠系膜动脉内皮细胞场的平均10张图像。红色箭头表示Ca的起始位置²⁺脉冲星如所示B类和C类（比例尺，10μm）(B类)Ca的寿命²⁺图中显示了脉冲星。视野对应于中的绿色正方形一个（比例尺，10μm）(C类)钙的重复出现²⁺一个地点的脉冲星表示为沿黄线的线扫描分析一个（比例尺，5秒）(D类)说明Ca的代表性痕迹²⁺脉冲星动力学起源于两个不同的位置（红线和蓝线）。另请参见电影S1

钙脉冲星在同一地点重复出现(图2)，在给定地点脉冲星之间的平均时间为9.8±1.0 s(图S1文学士). 脉冲星之间的间隔可能由相关ER元素的局部钙耗竭或事件期间释放的钙量决定。然而，钙的振幅之间没有相关性²⁺脉冲星与同一地点下一事件的延迟(图S1Bb公司)这表明，这两种机制都无法决定下一个事件的发生时间。

图2一个突出显示IEL中一个洞处的脉冲星，箭头指示，持续时间<500 ms(图2 B类和D类). 总体而言，脉冲星的平均持续时间为270 ms，平均面积为14μm²(表1). 当使用钙敏感荧光染料Fluo-4进行测量时，脉冲星的特性（振幅、空间分布、动力学和频率）基本相同(表1和图S2C类)表明钙诱导的GCaMP2构象变化不会扭曲脉冲星的动力学(7). 重要的是，通过GCaMP2检测，Ca²⁺钙离子载体离子霉素（10μM）诱导的升高是均匀的，表明钙生物传感器在内皮细胞中均匀表达(图S3). GCaMP2的内皮特异性表达也提供了检测Ca的机会²⁺加压动脉中的信号没有来自SM的失真。事实上，我们检测到Ca²⁺受到生理性透壁压力（80 mmHg）影响的完整GCaMP2肠系膜动脉中的脉冲星。脉冲星出现在IEL洞(图1C类和电影S2)，其性质与在开放动脉中观察到的相似(表1和表S1).

钙脉冲星与IP不同_三R介导的“钙泡芙”先前在爪蟾卵母细胞(15)和培养细胞(16)具有显著不同的动力学特性和空间扩散(表1). “钙泡芙”代表少数IP的开放_三Rs启动再生Ca²⁺波和全球钙信号，并且没有固定的细胞位置(16–18). 区别于Ca²⁺脉冲星、钙波出现在体外内皮制剂中的单个内皮细胞中(图S2B类和图S4). 用Fluo-4测量时，钙波以48±4和58±6μm/s的速度在12±2和9±2μm之间移动(n个=57）和GCaMP2(n个=17）。

钙脉冲星类似RyR介导的钙²⁺在SM和心肌中观察到的火花发生在相对于质膜的固定位置，并且具有相似的空间扩散和振幅。然而，值得注意的是，Ca²⁺脉冲星的上升时间比Ca慢，持续时间长²⁺火花(表1). 用RyR抑制剂ryanodine治疗，完全阻断SM火花(1)，对钙无影响²⁺脉冲星或其他Ca²⁺内皮细胞信号(图3 C类和F类). 相比之下，IP_三R抑制剂xestospongin C降低Ca的频率²⁺内皮中的脉冲星达到对照的43±7%(图3 D类和F类). IP的存在_三在没有刺激的情况下，R-介导的钙脉冲星表明内皮细胞会产生IP_三在基础条件下。事实上，用U73122抑制磷脂酶C（PLC）或用环己酸（CPA）抑制内质网对钙的吸收显著降低了钙脉冲星的活性(图3 B类,E类、和F类). 清除外部钙5分钟不会显著改变钙脉冲星的活动(图3 一个和F类). 与这些功能观察一致，内皮细胞中未检测到RyR亚型（RyR1-3），而所有IP细胞的mRNA_三R亚型（IP_三R1–3）在内皮和SM中检测到(图S5)，带IP_三R2发出最强信号。总之，这些结果支持钙的概念²⁺脉冲星是局域Ca²⁺由IP调解的发布事件_三激活IP_三内皮细胞ER中的Rs。

在单独的窗口中打开

图3。

钙²⁺来自IP的脉冲星_三-敏感商店。去除细胞外钙²⁺(一个)或赖安诺定(C类)不影响Ca²⁺脉冲星。CPA对SERCA的抑制作用(B类)，IP的_三Rs与xestospongin C(D类)，或带U73122的PLC(E类)钙降低²⁺脉冲星。(F类)针对钙源的药理实验数据总结²⁺给出了脉冲星。(n个=0 Ca的6、5、4、6和3条动脉²⁺分别为CPA、ryanodine、xestospongin C和U73122；*，P<0.05）。对于A–E，不同颜色代表F类/F类_o个内皮细胞不同脉冲星位置的ROI。钙脉冲星记录2分钟，然后是可变的孵育时间（0 Ca，5分钟；Ry，35分钟；CPA，15分钟；xestospongin C，40分钟；U73122，15分钟），然后是药物治疗中的2分钟记录（参见方法总结).

PLC抑制作用表明，在没有刺激的情况下²⁺脉冲星受到基础IP的刺激_三(图3 E类和F类). 增加IP_三生产，应用内皮激动剂乙酰胆碱（ACh）。ACh使钙脉冲星的频率增加了≈2.4倍；抑制内质网钙摄取（CPA）或PLC活性（U73122）可阻断ACh效应(图S6和表S1). ACh诱导的钙增加²⁺脉冲星频率是由于新地点的补充和给定地点脉冲星之间间隔的缩短(图S1B类). 脉冲星振幅与给定ACh地点下一次事件的潜伏期之间也没有相关性(图S1B类). ACh也增加了Ca的频率²⁺波浪（≈3倍）和全球Ca²⁺（≈1.5倍），与以前的报告一致(19,20).

我们的发现表明内皮细胞中的ER形成空间离散的IP_三-敏感钙²⁺位于不同IEL洞内和周围的商店。为了评估内皮细胞-SM界面上ER的分布，我们检测了ER-Ca²⁺-结合蛋白calnexin。Calnexin染色显示，ER沿着内皮细胞基底分布在核周区，最显著的是分布在与IEL中孔洞位置精确对应的致密斑块内(图4 B类和C类). 随后的调查揭示了类似的IP分布_三Rs高度集中在大型和小型IEL孔中(图4 E类和F类). 通过IEL深度从内皮下表面到第一个SM细胞上表面拍摄的多个图像显示了IP的连续存在_三穿过薄板深度的孔中的Rs(图4G公司). 这些发现表明IP的存在_三R-致密的内膜ER结构，通过IEL与内皮细胞质膜突出，并在肌内皮连接处与SM细胞膜交界。

在单独的窗口中打开

图4。

ER和IP本地化_三IEL孔内的Rs。图像显示ER蛋白calnexin（红色）的免疫染色(A–C)和用于IP_三Rs（红色）(D–F型)IEL级别（绿色）。(C类和F类)叠加图像显示ER和IP_三R高度集中在不同的IEL孔内。（比例尺，5μm）(G公司)沿z（z）轴（2.9μm）显示IP密度_三穿过IEL深度的R-正荧光（白色）（绿色）。（比例尺，1μm）

钙敏感性钾（K_钙2.3和K_钙3.1）通道可能是内皮细胞离散钙信号的关键靶点。重要的是，K_钙3.1通道靠近IEL孔(11)并出现在穿过孔洞的内皮投影内(图5C类). 探讨钙的可能沟通²⁺脉冲星到K_钙3.1通道，我们测量了完整动脉内皮细胞的膜电位。阻塞K_钙3.1含有河豚毒素（ChTX）的通道使该制剂去极化约8 mV(图5B类) (21). 阻塞K_钙2.3含有阿帕明的通道对内皮细胞膜电位的影响较小（≈3 mV）(21). CPA能阻止钙进入内质网，有效抑制钙脉冲星(图3 B类和F类和图S6B类和C类)并导致整体钙含量短暂（<15分钟）增加（27±6%）(22)可能是通过消耗内质网钙。基于这些不同的效应，我们预测，如果钙激活钾，CPA会导致内皮细胞膜电位超极化_钙3.1通道，如果局部钙脉冲星激活K，则应导致去极化_钙3.1通道。CPA导致约10-mV去极化(图5抗体)但在K_钙3.1通道堵塞(图5B类). 在存在ChTx的情况下，CPA不影响内皮细胞膜电位(图5B类). 这些结果表明²⁺脉冲星，而不是全球Ca²⁺，直接激活K_钙3.1内皮通道，支持K_钙3.1内皮细胞膜电位的通道依赖性成分受钙调节²⁺脉冲星。

在单独的窗口中打开

图5。

钙²⁺脉冲星通过激活K使内皮细胞膜超极化_钙3.1通道。(一个) (一)CPA（10μM；黑条）使内皮细胞膜电位去极化，随后添加ChTX（300 nM；白条）没有影响。(b条)使用微电极和穿孔贴片技术的CPA膜电位实验总结。此外，在微电极实验中，CPA暴露后会出现ChTX。随后暴露于60 mM KCl使内皮细胞膜电位去极化至−20±2 mV。n个微电极和穿孔补片记录分别为6和4。(B类) (一)ChTX（300 nM；黑条）使内皮细胞膜电位去极化，随后添加CPA（10μM；白条）没有影响。(b条)对ChTX和CPA的微电极实验进行了总结。随后暴露于60 mM KCl使内皮细胞膜电位去极化至−22±2 mV(n个= 5; *, P<0.05）。所有微电极实验均在帕西林（500 nM）和尼群地平（100 nM）存在下进行。(C类) (一和b条)K免疫染色_钙显示IEL级别的3.1（红色）（绿色）。(c（c）)叠加后的图像显示出明显的K密度_钙3.1 IEL孔内和周围。（比例尺，5μm）(d日)沿z（z）轴（3.1μm）显示K的密度_钙3.1-穿过IEL深度的正荧光（白色）（绿色）。（比例尺，1μm）

讨论

我们的结果支持IP的概念_三R信号结构与内皮-SM细胞间通讯的功能密切相关(图6). 血管内皮细胞通过与SM细胞接触的IEL发送投射物，这一过程让人联想到神经元向靶细胞的投射。知识产权_三定位于这些膜突起的Rs介导局部Ca²⁺释放事件（脉冲星），建立钙的机制²⁺-内皮细胞向SM细胞发出依赖性信号。钙脉冲星的一个目标似乎是K_钙3.1与内皮投影共定位的通道(图5C类) (11). 内皮细胞K的激活_钙3.1通道（和K_钙2.3通道）是各种EDHF机制的共同分母，这些机制将内皮细胞的扩张影响传递给SM(三). 这些机制中最突出的是通过肌内皮缝隙连接的直接电通讯和释放的钾离子直接激活SM上内向整流钾通道(图6) (2,三,23). 因此，最小细胞间功能单元可能由内皮细胞IP组成_三卢比，K_钙3.1通道、间隙连接形成连接蛋白、内向整流钾通道（Kir2.1）和电压依赖性钙通道（Ca_v（v）1.2）在SM上(图6). 其他内皮钙依赖过程（如内皮一氧化氮合酶和磷脂酶A₂)也可能被钙脉冲星激活或被其他钙信号（全球钙²⁺或波浪）。我们建议Ca²⁺脉冲星是一种基本的内皮细胞钙²⁺其活性受到调节细胞内IP水平的生理因子（即激动剂和流量）精细调节的信号_三和钙²⁺鉴于其独特的、局限于血管SM接触点的定位，内皮细胞Ca²⁺脉冲星可能编码多种双向内皮-SM信号(4,13). 因此，该IP的中断_三R信号传导过程可能是几乎所有心血管疾病中观察到的内皮功能障碍的标志。

在单独的窗口中打开

图6。

内皮细胞钙模型²⁺脉冲星。知识产权_三R-密集内质网存储跟随内皮细胞膜的一部分，这些内皮细胞膜通过IEL中的孔外翻，并与下面的SM细胞膜接触。重复局部Ca²⁺事件（脉冲星）起源于这些深Ca²⁺区域性分隔到肌内皮连接处和内皮细胞基底的存储。这些持续的动态Ca²⁺信号由本构IP驱动_三其产生和本质上取决于内皮细胞刺激的水平。左侧细节描绘了通过IEL的单个内皮投影。K_钙3.1内皮突起的质膜中的通道与钙非常接近²⁺脉冲星，激发持续钙²⁺-肌内皮连接处膜电位的依赖性超极化。正确的细节说明了内皮细胞对肌内皮相互作用部位SM膜电位的影响，其中Ca²⁺脉冲星会激活K_钙3.1通道和超极化内皮膜。这种超极化可以通过间隙连接通道或通过激活SM K传输到SM_红外K频道⁺内皮K释放的离子_钙3.1通道。膜超极化通过降低电压依赖性钙通道开放概率来促进SM的弛豫。

方法总结

补充材料

致谢。

脚注

工具书类